兩種亞菊屬植物揮發(fā)油及其主要成分對馬鈴薯腐爛莖線蟲的觸殺活性

解子儀，逯佩玉，寧安琪，劉芯瑩，王俊龍，張 繼，梁俊玉

（西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730070）

馬鈴薯腐爛莖線蟲Ditylenchusdestructor屬于莖線蟲屬Ditylenchus[1]，是一種植物寄生線蟲，寄主分布廣泛，已報(bào)道的植物寄主多達(dá)90多種，可侵染包括當(dāng)歸Angelicasinensis、黨參Codonopsispilosula在內(nèi)的多種根莖入藥的植物，嚴(yán)重影響受害中藥材品質(zhì)與產(chǎn)量[2,3]。近年來，隨著當(dāng)歸等大宗中藥材種植面積的擴(kuò)大，尤其道地產(chǎn)區(qū)長期、高密度種植，造成線蟲蟲源積累，病害發(fā)生率逐年上升。藥用植物線蟲病害問題的日益突出，嚴(yán)重制約我國中藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[4-6]。

20世紀(jì)至今，對線蟲的防控和治理主要依賴于化學(xué)合成殺蟲劑，其長期的使用不僅導(dǎo)致線蟲耐藥性增強(qiáng)，而且化學(xué)制劑的殘留對環(huán)境造成嚴(yán)重污染[7,8]。相對而言，植物揮發(fā)油因其具有低殘留、無污染的特性，有望作為新型殺蟲劑[9]。目前，植物揮發(fā)油在殺蟲方面的研究較多[10]，如山奈Kaempferiagalangarhizome揮發(fā)油對線蟲的觸殺活性（LC50）為 0.092 mg/mL[11]；雞骨柴Elsholtziafruticosa揮發(fā)油對線蟲的觸殺活性（LC50）為 0.16 mg/mL[12]；野花椒Zanthoxylumsimulans揮發(fā)油對線蟲的觸殺活性（LC50）為 3.98 mg/mL[13]。然而，亞菊屬植物揮發(fā)油對于綠色防控馬鈴薯腐爛莖線蟲的研究相對較少，且亞菊屬部分植物的揮發(fā)油已被報(bào)道具有明顯觸殺馬鈴薯腐爛莖線蟲的活性，如鋪散亞菊Ajaniakhartensis（LC50/24h＝3.83mg/mL、LC50/48h＝3.75 mg/mL 和 LC50/72h＝3.40 mg/mL）[14]；川甘亞菊Ajaniapotaninii（LC50＝0.27 mg/mL）和灌木亞菊Ajaniafruticulosa（LC50＝0.17 mg/mL）[15]，因此，亞菊屬的植物揮發(fā)油在開發(fā)綠色殺蟲劑方面具有較大潛力。

本試驗(yàn)中的絲裂亞菊和光苞亞菊均為我國特有植物，廣泛分布于西北地區(qū)，作為亞菊屬植物，含有大量揮發(fā)油，揮發(fā)油中多含有萜類、黃酮等成分，具有抗原蟲、抗真菌、殺蟲等藥理作用[16-17]，其中絲裂亞菊揮發(fā)油被證實(shí)具有抗氧化和抗腫瘤活性[18]。目前關(guān)于絲裂亞菊和光苞亞菊揮發(fā)油對馬鈴薯莖線蟲的觸殺作用尚未報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室在前期的研究報(bào)道中，發(fā)現(xiàn)絲裂亞菊Ajanianematoloba揮發(fā)油中的主要成分為β-蒎烯（34.72%）、桉葉油醇（24.97%）和馬鞭草烯醇（20.39%），光苞亞菊Ajanianitida揮發(fā)油中主要成分為樟腦（20.76%）、側(cè)柏酮（18.64%）、桉葉油醇（13.42%）和馬鞭草烯醇（5.26%）。同時(shí)，以上兩種揮發(fā)油對防治倉儲害蟲赤擬古盜Triboliumcastaneum和煙草甲Lasiodermaserricorne具有較好的觸殺作用[19]。本研究以絲裂亞菊和光苞亞菊的揮發(fā)油及其中共有單體成分為試驗(yàn)材料，測試兩種植物揮發(fā)油及其主要組分（桉葉油醇和馬鞭草烯醇），以及兩種主要組分混配溶液分別對馬鈴薯腐爛莖線蟲的觸殺活性試驗(yàn)，為植物揮發(fā)油綠色防控馬鈴薯腐爛莖線蟲提供基礎(chǔ)研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

絲裂亞菊的地上部分全葉采集于甘肅省蘭州市（35°55′53′′ N，102°54′04′′ E，海拔 2155 m），光苞亞菊的地上部分全葉采集于甘肅省榆中縣（35°78′34′′ N，103°93′79′′ E，海拔 2200 m），兩種植物由北京師范大學(xué)劉全儒教授鑒定；患麻口病的當(dāng)歸（用于收集馬鈴薯腐爛莖線蟲）采集于甘肅省岷縣。

正己烷、二甲基亞砜、吐溫-20、桉葉油醇、馬鞭草烯醇（購自煙臺市雙雙化工有限公司）；克百威（購自上海農(nóng)藥研究所，純度98.4%）；含灰葡萄孢菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基；96孔細(xì)胞板。

1.2 揮發(fā)油提取

參照實(shí)驗(yàn)室前期研究[19]，分別將兩種植物的鮮葉風(fēng)干、陰干、粉碎、稱量500 g，放入圓底燒瓶中，加入1500 mL蒸餾水，電熱套加熱6～8 h后，得揮發(fā)油粗品。加正己烷萃取，再用無水硫酸鈉干燥處理，即得揮發(fā)油。將提取得到的兩種揮發(fā)油分別密封放置于4 ℃的冰箱保存。

1.3 馬鈴薯腐爛莖線蟲的培養(yǎng)

參考相關(guān)文獻(xiàn)[14,20,21]，采用貝曼漏斗法從患麻口病的當(dāng)歸中分離線蟲400～500條，用0.5%的次氯酸鈉消毒。然后離心，棄去上層的消毒液，加入無菌水振搖，再離心，棄去無菌水，重復(fù)處理3次，得到無菌的線蟲懸浮液約2 mL，接到長滿灰葡萄孢菌菌落的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上。于溫度25 ℃，濕度80%～90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 d，即得大量馬鈴薯腐爛莖線蟲懸浮液，備用。

1.4 殺線蟲活性測定

參考相關(guān)文獻(xiàn)[22,23]，將絲裂亞菊和光苞亞菊的揮發(fā)油及其主要共有成分（桉葉油醇、馬鞭草烯醇）分別用5%吐溫-20、3%二甲基亞砜（DMSO）和蒸餾水分別稀釋成濃度為2%、1%、0.5%、0.25%、0.125%的溶液。將10 μL馬鈴薯腐爛莖線蟲懸浮液（約含100～150條線蟲）及90 μL不同濃度的樣品溶液，置于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，混合均勻后置于25 ℃的培養(yǎng)箱中，每組各重復(fù)處理5次。等體積的5%吐溫-20和3%二甲基亞砜為陰性對照，克百威為陽性對照。在處理24 h和48 h后，分別檢查和記錄各組線蟲死亡與存活情況，用IBMSPSSV.20.0軟件計(jì)算致死中濃度 LC50。

1.5 桉葉油醇和馬鞭草烯醇混配后對馬鈴薯腐爛莖線蟲的觸殺活性測定

參考相關(guān)文獻(xiàn)類似方法[24]，假設(shè)經(jīng)毒力測定A、B兩單劑的致死中濃度分別為a和b，利用共毒因子法評價(jià)A＋B混劑的毒力指數(shù)，將A、B兩單劑按一定體積比（1:7，2:6，3:5，4:4，5:3，6:2，7:1）進(jìn)行混合，即為不同濃度的揮發(fā)油測試樣品。協(xié)同效應(yīng)的測定采用共毒法聯(lián)合毒性評價(jià)[25]，評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)以CTC值＞120為增效作用，CTC值＜80為拮抗作用，80≤CTC值≤120為相加作用，其中：實(shí)測混用毒力指數(shù)（ATI）＝標(biāo)準(zhǔn)藥劑LC50/供試藥劑（混用）LC50×100；理論混用毒力指數(shù)（TTI）＝A的毒力指數(shù)×A在混用中的含量（%）＋B的毒力指數(shù)×B在混用中的含量（%）；共用系數(shù)（CTC）＝實(shí)測混用的毒力指數(shù)（ATI）/理論混用的毒力指數(shù)（TTI）×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)油對馬鈴薯腐爛莖線蟲的觸殺活性

處理24 h后，絲裂亞菊和光苞亞菊揮發(fā)油及陽性對照克百威對馬鈴薯腐爛莖線蟲的觸殺活性數(shù)據(jù)如表1所示。結(jié)果表明兩種亞菊屬植物揮發(fā)油對馬鈴薯腐爛莖線蟲均具有一定觸殺作用，絲裂亞菊和光苞亞菊揮發(fā)油對馬鈴薯腐爛莖線蟲的致死中濃度（LC50/24h）分別為1.50 mg/mL和1.23 mg/mL，低于陽性對照組克百威（LC50/24h＝0.01 mg/mL）的殺線活性。

表1 絲裂亞菊和光苞亞菊揮發(fā)油對馬鈴薯腐爛莖線蟲的觸殺活性（24 h）Table 1 Nematicidal activity of essential oils from A.nematoloba and A.nitida against D.destructor after 24 hours

處理48 h后，絲裂亞菊揮發(fā)油、光苞亞菊揮發(fā)油及陽性對照克百威對馬鈴薯腐爛莖線蟲觸殺活性數(shù)據(jù)如表2所示。結(jié)果表明絲裂亞菊和光苞亞菊的致死中濃度（LC50/48h）分別為1.06 mg/mL和0.70 mg/mL。兩種揮發(fā)油對線蟲的觸殺活性雖低于陽性對照克百威（LC50/48h＝0.01 mg/mL），但較處理24 h后的數(shù)據(jù)相比，兩種揮發(fā)油的殺線蟲活性均有所增強(qiáng)；其中，光苞亞菊揮發(fā)油的致死中濃度減小近1倍。

表2 絲裂亞菊和光苞亞菊揮發(fā)油對馬鈴薯腐爛莖線蟲的觸殺活性（48 h）Table 2 Nematicidal activity of essential oils from A.nematoloba and A.nitida against D.destructor after 48 hours

2.2 桉葉油醇與馬鞭草烯醇對馬鈴薯腐爛莖線蟲的觸殺活性

桉葉油醇與馬鞭草烯醇均為絲裂亞菊和光苞亞菊揮發(fā)油中共有的主要成分（含量＞5%），二者對馬鈴薯腐爛莖線蟲的觸殺活性數(shù)據(jù)如表3所示。結(jié)果表明，二者對馬鈴薯腐爛莖線蟲均有不同程度的觸殺活性，且觸殺活性均強(qiáng)于揮發(fā)油（揮發(fā)油數(shù)據(jù)見表1和2），說明揮發(fā)油中兩種主要成分對線蟲的觸殺作用更強(qiáng)。在兩種單體成分中，桉葉油醇的殺線蟲活性（LC50＝0.49 mg/mL)強(qiáng)于馬鞭草烯醇（LC50＝1.09 mg/mL)，由此推斷揮發(fā)油殺線蟲活性可能與其他主要成分相互影響。在后續(xù)試驗(yàn)中，選擇活性較強(qiáng)的桉葉油醇和馬鞭草烯醇進(jìn)行不同比例混配測試其觸殺線蟲活性，深入分析它們之間的協(xié)同關(guān)系。

表3 桉葉油醇和馬鞭草烯醇對馬鈴薯腐爛莖線蟲的觸殺活性（含量＞5%）Table 3 Nematicidal activity of eucalyptus and verbenol against D.destructor

2.3 桉葉油醇和馬鞭草烯醇混合物對馬鈴薯腐爛莖線蟲的觸殺活性

桉葉油醇和馬鞭草烯醇混合物對馬鈴薯腐爛莖線蟲的觸殺活性及共毒系數(shù)（CTC）如表4所示：當(dāng)桉葉油醇和馬鞭草烯醇兩種化合物以不同比例配比后，對馬鈴薯腐爛莖線蟲的毒殺活性均增強(qiáng)。七組數(shù)據(jù)的共毒系數(shù)（CTC）均大于120，表現(xiàn)出明顯協(xié)同作用。其中，桉葉油醇和馬鞭草烯醇以2:6、4:4和3:5的體積比混配后，協(xié)同效果最明顯，其CTC分別達(dá)到463.67、397.68和373.53，遠(yuǎn)大于120；其LC50分別為0.18、0.17和0.20 mg/mL，小于桉葉油醇和馬鞭草烯醇單獨(dú)作用時(shí)的LC50（0.49和1.09 mg/mL）。此外，兩種化合物的其他配比也表現(xiàn)出協(xié)同增效作用，說明這兩種化合物能夠以較少劑量混配。

表4 桉葉油醇和馬鞭草烯醇混合物對馬鈴薯腐爛莖線蟲的觸殺活性及共毒系數(shù)（CTC）Table 4 Nematicidal activity and CTC of eucalyptol and verbenone mixture against D.destructor

3 討論

目前國內(nèi)外關(guān)于植物源殺線劑的研究多停留在試驗(yàn)階段，主要包括尋找并篩選具有殺線蟲活性的植物資源，利用植物提取物、揮發(fā)油以及其他活性物質(zhì)殺滅線蟲或抑制蟲卵孵化，為植物源殺線劑的開發(fā)與利用奠定基礎(chǔ)[26]。郭霞等[27]測試瑞香狼毒根的乙酸乙酯提取物對馬鈴薯腐爛莖線蟲的毒殺活性較強(qiáng)，24 h處理后校正死亡率為69%，48 h處理可達(dá)到80%。張?zhí)熘萚28]從山奈根提取物中分離得到兩種天然化合物肉桂酸乙酯和甲氧基肉桂酸乙酯，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其對馬鈴薯腐爛莖線蟲具有很強(qiáng)的觸殺活性，其LC50分別為43.21和10.09 mg/L。對植物揮發(fā)油殺線蟲活性的文獻(xiàn)主要集中于根結(jié)線蟲的報(bào)道上，關(guān)于植物揮發(fā)油及其組分抑制馬鈴薯腐爛莖線蟲的文獻(xiàn)報(bào)道較少。目前只有菊科亞菊屬植物鋪散亞菊的揮發(fā)油被證明對馬鈴薯腐爛莖線蟲具有較強(qiáng)毒殺作用，其作用24 h、48 h后的LC50分別為3.83 mg/mL、3.75 mg/mL[14]。而本試驗(yàn)中絲裂亞菊和光苞亞菊揮發(fā)油對馬鈴薯腐爛莖線蟲作用24 h、48 h后的觸殺效果均強(qiáng)于鋪散亞菊揮發(fā)油；且隨著作用時(shí)間延長，兩種植物揮發(fā)油對馬鈴薯腐爛莖線蟲的觸殺活性增強(qiáng)，二者之間增效機(jī)理需在后續(xù)相關(guān)試驗(yàn)中繼續(xù)研究。

此外，不同種類的植物源活性物質(zhì)之間存在相互作用關(guān)系，它們可能協(xié)同作用于靶標(biāo)生物，從而放大其生物學(xué)效應(yīng)[29]。將植物揮發(fā)油，以及具有殺線活性的植物源化合物按一定比例混合后，對靶標(biāo)線蟲的殺滅活性明顯增強(qiáng)。楊秀娟等[30]發(fā)現(xiàn)合歡和萬壽菊的水提液與淡紫擬青霉混合后，可協(xié)同作用于根結(jié)線蟲；另外，Ntalli等[29]將部分萜類化合物按其半數(shù)致死濃度1:1混合，觀察混合藥劑對南方根結(jié)線蟲的觸殺活性，結(jié)果顯示，香芹酮＋茴香腦、香葉醇＋茴香腦、香葉醇＋香芹酚等混合藥劑對南方根結(jié)線蟲的觸殺作用均顯示出協(xié)同效應(yīng)。由于目前亞菊屬植物揮發(fā)油觸殺馬鈴薯腐爛莖線蟲的活性研究相對較少，對揮發(fā)油中起到觸殺作用的單體物質(zhì)的混配還未深入研究。而按照植物源混配對根結(jié)線蟲的高生物活性，亞菊屬揮發(fā)油中單體成分混配對馬鈴薯腐爛莖線蟲的防治具有一定潛力。

因此，本試驗(yàn)以兩種揮發(fā)油中的主要共有成分桉葉油醇和馬鞭草烯醇為材料，其中桉葉油醇具有抑制病原體合成的藥理活性以及天然殺蟲的作用[31]，馬鞭草烯醇對橡膠小蠹蟲具較好粘捕效果[32]，對天山重齒小蠹具明顯引誘作用[33]。因桉葉油醇與馬鞭草烯醇均屬單萜類化合物[34]，該類化合物是植物抵御天敵的良好阻食劑，如昆蟲和植食動物侵食過程中，直接產(chǎn)生阻食、毒害作用，以及降低線蟲孵化率的作用[35,36]。本次研究發(fā)現(xiàn)桉葉油醇和馬鞭草烯醇以2:6、4:4和3:5的體積比混配后，協(xié)同增效作用明顯，其LC50（0.18、0.17和0.20 mg/mL）小于桉葉油醇和馬鞭草烯醇單獨(dú)作用時(shí)的LC50。為尋找揮發(fā)油中桉葉油醇與馬鞭草烯醇的含量接近于以上比例的植物源殺蟲劑，提出研究線索。

綜上所述，絲裂亞菊和光苞亞菊揮發(fā)油及其主要單體成分對馬鈴薯腐爛莖線蟲有一定的毒力作用。揮發(fā)油因具有可降解、低毒性、污染小的特性，對于開發(fā)綠色環(huán)保的殺蟲劑，具有一定的研究價(jià)值。因此，將絲裂亞菊和光苞亞菊的揮發(fā)油及其主要成分開發(fā)為新型的植物源殺蟲劑，防治馬鈴薯腐爛莖線蟲，具有實(shí)際意義。