土壤來源鏈霉菌Streptomyces sp.CPCC 203679的次生代謝產物研究

張冰源，湯 艷，郭 哲，柏菁璘，余利巖，戴勝軍，張德武*

1煙臺大學藥學院，煙臺 264005；2中國醫(yī)學科學院&北京協(xié)和醫(yī)學院 醫(yī)藥生物技術研究所，北京 100050

放線菌是發(fā)現(xiàn)新抗生素的重要資源，它可以產生結構類型多樣的活性天然產物[1]。鏈霉菌屬Streptomyces為放線菌的優(yōu)勢屬，是放線菌中已報道有效發(fā)表種最多的屬，其廣泛分布于土壤、淡水、海洋以及一些生物體內。鏈霉菌以能夠產生結構類型豐富多樣的活性次級代謝產物而著稱，是臨床常用抗生素的重要來源，目前臨床上應用的抗生素約三分之二是由該屬微生物產生[2]。近年來，從鏈霉菌屬中源源不斷的報道了大量的結構骨架新穎和生物活性顯著的次生代謝產物[3-6]，表明從該屬中發(fā)掘新的先導化合物仍具有巨大潛力。本課題組在前期生物活性篩選中發(fā)現(xiàn)了一株來源于土壤的鏈霉菌Streptomycessp.CPCC 203679，其發(fā)酵液粗提物具有良好的抗菌活性，本文采用多種現(xiàn)代色譜和波譜技術對該菌株的次生代謝產物進行了初步的分離純化和結構鑒定，得到了9個化合物(見圖1)，并對化合物1～8進行了體外抗菌活性和細胞毒活性評價。

圖1 化合物1～9的化學結構

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Bruker ARX-600 MHz核磁共振波譜儀(瑞士Bruker公司)；Thermo LTQ質譜儀(美國Themo公司)；Agilent 1290高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；Agilent 1100高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；Waters 2535制備液相色譜儀(美國Waters公司)；Combiflash Rf200快速純化制備液相色譜(美國Teledyne Isco公司)；步琦R210型旋轉蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)；ZSD-1160生化培養(yǎng)箱(上海智城分析儀器制造有限公司)；ZORBAX SB-C18分析型色譜柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；ZORBAX SB-C18半制備型色譜柱(250 mm × 10 mm，5 μm)；甲醇、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、正己烷、正丁醇、無水乙醇、色譜乙腈、色譜甲醇(北京通廣精細化工公司)；反相C18硅膠(日本YMC公司)；200～300目柱層析硅膠(青島海洋化工廠)。

1.2 菌株來源

菌株Streptomycessp.CPCC 203679分離自浙江省杭州西溪濕地的土壤，通過對其16S rRNA基因測序發(fā)現(xiàn)其序列與菌株StreptomycesrocheiNRRLB 2410(T)、StreptomycesenissocaesilisNRRLB-16365(T)、StreptomycesplicatusNBRC 13071(T)的序列相似度均為99.86%，該菌株現(xiàn)保藏于中國藥學微生物菌種保藏管理中心。

1.3 發(fā)酵培養(yǎng)

PYG培養(yǎng)基：蛋白胨3 g、酵母膏5 g、甘油10 g、瓊脂14 g、甜菜堿1.25 g、丙酮酸鈉1.25 g，加水定容至1 L。

種子及發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g、可溶性淀粉30 g、棉籽粉20 g、酵母膏3 g、(NH4)2SO43 g、MgSO41 g、K2HPO41 g、NaCl 1g、CaCO31 g，加水定容至1 L。

將菌株CPCC 203679從其保藏的甘油管中接種于PYG斜面培養(yǎng)基，置于28 ℃恒溫箱培養(yǎng)7～10天。選擇生長狀態(tài)良好的斜面繼續(xù)在相同斜面培養(yǎng)基中復壯，待其生長狀態(tài)良好時接種于種子培養(yǎng)基(100 mL培養(yǎng)基/500 mL三角瓶)中，28 ℃振蕩培養(yǎng)48 h得到種子液。然后以10%濃度(V/V)接入5 L三角瓶(含2 L發(fā)酵培養(yǎng)基)中，于28 ℃培養(yǎng)5天收獲。共發(fā)酵120 L。

1.4 提取分離

收集120 L發(fā)酵液，離心后分別收集菌體和發(fā)酵液上清。菌體用甲醇超聲提取三次，濃縮后得菌體甲醇提取部分，然后均勻分散于水中，用乙酸乙酯萃取四次，得菌絲乙酸乙酯部分；發(fā)酵液上清用大孔吸附樹脂HP-20吸附后，首先用去離子水沖洗，再用甲醇進行洗脫，減壓濃縮后得到發(fā)酵液上清部分，然后用乙酸乙酯萃取四次，得菌液乙酸乙酯部分。將菌絲和菌液的乙酸乙酯部分合并，濃縮后得浸膏33.7 g。

將所得浸膏(33.7 g)用60～100目硅膠拌樣，進一步進行正相硅膠柱(200～300目)層析，二氯甲烷-甲醇(100∶0→50∶50)梯度洗脫得15個流分(Fr.1～Fr.15)。流分Fr.4(10.8 g)經反相中壓制備柱層析，乙腈-水(10%→100%)梯度洗脫，得34個流分(Fr.4.1～Fr.4.34)；流分Fr.4.8(112.9 mg)經過半制備HPLC(乙腈-水，10∶90)純化，得到化合物4(9.2 mg)；流分Fr.4.10(204.6 mg)經過半制備HPLC(乙腈-水，10∶90)純化，得到化合物8(13.4 mg)；流分Fr.4.12(169.2 mg)經過半制備HPLC(乙腈-水，15∶85)純化，得到化合物7(6.7 mg)；流分Fr.4.15-16(248 mg)經過半制備HPLC(乙腈-水，15∶85)純化，得到化合物1(43.8 mg)；流分Fr.4.29(88.6 mg)經過半制備HPLC(乙腈-水，50∶50)純化，得到化合物9(5.5 mg)。流分Fr.5(2.2 g)經反相中壓制備柱層析，乙腈-水(10%→100%)梯度洗脫，得23個流分(Fr.5.1～Fr.5.23)；流分Fr.5.5(56.2 mg)經過半制備HPLC(乙腈-水，5∶95)純化，得到化合物2(18.9 mg)；流分Fr.5.6(179 mg)經過半制備HPLC(乙腈-水，5∶95)純化，得到化合物6(80.1 mg)；流分Fr.5.16(17.7 mg)經過半制備HPLC(乙腈-水，30∶70)純化，得到化合物3(2.9 mg)。流分Fr.10(0.97 g)經反相中壓制備柱層析，乙腈-水(10%→100%)梯度洗脫，得化合物5(7.1 mg)。

1.5 抗菌活性測試[7]

采用微稀釋法對所得到的化合物分別進行抗金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 29213)和大腸埃希菌(EscherichiacoliATCC 25922)體外活性測定：將測試菌從凍存管中劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板活化，37 ℃培養(yǎng)，挑取其中3～5個單菌落至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)6～8 h，將菌懸液調整至0.5 McF濃度(約為1 × 108CFU/mL)，再使用MHB液體培養(yǎng)基進行20倍稀釋，制成濃度約為5 × 106CFU/mL的菌懸液。在96孔板中，第1列不接種菌懸液僅加入MHB培養(yǎng)基作為空白對照。待測化合物使用MHB液體培養(yǎng)基根據二倍稀釋法稀釋至相應濃度后加入96孔板。第12列加入MHB培養(yǎng)基和菌懸液作為菌株陽性對照。樣品終濃度分別為：64、32、16、8、4、2、1、0.5 μg/mL，96孔板置于37 ℃靜置培養(yǎng)16～18 h后，未見菌株生長(肉眼未見渾濁)的孔板內所含化合物最小的濃度即為最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)。

1.6 細胞毒活性測試[8]

采用MTT法對所得到的化合物進行細胞毒活性測試。人胰腺癌細胞系(MIA PaCa-2)細胞株體外培養(yǎng)于DMEM培基(含10%胎牛血清)，在37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)；取等量細胞培養(yǎng)于96孔板中，24 h加藥，將培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件的 CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h后，每孔加入100 μL 1∶4倍稀釋的MTT溶液，37 ℃繼續(xù)孵育3.5～4 h，棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO充分溶解甲臜，輕度震蕩后，用酶標儀測定各孔490 nm條件下的吸光度，計算IC50值。

2 結果與分析

2.1 結構鑒定

根據HR-ESI-MS結果推測該化合物的分子式為C10H18O4。其13C NMR和DEPT譜顯示，該化合物有10個碳信號，包括1個酮羰基δC209.4(C-5)，1個酯羰基δC172.6(C-1)，2個次甲基δC64.0(C-3)和27.0(C-8)，4個亞甲基δC49.5(C-4)、42.3(C-2)、40.8(C-6)和31.8(C-7)，2個甲基δC22.3(C-9，C-10)。通過1H NMR、13C NMR、DEPT和HSQC等波譜數據對所有的H和C進行了歸屬。在HMBC譜中(見圖2)，H-3和C-1、C-2、C-4、C-5相關，H-6和C-5、C-7、C-8相關，H-7和C-5、C-6、C-8、C-9、C-10相關；在1H-1H COSY譜中顯示了H-2/H-3/H-4，H-6/H-7/H-8/H-9等相關信號。綜合以上譜圖信息，確定化合物1為3-羥基-8-甲基-5-氧壬酸，為新化合物，其結構如圖1所示?；衔锝Y構中僅含有一個叔醇(C-3)，可以通過Rh2(OCOCF3)4-絡合的CD譜來確定其絕對構型[9]，在Rh2(OCOCF3)4-絡合的CD譜中，350 nm處顯示正的Cotton效應，確定其C-3的絕對構型為S?；衔?的詳細結構鑒定數據原始圖譜可從本刊官網免費下載(www.trcw.ac.cn)。

圖2 化合物1的COSY和HMBC相關

化合物2白色粉末；可溶于甲醇、二氯甲烷、氯仿等溶劑；ESI-MS：m/z180[M+H]+；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：9.16(1H，s，9-OH)，7.85(1H，t，J=6.0 Hz，NH)，6.98(2H，d，J=8.4 Hz，H-7，H-11)，6.67(2H，d，J=8.4 Hz，H-8，H-10)，3.17(2H，m，H-4)，2.56(2H，t，J=7.8 Hz，H-5)，1.77(3H，s，H-1)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：22.6(C-1)，168.9(C-2)，40.5(C-4)，34.4(C-5)，129.5(C-6)，129.4(C-7)，115.1(C-8)，155.6(C-9)，115.1(C-10)，129.4(C-11)。以上數據與文獻[10]中報道一致，故確定該化合物為N-[2-(4-對羥基苯酚)乙基]乙酰胺。

表1 化合物1的1H NMR(600 MHz)和13C NMR(150 MHz)數據(DMSO-d6)

化合物9無色油狀；可溶于二氯甲烷、氯仿等溶劑；ESI-MS：m/z369[M+H]+；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：7.18(1H，dd，J=15.6，9.6 Hz，H-11)，6.27(1H，dd，J=21.6，9.6 Hz，H-10)，6.24(1H，m，H-9)，6.10(1H，d，J=15.6 Hz，H-12)，4.03(1H，dd，J=11.4，4.2 Hz，H-1′a)，3.89(1H，dd，J=11.4，6.6 Hz，H-1′b)，3.62(1H，m，H-2′)，3.34(1H，overlap，H-3′)，2.54(2H，t，J=7.2 Hz，H-14)，2.28(2H，t，J=7.2 Hz，H-2)，2.17(2H，m，H-8)，1.52～1.22(16H，m，H-3～H-7，H-15～H-17)，0.85(3H，t，J=7.2 Hz，H-18)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：172.9(C-1)，33.4(C-2)，24.4(C-3)，28.5(C-4)，28.4(C-5)，28.3(C-6)，28.1(C-7)，32.4(C-8)，145.3(C-9)，129.0(C-10)，142.7(C-11)，128.1(C-12)，200.2(C-13)，40.0(C-14)，23.5(C-15)，30.9(C-16)，21.9(C-17)，13.8(C-18)，65.5(C-1′)，69.3(C-2′)，62.6(C-3′)。以上數據與文獻[18]中報道一致，故確定該化合物為2,3-dihydroxypropyl(9E,11E)-13-oxooctadeca-9,11-dienoate。

2.2 活性結果

化合物9為長鏈不飽和脂肪酸類化合物，據已有文獻報道，脂肪酸類化合物在結構以及抗菌、抗腫瘤活性上無較大研究價值，故未對其進行活性測定。本文僅對分離得到的化合物1～8進行了抗金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 29213)和大腸埃希菌(EscherichiacoliATCC 25922)的體外活性測試(見表2)。結果表明，所有化合物對這兩株測試菌株均無明顯的抑制活性(MIC > 64 μg/mL)。采用MTT法評價了本實驗分離得到的化合物1～8對人胰腺癌細胞(MIA PaCa-2)增殖的影響，在50 μmol/L測試濃度下，所有化合物均未表現(xiàn)出明顯的活性(抑制率低于50%)。

表2 化合物1～8的抗菌和細胞毒活性評價

3 討論與結論

從土壤來源的鏈霉菌Streptomycessp.CPCC 203679的發(fā)酵物中分離得到了9個化合物，其結構類型包括脂肪酸、生物堿和環(huán)二肽等?；衔?為新的脂肪酸類化合物，化合物3為首次從土壤來源的鏈霉菌中分離得到。藥理活性評價結果顯示，化合物1～8未顯示明顯的抗菌和抗腫瘤活性。化合物2屬于生物堿類化合物，該化合物廣泛存在于放線菌、細菌、真菌等微生物中，如：Streptomyces[19]、Bacillus[20]、Aspergillus[21]、Alternaria[22]。化合物3屬于吲哚生物堿類化合物，于1965年首次被報道，該化合物在Bacillus、Balansia、Edwardsiella等屬中也有報道[12,23,24]。據文獻報道，化合物3具有防污染的作用，對紋藤壺的幼蟲具有一定的抑制作用，其ED50為18.6 μmol/L[25]。環(huán)二肽是自然界中最小的環(huán)肽，其廣泛存在于植物、動物以及微生物的代謝產物中，具有抗菌、抗腫瘤、神經保護、抗血栓等方面活性[26]。本研究并未分離得到具有明顯生物活性的次生代謝產物，可能是由于在當前的培養(yǎng)條件下，活性代謝產物的生物合成基因簇并沒有被激活，或是因為活性代謝產物的產量太低而沒有分離得到。后續(xù)我們將嘗試優(yōu)化培養(yǎng)條件來增加次生代謝產物的結構多樣性，并進一步結合抗菌活性評價，獲得結構新穎、活性顯著的次生代謝產物。