乙酰哈巴苷通過Wnt信號通路誘導(dǎo)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞凋亡

周 興，尹 倩，黃 蓉，簡 兵，蔡曉明

川北醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院創(chuàng)新實驗室，南充 637100

結(jié)腸癌(colon cancer)是世界第四大致命癌癥，屬于常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤[1,2]，遺傳、肥胖、缺乏鍛煉和吸煙等是患結(jié)腸癌的危險因素[3]。目前臨床上主要依靠手術(shù)治療結(jié)腸癌，由于結(jié)腸癌在早期不易發(fā)現(xiàn)，被確診時已錯過最佳手術(shù)時機，此時患者往往需要放化療來改善預(yù)后[4,5]。但傳統(tǒng)化療藥物不良反應(yīng)多，而天然藥物的不良反應(yīng)少，且更為廉價[6]。

筋骨草(AjugaciliataBunge.)是多年生唇形科草本植物，主要分布于中國河北、山東、陜西、甘肅、四川等地。筋骨草全草皆可入藥，在中國民間廣泛被用于治療肺熱咯血、跌打損傷、扁桃腺炎、咽喉炎等疾病，而筋骨草中乙酰哈巴苷(8-O-acetylharpagide，8-OA)的含量最高。根據(jù)You等[7]前期研究顯示，乙酰哈巴苷具有強大的抗炎作用，可以減輕毛細(xì)血管早期的炎性滲出，由于炎癥介質(zhì)本身可以在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，因此乙酰哈巴苷可能通過炎癥途徑發(fā)揮抗腫瘤作用，此外，Konoshima等[8]則發(fā)現(xiàn)乙酰哈巴苷對一氧化氮誘發(fā)的小鼠皮膚癌有明顯的抑制作用，并可抑制N-亞硝基二乙胺和苯巴比妥誘發(fā)的肝癌細(xì)胞增殖，表明乙酰哈巴苷可能是一種潛在的抗腫瘤藥物。

本研究旨在通過乙酰哈巴苷作用于結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞后的一系列生物學(xué)行為改變來探討乙酰哈巴苷在抗腫瘤方面所發(fā)揮的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及藥物

人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，培養(yǎng)條件為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2和95%濕度。乙酰哈巴苷(成都曼思特生物技術(shù)有限公司，純度≥97%，貨號：6926-14-3)，溶解于無菌PBS中配置成濃度為2.5 mol/L的儲存液。

1.1.2 試劑

DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶(美國HyClone公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；培養(yǎng)瓶、96孔板(美國Corning公司)；CCK8(上海東仁化學(xué)科技有限公司)；細(xì)胞凋亡試劑盒(中國碧云天公司)；Total RNA Extractor(上海生工生物公司)；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)；SYBR Green PCR Master Mix(北京索萊寶公司)；引物合成(上海生工生物公司)；XAV939(中國MCE公司)；兔抗人IgG一抗、羊抗兔IgG二抗(中國ProteTech公司)。

1.1.3 儀器設(shè)備

3111 CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)；SW-0J-1FD 超凈工作臺(中國安泰空氣技術(shù)有限公司)；AE 2000 倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；BCD-272WDGD-20 ℃冷凍冰箱(中國海爾公司)；EasyCyte6-2L流式細(xì)胞儀(美國Guava公司)；CFX connect熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)；5804R高速低溫離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司)；LUX5187139全波長酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；Chemidoc XRS+凝膠成像儀(美國BIO-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1 CCK8

收集HCT116細(xì)胞，離心計數(shù)后調(diào)整密度為1×105個/mL，每孔100 μL鋪入96孔板，待細(xì)胞貼壁，實驗組分7組，每組含乙酰哈巴苷的濃度分別為0.125、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5 mmol/L，對照組加入與實驗組等體積的PBS溶液，全程避光加樣，完成后放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h；第二天每孔加入10 μL CCK8試劑，用酶標(biāo)儀測定OD450值，計算抑制率。

1.2.2 平板克隆形成實驗

在6孔板中每孔加入HCT116細(xì)胞500個，每組3個復(fù)孔。實驗組以0.5 mmol/L乙酰哈巴苷處理，對照組加入與實驗組等體積的PBS溶液，在作用HCT116細(xì)胞7天后，吸掉培養(yǎng)基，PBS洗滌細(xì)胞3次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞5 min，再用PBS洗滌細(xì)胞3次。500 μL結(jié)晶紫染色細(xì)胞20 min，PBS洗滌后拍照記錄。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和凋亡

將細(xì)胞計數(shù)后調(diào)整密度為1×105個/mL，每孔2 mL鋪入6孔板，實驗孔藥物濃度為(0.25、0.5、0.75 mmol/L)，對照組加入與實驗組等體積的PBS溶液，培養(yǎng)48 h后收集培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞一次，加入胰酶消化2 min，加入之前收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用PBS重懸并計數(shù)，周期實驗加入1 mL冰浴70%乙醇，混勻后4 ℃固定24 h，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入1 mL PBS離心后棄上清，每管加0.5 mL碘化丙啶染料37 ℃避光孵育30 min；凋亡實驗取5×104個細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，再加入5 μL AnnexinV-FITC染色液，混勻，加入10 μL碘化丙啶染色液，混勻，室溫避光孵育10 min，置于冰上，立即用流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄組測序

將細(xì)胞計數(shù)后調(diào)整密度為1×105個/mL，每孔2 mL鋪入6孔板中培養(yǎng)，實驗組(B1、B2、B3)加入乙酰哈巴苷的終濃度為0.5 mmol/L，對照組(A1、A2、A3)加入與實驗組等體積的PBS溶液，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，用Trizol法提取總RNA，以Illumina HiseqTM測序平臺進(jìn)行測序分析。

1.2.5 乙酰哈巴苷對HCT116細(xì)胞mRNA表達(dá)的影響

將細(xì)胞計數(shù)后調(diào)整密度為1×105個/mL，每孔2 mL鋪入6孔板中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后棄原培養(yǎng)基，實驗組加入乙酰哈巴苷的終濃度分別為0.25、0.5 mmol/L，對照組加入與實驗組等體積的PBS溶液，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，用Trizol法提取總RNA，取1 μg總RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA，反應(yīng)體系為20 μL。先將RNA模板和Random primer加在一起，補充RNase-free ddH2O至12 μL，進(jìn)行熱變性(條件：65 ℃，5 min，冰上1 min)，再加入其他組分，在漩渦混合器上充分混勻，4 000 r/min，15 s離心；放入PCR擴增儀中，設(shè)置反應(yīng)程序：25 ℃ 5 min，42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min，冰上1 min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，模板稀釋20倍后進(jìn)行PCR擴增；體系：SYBR Mixture 12.5 μL，F(xiàn)-primer 1 μL，R-primer 1 μL，cDNA 5 μL，DDH2O 5.5 μL；PCR儀器設(shè)置為：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，共進(jìn)行40個循環(huán)。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.6 乙酰哈巴苷對HCT116細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

培養(yǎng)細(xì)胞方法和分組同“1.2.5”，48 h后收集細(xì)胞加入RIPA裂解液提取總蛋白。配置SDS-PAGE凝膠，100 V電泳2 h左右，直至Marker清晰分離開即可終止電泳，80 V轉(zhuǎn)膜1.5 h后將PVDF膜置于5%脫脂奶粉封閉液中，常溫封閉4 h，用TBST洗3次。在4 ℃冰箱中搖動孵育一抗過夜，用TBST在室溫下洗膜3次，室溫下振搖孵育二抗1 h，用TBST洗3次，用Bio-Rad凝膠成像儀顯影。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)處理

流式數(shù)據(jù)采用FlowJo 7.6分析，Western blot采用Image J對條帶光密度進(jìn)行定量，所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計分析處理，采用單因素方差分析，計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 乙酰哈巴苷對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖情況的影響

CCK8法檢測結(jié)果顯示，結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞的抑制率隨乙酰哈巴苷濃度的升高而顯著增加(P<0.05)，乙酰哈巴苷濃度分別為0.125、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5 mmol/L時，作用HCT116細(xì)胞24 h后的抑制率如圖1所示，分別為(2.22±0.82)%、(8.24±0.90)%、(31.18±6.48)%、(37.12±4.79)%、(52.71±1.96)%、(60.76±3.79)%、(68.65±3.22)%。結(jié)果表明乙酰哈巴苷可呈濃度-時間依賴性地抑制結(jié)腸癌細(xì)胞體外增殖。作用24、48、72 h的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為0.91、0.39、0.39 mmol/L，由于48 h至72 h其IC50值相同，表明乙酰哈巴苷主要在最初的48 h內(nèi)發(fā)揮作用，因此后續(xù)取48 h為最佳作用時間。

圖1 乙酰哈巴苷以時間依賴的方式抑制HCT116細(xì)胞活性

2.2 乙酰哈巴苷對結(jié)腸癌細(xì)胞克隆形成的影響

用0.5 mmol/L乙酰哈巴苷作用HCT116細(xì)胞7天后，對照組細(xì)胞形成了明顯的克隆(197±16)，而藥物處理組的克隆率明顯減少(0.33±0.57)。由圖2所示，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明乙酰哈巴苷能顯著降低HCT116細(xì)胞的分裂能力，干擾細(xì)胞的克隆形成。

圖2 乙酰哈巴苷顯著抑制HCT116細(xì)胞增殖

2.3 乙酰哈巴苷對結(jié)腸癌細(xì)胞周期和凋亡的影響

通過流式細(xì)胞儀對染色細(xì)胞進(jìn)行分群，從而判斷細(xì)胞所處的周期相和凋亡相。結(jié)果如圖3所示，隨著乙酰哈巴苷濃度的逐漸增加，G0/G1期細(xì)胞比例由(59.40±0.98)%增加到(85.75±0.84)%，細(xì)胞周期被阻滯在G1期。

圖3 乙酰哈巴苷以劑量依賴的方式抑制HCT116細(xì)胞周期

細(xì)胞凋亡實驗結(jié)果如圖4，顯示0.75 mmol/L乙酰哈巴苷處理HCT116細(xì)胞48 h后，早期凋亡細(xì)胞從(1.21±0.38)%增加到(17.84±0.41)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明乙酰哈巴苷可以誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞發(fā)生凋亡反應(yīng)。

圖4 乙酰哈巴苷對HCT116細(xì)胞凋亡的影響

2.4 轉(zhuǎn)錄組測序篩選乙酰哈巴苷作用HCT116細(xì)胞的靶向信號通路

轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果數(shù)據(jù)采用DESeq進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5所示，對照組與藥物治療組相比存在4 129個差異基因，其中下調(diào)基因2 208個，上調(diào)基因1 921個。

圖5 轉(zhuǎn)錄組測序火山圖

通過KEGG數(shù)據(jù)庫功能富集，結(jié)果如圖6，發(fā)現(xiàn)Wnt通路是有顯著差異的通路，表明Wnt通路可能是乙酰哈巴苷的靶向信號通路。

圖6 KEGG通路富集結(jié)果

顯著富集功能蛋白質(zhì)互作分析結(jié)果如圖7，顯示乙酰哈巴苷影響的主要差異蛋白分子有PLK1、KIF11、CDC20、WNT16、NOTHCH3、BUB1、NOXA1、MAPK15等，這些分子的功能主要是參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、有絲分裂、DNA氧化應(yīng)激損傷應(yīng)答和細(xì)胞代謝等。

圖7 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)

2.5 乙酰哈巴苷對HCT116細(xì)胞Wnt信號通路基因mRNA表達(dá)的影響

為驗證乙酰哈巴苷對HCT116細(xì)胞Wnt信號通路的影響，對Wnt信號通路相關(guān)基因進(jìn)行檢測，實驗結(jié)果如圖8。與對照組相比，乙酰哈巴苷組(0.25、0.5 mmol/L)顯著降低了HCT116細(xì)胞β-catenin、c-Myc mRNA的表達(dá)(P<0.05)。與細(xì)胞周期、凋亡相關(guān)基因CyclinD1、Survivin、Bcl-2顯著降低，Bax mRNA顯著上調(diào)(P<0.05)，以上結(jié)果表明乙酰哈巴苷在一定程度上抑制了Wnt通路的轉(zhuǎn)錄活性，同時上調(diào)了促凋亡基因的轉(zhuǎn)錄并下調(diào)了凋亡抑制基因的轉(zhuǎn)錄。

圖8 乙酰哈巴苷對HCT116細(xì)胞中Wnt信號通路及細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA水平的影響

2.6 乙酰哈巴苷對HCT116細(xì)胞Wnt通路蛋白的影響

為驗證乙酰哈巴苷對HCT116細(xì)胞Wnt信號通路蛋白的影響，用乙酰哈巴苷作用HCT116細(xì)胞，檢測結(jié)果如圖9，顯示乙酰哈巴苷引起Wnt信號通路及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白β-catenin、c-Myc、Survivin、CyclinD1、Bcl-2、pro-caspase3顯著下調(diào)(P<0.05)，乙酰哈巴苷引起細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白APC、Bax、cleaved-caspase3顯著上調(diào)(P<0.05)。

圖9 乙酰哈巴苷處理后Wnt信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

同時，用XAV939和乙酰哈巴苷各自單獨用藥后對HCT116細(xì)胞進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)都能顯著降低β-catenin和c-Myc蛋白的表達(dá)，二者聯(lián)合用藥后如圖10所示，能進(jìn)一步降低β-catenin和c-Myc蛋白的表達(dá)并降低了HCT116細(xì)胞的存活率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，這些結(jié)果從蛋白水平上表明乙酰哈巴苷抑制了Wnt通路的活性，同時激活了凋亡通路。乙酰哈巴苷與XAV939具有協(xié)同作用，能進(jìn)一步抑制HCT116細(xì)胞的Wnt/β-catenin信號通路。

圖10 乙酰哈巴苷聯(lián)合XAV939處理對β-catenin、c-Mcy表達(dá)的影響

3 討論與結(jié)論

結(jié)腸癌約占全世界每年癌癥相關(guān)死亡人數(shù)的10%[9]。目前結(jié)腸癌的治療主要以手術(shù)為主，化療和放療為輔，對于晚期化療患者來說，化療的有效率低且副作用明顯，生存期只有18個月左右[10]。近年來，在天然植物中尋找能抗腫瘤藥物是一大研究熱點，因為一些傳統(tǒng)的化療藥物，包括紫杉醇和長春新堿[11]均來源于自然植物。

抗增殖是開發(fā)抗癌藥物的重要切入點，CCK8法顯示了乙酰哈巴苷對HCT116細(xì)胞的抑制作用呈濃度-時間依賴性，三個時間點的IC50分別為0.91、0.39、0.39 mmol/L，說明乙酰哈巴苷主要在最初的48 h內(nèi)發(fā)揮作用。此外，通過平板克隆形成實驗證明了乙酰哈巴苷可導(dǎo)致HCT116細(xì)胞的克隆形成能力明顯減弱。

腫瘤細(xì)胞的增殖和生存能力遠(yuǎn)強于正常細(xì)胞[12]，大多數(shù)抗癌藥物能通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡來抑制腫瘤細(xì)胞增殖[13]。細(xì)胞在死亡過程常發(fā)生活性氧水平升高、半胱天冬氨酸蛋白酶激活和染色質(zhì)凝聚等現(xiàn)象[14]，其中線粒體跨膜電位丟失誘導(dǎo)細(xì)胞色素c從線粒體釋放到胞質(zhì)是誘導(dǎo)凋亡的關(guān)鍵步驟[15]，而Bax和Bcl2對細(xì)胞色素c的釋放和下游caspase蛋白的激活至關(guān)重要[16]。對此我們通過流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，乙酰哈巴苷可以劑量依賴性地影響結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞的細(xì)胞周期，引起細(xì)胞周期阻滯于G1期，同時導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡率明顯升高。

研究證實Wnt信號通路與結(jié)腸癌發(fā)展高度相關(guān)[17]，其中，β-連環(huán)蛋白(β-catenin)是Wnt經(jīng)典通路的關(guān)鍵分子，E-鈣黏蛋白/β-連環(huán)蛋白復(fù)合物有助于細(xì)胞間粘附穩(wěn)定，從而減少細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[18]。在腫瘤細(xì)胞中，β-catenin可激活與癌細(xì)胞增殖、周期、凋亡、遷移、侵襲和耐藥性相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致腫瘤的惡性增殖[19]。此外，β-catenin已被證明是一種有前途的癌癥預(yù)防和治療靶點，許多天然產(chǎn)物可作為β-catenin信號傳導(dǎo)的抑制劑，其機制主要是通過磷酸化、泛素化和抑制其核移位實現(xiàn)的，并且天然產(chǎn)物抑制劑在體內(nèi)外的各種腫瘤模型中顯示出了較好的預(yù)防和治療效果[20]。β-catenin在細(xì)胞核中可促進(jìn)下游分子Myc的表達(dá)，Myc屬原癌基因家族，在核內(nèi)編碼細(xì)胞必需的核轉(zhuǎn)錄因子，主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、增殖、分化、周期、代謝、凋亡等[21]。在哺乳動物中，Myc家族蛋白質(zhì)包含c-Myc、n-Myc和l-Myc三類，c-Myc與基因組不穩(wěn)定性和腫瘤發(fā)生有關(guān)。在靜止細(xì)胞中，c-Myc的表達(dá)水平較低，一旦細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，c-Myc的表達(dá)迅速增加數(shù)倍[22]。此外，在約70%的結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)c-Myc蛋白顯著上調(diào)，表明c-Myc與結(jié)腸癌的惡性程度呈正相關(guān)[23]。

本實驗采用高通量轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)乙酰哈巴苷共引起HCT116細(xì)胞產(chǎn)生4 129個差異基因，其中分別為上調(diào)基因1 921個，下調(diào)基因2 208個，差異基因主要與細(xì)胞生長、細(xì)胞周期、細(xì)胞侵襲、細(xì)胞免疫、氧化應(yīng)激、細(xì)胞代謝、分子轉(zhuǎn)運和細(xì)胞死亡途徑有關(guān)，在差異基因結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫分析后發(fā)現(xiàn)，乙酰哈巴苷顯著影響了HCT116細(xì)胞的Wnt信號通路，通過乙酰哈巴苷與對照組基因表達(dá)和蛋白質(zhì)檢測，證實了β-catenin和c-Myc的顯著下調(diào)。乙酰哈巴苷聯(lián)合Wnt小分子抑制劑XAV939進(jìn)一步抑制了HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞的生長，表明Wnt/β-catenin通路還介導(dǎo)了HCT116的耐藥性，抑制Wnt/β-catenin通路可使乙酰哈巴苷的抗腫瘤活性明顯增強。

本研究顯示，乙酰哈巴苷能有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的增殖活性，基因組檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的Wnt/β-catenin信號通路發(fā)生顯著差異，推測乙酰哈巴苷可能通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路使細(xì)胞正常的生長受到抑制，進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和周期阻滯，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長。然而，該推測需要佐證，其具體作用途徑尚需進(jìn)一步深入研究。