桉葉油對體外培養(yǎng)人絨毛膜細(xì)胞增殖的影響

向 濤，李小燕，余永莉，程 秦，許本宏，張亞玲，李嘯紅

(1珠海市金灣區(qū)計劃生育服務(wù)站，廣東珠海519041;2遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū))

桉樹在我國西南部和南部種植廣泛、資源豐富，是民間常用的中草藥。桉葉油(Eucalyptus)是自桉葉中提取的具有揮發(fā)性的物質(zhì)，主要化學(xué)成分是萜類、萜醇、醚、酮類和酯等含氧化合物，其藥理作用包括抗菌［1～3］、抗氧化［4～7］、抗炎［8，9］、促滲［10，11］、殺蟲驅(qū)蚊［12～15］及防腐。研究顯示，無明顯細(xì)胞毒性作用劑量的桉葉油可影響乳腺癌細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞孕激素受體表達(dá)，但其機理文獻(xiàn)鮮見相關(guān)報道。本研究觀察了桉葉油對體外培養(yǎng)人絨毛膜細(xì)胞增殖的影響，旨在為其在食品添加及藥品開發(fā)中的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料 健康婦女孕6～8周新鮮人工流產(chǎn)的絨毛組織，實驗時用0．25%胰酶消化，200目篩網(wǎng)過濾后離心收集細(xì)胞，加入適量含有20%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液備用;桉葉油(桉葉素99．5%)購自德信行(珠海)香精香料有限公司，批號H071126。

1．2 人絨毛膜細(xì)胞分組及處理 取上述人絨毛膜細(xì)胞隨機分為對照組和桉葉油組，均用含有20%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋后接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，其中桉葉油組加入不同質(zhì)量濃度的桉葉油，使終質(zhì)量濃度分別為 0．75、0．15、0．015、0．001 5 mg/mL;對照組加入70%乙醇10μL/mL。

1．3 人絨毛膜細(xì)胞增殖情況測定 采用臺盼藍(lán)染色，每12 h計數(shù)一次活細(xì)胞，連續(xù)計數(shù)48 h，繪制細(xì)胞生長曲線;桉葉油處理后12、24、36 h以MTT法測定細(xì)胞增殖抑制率，12、24 h時同時以流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期和凋亡情況。

1．4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS15．0統(tǒng)計軟件。計量數(shù)據(jù)以±s表示，兩均數(shù)比較行t檢驗。P≤0．05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 桉葉油對人絨毛膜游離細(xì)胞生長的影響 隨培養(yǎng)時間延長，兩組人絨毛膜細(xì)胞數(shù)量均逐漸減少，其中0．75 mg/mL桉葉油組人絨毛膜細(xì)胞生長明顯受抑，與對照組相比P＜0．05;其余桉葉油各組對絨毛膜細(xì)胞生長的影響與對照組相比，P＞0．05(見圖1)。

圖1 桉葉油對人絨毛膜細(xì)胞生長的影響

2．2 桉葉油對人絨毛膜細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)0．75 mg/mL桉葉油組人絨毛膜細(xì)胞增殖抑制率與對照組相比 P ＜ 0．05;0．15、0．015、0．001 5 mg/mL桉葉油組人絨毛膜細(xì)胞增殖抑制率與對照組相比P＞0．05。詳見表 1。

表1 兩組人絨毛膜細(xì)胞增殖抑制率比較(%±s)

表1 兩組人絨毛膜細(xì)胞增殖抑制率比較(%±s)

注:與同時間對照組比較，*P＜0．05

組別 細(xì)胞增殖抑制率12 h 24 h 36 h桉葉油組0．0015 mg/mL 4．31 ±11．51 －5．83 ±10．58 4．73 ± 8．31 0．015 mg/mL －2．99 ±10．10 －7．06 ± 9．64 4．41 ± 8．00 0．15 mg/mL 9．15 ±14．61 10．42 ±11．38 7．10 ±11．10 0．75 mg/mL 53．49 ±11．89* 78．50 ±18．43*95．55 ± 3．54*對照組8．65 ± 3．24 7．33 ± 7．21 6．24 ± 4．35

2．3 桉葉油對人絨毛膜細(xì)胞周期及凋亡率的影響

桉葉油作用12 h后，0．75 mg/mL桉葉油組G0～G1期細(xì)胞減少、S期細(xì)胞增多、G2～M期細(xì)胞減少、凋亡率明顯增高，與對照組相比，P＜0．05;0．15、0．015、0．001 5 mg/mL 桉葉油組 G0～G1期、G2～M期細(xì)胞比例與對照組相比P＜0．05，S期細(xì)胞比例及凋亡率與對照組相比P＞0．05(詳見表2)。桉葉油作用24 h后，0．75 mg/mL桉葉油組G0～G1期細(xì)胞比例減少、S期細(xì)胞比例減少、G2～M期細(xì)胞比例增多、凋亡率升高，與對照組相比P＜0．05;與對照組相比，0．15、0．015、0．001 5 mg/mL 桉葉油組 S 期細(xì)胞比例均顯著升高(P均＜0．05)，G2～M期細(xì)胞比例及凋亡率均無明顯變化(P均＞0．05)，詳見表3。

表2 實驗12 h兩組人絨毛膜細(xì)胞的細(xì)胞周期及凋亡率比較(%ˉ ±s)

表2 實驗12 h兩組人絨毛膜細(xì)胞的細(xì)胞周期及凋亡率比較(%ˉ ±s)

注:與對照組比較，*P ＜0．05

組別 G0～G1 S G2～M 凋亡率桉葉油組0．001 5 mg/mL 55．23 ±1．84* 31．64 ±4．19 8．09 ±2．94* 26．71 ±5．61 0．015 mg/mL 57．32 ±1．58* 27．26 ±0．83 15．96 ±1．86* 26．70 ±1．65 0．15 mg/mL 49．23 ±1．95* 27．19 ±2．18 23．44 ±2．83* 23．27 ±1．07 0．75 mg/mL 19．79 ±1．52* 63．58 ±1．66*16．50 ±1．84* 33．60 ±1．74*對照組 41．28 ±1．48 29．52 ±1．97 28．99 ±1．92 25．43 ±1．94

表3 實驗24 h兩組人絨毛膜細(xì)胞的細(xì)胞周期及凋亡率比較(% ±s)

表3 實驗24 h兩組人絨毛膜細(xì)胞的細(xì)胞周期及凋亡率比較(% ±s)

注:與對照組比較，*P ＜0．05

組別 G0～G1 S G2～M 凋亡率桉葉油組0．001 5 mg/mL29．32 ±11．06* 50．70 ±2．46* 30．92 ±1．16 17．59 ±1．36 0．015 mg/mL 43．43 ±1．11* 38．73 ±2．05* 22．97 ±3．84 17．80 ±2．47 0．15 mg/mL 30．73 ±4．01* 38．09 ±2．18* 31．24 ±1．04 13．63 ±1．59 0．75 mg/mL 23．39 ±2．16* 28．77 ±1．54* 47．50 ±2．35* 57．14 ±2．28*對照組 58．48 ±1．43 13．08 ±1．99 28．57 ±0．92 13．45 ±2．36

3 討論

目前，桉葉油已成為醫(yī)藥、香料和化學(xué)工業(yè)的重要原料及常用食品添加劑，尤其廣泛用于皮膚用藥制劑中。但我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，桉葉油400 mg/kg對小鼠無遺傳毒性，可降低環(huán)磷酰胺誘發(fā)的小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率和精子畸形率;300 mg/kg的桉葉油對大鼠無胚胎毒性，對環(huán)磷酰胺誘發(fā)的胚胎畸形有拮抗作用，對孕鼠血清雌孕激素水平有一定影響［16］。

在胚胎發(fā)育過程中，絨毛膜細(xì)胞的生長狀況和分泌活動起至關(guān)重要的作用。為進(jìn)一步探討上述現(xiàn)象發(fā)生的機制，本研究觀察了桉葉油對體外培養(yǎng)的人絨毛膜細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示:①隨培養(yǎng)時間延長，兩組人絨毛膜細(xì)胞數(shù)量均逐漸減少，其中0．75 mg/mL桉葉油組人絨毛膜細(xì)胞生長明顯受抑，與對照組相比有顯著差異;其余桉葉油各組絨毛膜細(xì)胞生長情況與對照組相比無顯著差異。②0．75 mg/mL桉葉油組人絨毛膜細(xì)胞增殖抑制率顯著高于對照組，其余桉葉油各組人絨毛膜細(xì)胞增殖抑制率與對照組相比無顯著差異。③桉葉油作用12 h后，0．75 mg/mL桉葉油組G0～G1期細(xì)胞減少、S期細(xì)胞增多、G2～M期細(xì)胞減少、凋亡率明顯增高，與對照組相比有顯著差異;其余桉葉油各組G0～G1期、G2～M期細(xì)胞比例與對照組相比有顯著差異，S期細(xì)胞比例及凋亡率無顯著差異。桉葉油作用24 h后，與對照組相比，0．75 mg/mL桉葉油組G0～G1期細(xì)胞比例減少、S期細(xì)胞比例減少、G2～M期細(xì)胞比例增多、凋亡率升高;其余桉葉油各組S期細(xì)胞比例均顯著升高，G2～M期細(xì)胞比例及凋亡率均無明顯變化。提示0．75 mg/mL桉葉油對絨毛膜細(xì)胞生長有明顯抑制作用和細(xì)胞毒作用，可顯著影響絨毛膜細(xì)胞周期、誘導(dǎo)絨毛膜細(xì)胞凋亡;而 0．15、0．015、0．001 5 mg/mL桉葉油對絨毛膜細(xì)胞生長無明顯抑制作用和細(xì)胞毒作用，也無誘導(dǎo)絨毛膜細(xì)胞凋亡的作用，但對絨毛膜細(xì)胞的細(xì)胞周期有影響。上述結(jié)果證實，美國食品香料制造協(xié)會(FEMA)規(guī)定的桉葉油在食品中的最高參考量劑量范圍是安全的;無毒副作用劑量范圍內(nèi)桉葉油對絨毛膜細(xì)胞的生長有影響，此影響可能是通過影響細(xì)胞周期來實現(xiàn)，但影響細(xì)胞周期的具體機理及對絨毛膜細(xì)胞的分泌功能有無影響均有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，質(zhì)量濃度≤0．15 mg/mL的桉葉油對人絨毛膜細(xì)胞無明顯生長抑制、細(xì)胞毒性及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，但可影響細(xì)胞周期，且此影響可能隨作用時間不同而異;此為桉葉油在食品添加及藥物開發(fā)中的應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。

［1］Ramezani H，Singh HP，Batish DR，et al．Antifungal activity of the volatile oil of Eucalyptus citriodora［J］．Fitoterapia，2002，73(3):26-262．

［2］Burt S．Essential oils:their antibacterial properties and potential applications in foods--a review［J］．Int J Food Microbiol，2004，94(3):223-253．

［3］Cimanga K，Kambu K，Tona L，et al．Correlation between chemical composition and antibacterial activity of essential oils of some aromatic medicinal plants growing in the Democratic Republic of Congo［J］．JEthnopharmacol，2002，79(2):213-220．

［4］Grassmann J，Hippeli S，Dornisch K．Antioxidant properties of essential oils．Possible explanations for their anti-inflammatory effects［J］．Arzneimittelforschung，2000，50(2):135-139．

［5］Silva J，Abebe W，Sousa SM，et al．Analgesic and anti-inflammatory effects of essentialoils of Eucalyptus［J］．J Ethnopharmacol，2003，89(2-3):277-283．

［6］El-Ghorab AH，El-Massry KF，Marx F，et al．Antioxidant activity of Egyptian Eucalyptus camaldulensis var．brevirostris leaf extracts［J］．Nahrung，2003，47(1):41-45．

［7］DessíMA，Deiana M，Rosa A，et al．Antioxidant activity of extracts from plants growing in Sardinia［J］．Phytother Res，2001，15(6):511-518．

［8］呂小琴，唐法娣，王硯．藍(lán)桉油對脂多糖引起的大支氣管炎及黏蛋白高分泌的影響［J］．中國中藥雜志，2004，29(2):168-171．

［9］宋立人．現(xiàn)代中藥大辭典［M］．北京:人民衛(wèi)生出版社，2001:1670．

［10］陳彩蓮，姚梅坤．桉葉油和氮酮促透作用比較［J］．武警醫(yī)學(xué)，2001，12(3):171-172．

［11］江川，黃玉芳，姚梅坤，等．桉葉油和氮酮對替硝唑凝膠劑體外透皮釋藥的研究［J］．海峽藥學(xué)，2003，15(1):18-19．

［12］李建華，周敏君，裘學(xué)麗．桉葉油霜對蠕形螨的療效觀察［J］．中國人獸共患病雜志，2001，17(3):98-99．

［13］嚴(yán)敖金，譚青安．桉葉精油對三種天牛的忌避效果［J］．南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，1998，22(1):87-90．

［14］趙亞娥，郭娜，李琛，等．桉葉油對兩種蠕形螨的體外殺蟲作用［J］．中國媒介生物學(xué)及控制雜志，2006，17(6):461-464．

［15］李建華，周敏君，郎書源，等．桉葉揮發(fā)油對幾種寄生蟲驅(qū)殺作用的研究［J］．貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2000，25(4):362-364．

［16］余永莉，王傳銅，馮國紋，等．桉葉油毒性及其對環(huán)磷酰胺致小鼠骨髓微核及精子畸形的保護(hù)作用［J］．中國藥理與毒理學(xué)，2010，24(6):529-532．

［17］余永莉，馮國紋．唐于川，等．桉葉油對環(huán)磷酰胺致大鼠胚胎毒性的保護(hù)作用［J］．中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2011，28(3):189-193．