基于網絡藥理學和數(shù)據(jù)挖掘探討中藥干預細胞因子風暴的物質基礎及用藥規(guī)律

陳 琛，周海龍，吳春興，王博龍

1宜春學院；2宜春市第二人民醫(yī)院，宜春 336000

細胞因子是機體產生炎癥反應不可或缺的一部分，而細胞因子風暴(cytokine storm，CS)是機體感染病原微生物后IL-6、IL-1、TNF-α、IFN等多種細胞因子在短時間內異常增高表達所導致的嚴重免疫反應，被認為是新冠肺炎發(fā)展的主要機制之一[1]。臨床研究[2,3]顯示部分新冠肺炎患者早期癥狀較輕，而后期病情突然加重的主要原因是CS，且嚴重程度與CS呈正相關。對于危重病人，CS可誘發(fā)急性呼吸窘迫綜合征和多器官損害，甚至死亡。由于CS的發(fā)生機制相對復雜，導致與之相關的疾病也進展迅速，為臨床治療帶來了挑戰(zhàn)。因此，近年來CS干預調節(jié)劑的研發(fā)已成為熱點課題。

傳統(tǒng)中醫(yī)藥在疾病的臨床治療中療效顯著，且中藥復方干預疾病時具有多靶點、多途徑、安全性高等優(yōu)點。網絡藥理學研究方法能整合疾病靶點、成分、中藥等具有聯(lián)系的重要信息；本研究擬采取網絡藥理學方法并結合數(shù)據(jù)挖掘，以CS相關靶點為切入點，探討中藥干預CS的物質基礎及一般規(guī)律，以期為中藥干預CS的相關研究和實驗驗證提供借鑒和參考。

1 資料與方法

1.1 相關靶點收集

以“cytokine storm”為關鍵詞，借助GeneCards數(shù)據(jù)庫(http://www.genecards.org/)、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(http://www.disgenet.org/)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(https://www.drugbank.ca)、OMIM數(shù)據(jù)庫(https://omim.org)收集相關靶點。合并去重后利用UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)匹配靶點全稱。

1.2 化合物篩選及靶點-化合物網絡構建

基于中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學平臺(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)，同時根據(jù)CS相關靶點全稱匹配化合物?；衔飸獫M足如下條件[4]：口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug-likeness，DL)≥18%、半衰期(half-life，HL)>4、拓撲極性表面積(topological polar surface area，TPSA)<140、可旋轉鍵數(shù)(number of rotatable bonds，RBN)≤10、分子質量(molecular weight，MW)≤500 Da。借助Cytoscape 3.7.2軟件構建靶點-化合物網絡，并利用Network Analyzer插件分析各節(jié)點的拓撲屬性值。

1.3 中藥獲取及靶點-化合物-中藥網絡構建

借助TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取包含備選化合物的所有中藥；去重后根據(jù)《中藥學》[5]、2020版《中華人民共和國藥典》規(guī)范中藥名稱，如“川牛膝”統(tǒng)一為“牛膝”“南蛇藤果”規(guī)范為“合歡花”等。因化合物在靶點和中藥間起橋梁作用，故可借助化合物映射得到靶點所對應的中藥。利用Cytoscape 3.7.2軟件構建靶點-化合物-中藥網絡可視圖，通過分析該網絡中各節(jié)點的拓撲屬性值，找出關鍵節(jié)點，初步評估各中藥及其化合物干預CS的功效強度[6]。

1.4 分子對接驗證

分子對接可驗證潛在靶點與備選化合物間的作用可信度，亦能為新的化合物-靶點組合提供思路。本研究選取靶點-化合物網絡中度值排名前七位的靶點與度值較高的化合物進行分子對接。在PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/pdb/)下載各蛋白的晶體結構，保存為.pdb格式；借助PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)保存化合物的2D結構，格式為.SDF。CB-Dock在線分子對接平臺(http://clab.labshare.cn/cb-dock/)可自動識別上傳蛋白的潛在結合位點，并使用內置的Auto Dock Vina軟件進行分子對接[7]。對接得分值(affinity)可衡量潛在靶點與備選化合物間的作用可信度，得分<-1.67 kJ/mol表示兩者間具有更強的結合活性。Ligplot軟件(Version 2.2)可自動計算受體與配體間形成的氫鍵、疏水作用或結構比對，將Affinity值最好的對接組合導入該軟件進行2D可視化展示。

1.5 中藥性味歸經功效分析

參照《中藥學》和2020版《中國藥典》規(guī)范已匹配中藥的性味、歸經、功效等基本信息，若某味中藥有多種性味歸經，則分別統(tǒng)計在內。此外，如中藥性味中出現(xiàn)“微寒”“微苦”等則統(tǒng)一歸為“寒”“苦”。將匹配靶點較多的中藥與其性味、歸經、功效建立聯(lián)系，利用Cytoscape 3.7.2軟件構建中藥性味歸經功效網絡。

2 結果

2.1 相關靶點結果

結果從GeneCards和DrugBank數(shù)據(jù)庫各獲得638、89個與CS相關的基因靶點，其他數(shù)據(jù)庫沒有檢索到相關靶點。篩選GeneCards數(shù)據(jù)庫中靶點值較高(relevance score>6)的前100位相關靶點，去重后經UniProt數(shù)據(jù)庫規(guī)范共獲得113個CS相關基因靶點。經篩選匹配，只有35個靶點存在符合條件的對應化合物，故將這35個靶點定義為干預CS的潛在靶點(見表1)。

表1 潛在靶點基本信息

2.2 備選化合物篩選及靶點-化合物網絡構建

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中以“潛在靶點”為檢索詞，以OB≥0.3、DL≥0.18、HL>4、TPSA<140、RBN≤10、MW≤500 Da等為條件篩選潛在靶點對應的備選化合物，合并去重后共獲得49個CS潛在靶點對應的備選化合物，圖1為靶點-化合物網絡。該網絡由84個節(jié)點和136條邊組成，圖中箭頭節(jié)點代表潛在靶點，八邊形節(jié)點為備選化合物。節(jié)點度值越大其樞紐作用越強，在網絡中的作用越重要。可見度值前5位的化合物依次是槲皮素、木犀草素、雷公藤甲素、漆黃素、漢黃芩素，它們分別對應著23、13、10、9、7個靶點。另外，度值前7位的靶點依次為MAPK14、TNF、IL6、AKT1、MAPK1、VEGFA、IL1B。

圖1 靶點-化合物網絡圖

2.3 中藥獲取及靶點-化合物-中藥網絡構建

借助TCMSP數(shù)據(jù)庫匹配出49個備選化合物涉及的全部中藥，去重后根據(jù)《中藥學》、2020版《中國藥典》規(guī)范中藥名稱并去重，最終獲得268味中藥。利用Cytoscape 3.7.2軟件構建化合物-中藥網絡，該網絡包含317個節(jié)點和589條邊。經Network Analyzer拓撲分析，度值在前十位的中藥依次是甘草、苦參、雞血藤、胡蘆巴、山豆根、射干、燈盞細辛、銀杏葉、菊花、敗醬草，分別對應著12、10、8、7、7、6、6、6、6、6個備選化合物。同時，銀杏葉、敗醬草、甘草、燈盞細辛可分別作用于29、29、29、28個靶點，故推測這四味中藥對CS具有較強的干預作用，可作為臨床遣方用藥或實驗研究的重點；中藥度值及其對應的靶點數(shù)見圖2。由于化合物-中藥網絡的度值中位數(shù)為2，因此認為度值>4的化合物為干預CS的潛在核心化合物，共15個(見表2)。度值較高的前5位化合物分別是槲皮素、山奈酚、木犀草素、異鼠李素、柚皮素。本研究選取度值>4的中藥，利用Cytoscape 3.7.2軟件重新構建靶點-化合物-中藥網絡圖(見圖3)，其中網絡節(jié)點的大小與其度值成正比。

圖2 中藥度值及其作用靶點數(shù)分布圖

圖3 靶點-化合物-中藥網絡圖(Degree>4)

表2 干預細胞因子風暴的潛在核心化合物(Degree>4)

2.4 分子對接

利用CB-Dock在線分子對接平臺將度值前15位的化合物與7個核心靶點MAPK14(PDB ID:4EH3)、TNF(PDB ID:6M8A)、IL-6(PDB ID:5Z15)、AKT1(PDB ID:1QKM)、MAPK1(PDB ID:3V3V)、VEGFA(PDB ID:4GQR)、IL1B(PDB ID:5R86)進行分子對接，結果見圖4。在105組對接結果中，affinity值<-1.67 kJ/mol的有95組(90.48%)，其中對接affinity值最高的組合為IL-6-luteolin(-2.56 kJ/mol)，最低的是IL1B-matrine(-1.48 kJ/mol)。利用Ligplot軟件將affinity值最高的5組對接組合結果以二維圖的形式展示，如圖5A～5E所示?？梢姼髋潴w均嵌入靶點蛋白的活性口袋中，且通過疏水作用或氫鍵等形式與靶蛋白的多個氨基酸殘基發(fā)生相互作用。

2.5 性味歸經功效分析

根據(jù)《中藥學》與2020版《中華人民共和國藥典》匹配所獲得中藥的基本信息，建立數(shù)據(jù)庫，其中對應靶點較多的中藥基本信息見表3。利用Microsoft Office Excel 2017表的數(shù)據(jù)透視表功能統(tǒng)計分析中藥的性味歸經，干預CS的中藥藥味總頻次為393次，以苦為主；藥性總頻次為264次，以寒最常見(見表4)。同時，這些中藥以入肝經(137次)、肺經(107次)最多(見圖6)。由此推測CS的發(fā)生機制可能與肝經、肺經有著緊密的聯(lián)系。將對應靶點最多的前15位中藥與其性味、歸經、功效建立聯(lián)系，并構建中藥性味歸經功效網絡。由圖7可知這些中藥的特征與上述分析結果基本吻合；此外，它們在功效分類上多為清熱類、活血化瘀類、補虛類。

圖6 歸經分布圖

圖7 中藥性味歸經功效網絡圖

表3 主要中藥基本信息

表4 干預細胞因子風暴的中藥性味分布

3 討論

CS是人體受刺激后產生的過度免疫反應，體內的細胞因子、趨化因子被活化釋放，導致促炎和抗炎的平衡被打破。研究[8]表明導致COVID-19患者病情惡化、死亡的罪魁禍首正是CS，而抑制CS是搶救危重癥COVID-19患者的首要任務。西醫(yī)治療CS主要依賴糖皮質激素，長期大劑量使用糖皮質激素雖能達到一定的防治效果，但其所帶來的毒副作用不容忽視。與之相反，中藥本身具有作用廣泛、靶點多元、整體調節(jié)等優(yōu)勢，在干預和調節(jié)CS中具有廣闊的應用前景和研究價值。本研究借助網絡藥理學和數(shù)據(jù)挖掘的方法，以CS相關靶點為切入點，篩選出干預CS的化合物和中藥，并系統(tǒng)預測和闡釋了中藥干預CS的物質基礎及用藥規(guī)律。

結果顯示，度值排名靠前的靶點主要有MAPK14、TNF、IL6、AKT1、MAPK1、VEGFA、IL1B等。絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)在細胞增殖、分化、炎癥反應、免疫防御等諸多方面發(fā)揮著重要作用。研究[9,10]表明MAPK14在調節(jié)細胞因子(TNF-α、IL-6)和趨化因子(CCL2、CCL4)等方面發(fā)揮關鍵作用，調節(jié)MAPK14的活化可抑制細胞炎癥因子的釋放。COVID-19患者感染早期TNF-α、IL1B等早期炎癥因子即迅速分泌，過量的早期炎癥細胞因子會打破體內抗炎-促炎平衡，進一步引發(fā)包括IL-6、IL-2等在內的細胞因子和趨化因子活化、釋放，形成失控的CS[11]。另外，由于TNF-α是機體在炎癥早期分泌的主要炎性因子，可使細胞間黏附分子表達增加，NF-κB活性增強，最終通過正反饋調節(jié)機制使炎癥反應擴大和持續(xù)[12,13]。IL-6不僅具有多種生物學活性，且是前炎癥介質[14]；同時IL-6的體內水平與COVID-19患者病情程度呈正相關，這預示著其在中藥抗炎反應中可能處于關鍵地位。此外，廣泛分布于腦中的VEGFA作為重要的血管生成因子，可能通過促進炎癥細胞的聚集及調節(jié)血管生成素II(Ang II)的水平在COVID-19患者腦部炎癥中起關鍵作用[15]。

靶點-化合物網絡中對應靶點較多的化合物，如雷公藤甲素、漆黃素等所映射的中藥在后續(xù)分析中度值較小，故不再討論。而度值較高的化合物主要有槲皮素、山奈酚、木犀草素、異鼠李素、柚皮素等。研究[16]顯示槲皮素可通過抑制NF-κB p65蛋白表達，降低IL-6等炎癥因子的分泌，從而發(fā)揮抗炎及保護血管內皮細胞的作用。山奈酚能顯著抑制MAPK通路的激活，降低IL-8、IL-10、MDC等炎癥因子產生，從而有效抑制炎癥發(fā)生[17]。Leyva-López等[18]研究證實木犀草素是重要的促炎細胞因子調節(jié)劑，可抑制炎癥反應中的活性氧和一氧化氮(NO)等介質，減少細胞因子的表達和分泌。此外，柚皮素可通過抑制LRP3炎癥小體活化，進而降低肺組織中TNF-α、IL-1B和IL-18等炎癥因子的含量[19]。分子對接結果顯示所篩選的高度值化合物與核心靶點間均具有較好的結合活性；此外，黃芩素、蘆薈大黃素等化合物在分子對接中也展現(xiàn)出了較好的對接活性。

靶點-化合物、靶點-化合物-中藥等網絡直觀呈現(xiàn)了中藥在干預CS方面具有多種類、多成分、多靶點的特點。同時，化合物度值及對應靶點數(shù)也體現(xiàn)了銀杏葉、敗醬草、甘草等中藥在干預CS上的重要性。實驗證實銀杏葉及其提取物可干預小鼠Ghrelin-Obestatin信號通路，降低血清中TNF-α、IL-6、IL-8等細胞因子含量，減輕炎癥反應、改善肺功能[20]。敗醬草可降低炎癥模型大鼠血清中IL-6、IL-8和TNF-α的含量[21]，且具有清熱解毒的功效，是疏風解毒膠囊的主要佐藥[22]。Dai等[23]發(fā)現(xiàn)甘草、菊花、射干等是新冠肺炎治療的常用中藥，這些中藥均能較好地抑制TNF-α、IL-6等細胞因子的產生。由甘草、射干等中藥組成的清肺排毒湯作為新冠肺炎治療的主要方劑，能顯著降低促炎因子釋放，具有強大的體內外抗炎活性[24]?？鄥A作為苦參的主要成分，其治療新冠肺炎的臨床療效已得到證實；此外，苦參中含有的黃酮類化合物也具有明顯的抗炎活性，能顯著抑制促炎性細胞因子NO、TNF-α、IL-6及MCP-1等釋放[25]。

性味分析顯示具有干預CS潛能的中藥藥味以苦為主，藥性以寒最常見。中醫(yī)理論認為苦味中藥“能泄、能燥、能堅”；且多具有清泄火熱、泄降氣逆、通泄大便、瀉火存陰等功效。CS引起的急性肺損傷患者多有燥熱內結、腑氣不通、腹脹痞滿等癥候，苦味中藥之應用可發(fā)揮通氣瀉下、廓清熱邪的作用。寒性中藥多有清熱解毒、瀉火涼熱之功效，而CS所致的COVID-19屬中醫(yī)“溫熱病”范疇，主要表現(xiàn)多為發(fā)熱、咳嗽等，應用寒性中藥正符合中醫(yī)熱者寒之的基本治則。與此同時，具有干預CS潛能的中藥多入肝經、肺經，肝為將軍之官，肺為機體宣發(fā)肅降之臟。《素問·陰陽應象大論》有“肺居膈上，其氣肅降；肝居膈下，其氣升發(fā)；肝升才能肺降，肺降才能肝升”的記載，可見只有肝肺兩臟升降相宜才能保證人體氣機舒展氣血正常運行，進而恢復患者的呼吸功能。由此可見，中醫(yī)藥干預CS可從清熱瀉火、活血化瘀及補益肺氣等方面入手。

綜上所述，本研究利用網絡藥理學、分子對接和數(shù)據(jù)挖掘等方法，以CS相關的靶點為切入點，較為系統(tǒng)地探討了中藥干預CS的潛在藥效物質基礎及其用藥規(guī)律。在一定程度上為中醫(yī)藥干預CS及其相關疾病提供了理論支持，也為進一步開發(fā)干預CS的藥物提供了新思路。