不同生育期襄麥冬內(nèi)生細(xì)菌的分布及產(chǎn)甾體皂苷菌株的初步篩選

余海忠，程 旭，王海燕，殷幼平，王中康

1湖北文理學(xué)院食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，襄陽 441053；2重慶大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶 405200；3襄陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，襄陽 441057

襄麥冬，即湖北麥冬Liriopespicatavar.proliferaY.T.Ma，為《中華人民共和國藥典》(2010年版)山麥冬基源植物之一[1]，甾體皂苷是其主要活性成分，它的皂苷元基本骨架屬于螺甾烷(spirostane，共有27個(gè)碳原子組成)的衍生物，依照螺甾烷結(jié)構(gòu)中C25的構(gòu)型和F環(huán)的環(huán)合狀態(tài)，可將其分為以下四種主要類型：螺甾烷醇類(C25為S構(gòu)型)、異螺甾烷醇類(C25為R構(gòu)型)、呋甾烷醇類(F環(huán)為開鏈衍生物)、變形螺甾烷醇類(F環(huán)為五元四氫呋喃環(huán))?，F(xiàn)已從襄麥冬中分離出14種甾體皂苷[2-4]，其主要苷元是薯蕷苷元(diosgenin)和魯斯可苷元(ruscogenin)，均為C25(S)異構(gòu)體，其中以山麥冬皂苷C(Ls-S3)含量較高[5]。甾體皂苷具有多重藥理學(xué)活性[6,7]，除了極少的能化學(xué)全合成，主要還是通過化學(xué)萃取中藥材直接獲得[8]，襄麥冬甾體皂苷也不例外。但是由于存在生產(chǎn)周期長、大田連作障礙、皂苷含量低、提取成本高、環(huán)境污染大等問題[9]，襄麥冬甾體皂苷的可持續(xù)生產(chǎn)和供應(yīng)受到制約，因此，非常有必要尋找大量制備皂苷的新途徑。

此前，有研究報(bào)道從滇重樓、華重樓中分離得到可產(chǎn)生甾體皂苷的內(nèi)生細(xì)菌[10-13]，受此啟發(fā)，本課題組嘗試從襄麥冬中分離和發(fā)掘代謝產(chǎn)生甾體皂苷的內(nèi)生細(xì)菌菌株：利用純培方法和16S rDNA-PCR-DGGE技術(shù)[14]，分析和鑒定襄麥冬始見期、迅速膨大期、成熟采收期的樣品(塊根或須根)中內(nèi)生細(xì)菌的分布。同時(shí)，采用顏色反應(yīng)、TLC、HPLC方法，對獲得的純培菌株進(jìn)行初步的產(chǎn)皂苷能力評價(jià)，以期獲得目的菌株為實(shí)現(xiàn)甾體皂苷的“工廠化、規(guī)?；⒖焖倩鄙a(chǎn)提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品處理與表面消毒

襄麥冬樣品分三次采集：2013年9月20日(塊根始見期)、2013年11月28日(塊根迅速膨大期)和2014年3月22日(塊根成熟采收期)，地點(diǎn)位于湖北襄陽歐廟襄麥冬GAP基地。選擇茁壯植株的新鮮塊根或須根，采集后立即帶回實(shí)驗(yàn)室沖洗處理，在無菌條件下，將待處理樣品(塊根、須根)放入75%(V/V)乙醇浸泡2 min，用無菌水漂洗3次；有效氯含量4%～6%的次氯酸鈉溶液浸泡2 min，用大量無菌水連續(xù)漂洗4次，并分別設(shè)置環(huán)境、漂洗和印記對照試驗(yàn)以檢測表面消毒是否徹底。處理后的樣品用無菌濾紙吸干水分，取一部分在3天之內(nèi)完成可純培內(nèi)生細(xì)菌的分離操作，另取一部分置-80 ℃保存用于后續(xù)16S rDNA PCR-DGGE分析。

1.2 試劑與設(shè)備

主要試劑：有效氯含量4%～6%的次氯酸鈉、正丁醇、乙醚、氯仿、濃硫酸、乙酸酐、AlCl3、75%乙醇、無水乙醇、二氨基乙基四乙胺、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、N,N,N′,N′-四甲基二乙胺、色譜純乙腈(上海國藥集團(tuán)公司)；薄層層析用硅膠G(青島海洋化工廠分廠)；CTAB、SDS、EDTA、TRIS堿、PVP、β-巰基乙醇、葡萄糖、瓊脂、(上海生工)。PCR擴(kuò)增試劑盒、標(biāo)準(zhǔn)分子量、瓊脂糖、氨卞青霉素、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、引物、pMD-19T克隆載體(大連寶生物公司)；細(xì)菌基因組DNA小量制備試劑盒、凝膠純化回收試劑盒(Axygen公司)。

主要設(shè)備：YSQ-LS-30SII立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊)；HZ-9211K恒溫振蕩器(華利達(dá))；ChemiDoc XPS自動(dòng)凝膠成像儀(Bio-Rad)；AL204電子分析天平(梅特勒-托利多)；GXP-9160MBE隔水式培養(yǎng)箱(上海博訊)；GZX-9030MBE鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊)；Mastercycler pro梯度PCR儀(Eppendorf)；SIGMA 3K15低溫冷凍離心機(jī)(Sigma)；Power Pac HCTM電泳儀(Bio-Rad)；FreeZone 12小型冷凍干燥機(jī)(Labconco)；超低溫冰箱(Thermo electron)；MiliQ純水機(jī)(Millipore)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮)；核酸蛋白檢測儀(Beckman)；Shimadzu LC-20AT高效液相色譜儀(島津)。

1.3 可純培內(nèi)生細(xì)菌的鑒定

1.3.1 菌株的分離與純化

在無菌條件下，稱取表面消毒樣品組織1.0 g左右，加5 mL無菌水于研缽中充分研磨，將勻漿液按1×10-3倍數(shù)稀釋之后，分別吸取0.2 mL涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基平板，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，37 ℃避光培養(yǎng)。隨時(shí)觀察平板，挑取生長良好的菌落，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上作“Z”形劃線，并根據(jù)菌落的顏色及形態(tài)，分別取呈現(xiàn)不同表形特征的菌落進(jìn)行多次劃線純化，直至得到單菌落。菌株編號，轉(zhuǎn)入PDA斜面37 ℃培養(yǎng)，待菌落長滿試管后于4 ℃保藏、待用。

1.3.2 菌株DNA的提取

挑取上述單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，根據(jù)不同菌落生長的特點(diǎn)，在37 ℃下180 r/min分別震蕩培養(yǎng)7～12 h后取菌液2 mL，10 000 r/min離心5 min，去上清收集菌體。采用酶解法[15]提取內(nèi)生細(xì)菌的基因組總DNA，DNA樣品-20 ℃保存、待用。

1.3.3 16S rRNA基因的擴(kuò)增與克隆

取上述提取的細(xì)菌總DNA為模板，以細(xì)菌16S rRNA基因通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增[16]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%(W/V)的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，用凝膠成像儀檢測。采用pMDTM19-T Vector作為克隆載體，按照KIT提供的操作步驟完成上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的連接、轉(zhuǎn)化和陽性克隆的鑒定。陽性克隆轉(zhuǎn)接于LB液體培養(yǎng)基，震蕩培養(yǎng)12～16 h后將菌液送出測序。

1.4 內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA-DGGE分析

1.4.1 菌株基因組DNA提取

取上述-80 ℃保存的表面消毒樣品，進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌基因組DNA的提取[16]，洗脫得到的DNA溶解于TE，分裝后-20 ℃保存待用。

1.4.2 菌株16S rDNA V6～V8區(qū)的擴(kuò)增

為了避免植物樣本中線粒體DNA與葉綠體DNA的干擾，本實(shí)驗(yàn)在進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA序列擴(kuò)增時(shí)分為兩個(gè)流程：先按照“1.3.3”項(xiàng)下方法擴(kuò)增出細(xì)菌16S rDNA中的V5～V9高變區(qū)；再以V5～V9高變區(qū)的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，采用Nested-PCR[17]來擴(kuò)增16S rDNA的V6～V8區(qū)。擴(kuò)增結(jié)束以后，取一定量的PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，檢測是否為目的DNA片段，若有，用此PCR產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析。

1.4.3 PCR-DGGE分離及條帶分析

對上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行濃縮，采用DGGE系統(tǒng)進(jìn)行電泳分離及條帶分析[16]，依次完成電泳分離、銀染、拍照，使用QuantityOne-1-D軟件標(biāo)出圖譜中較清晰的條帶，并切下對應(yīng)的條帶，分別搗碎后加入20 μL ddH2O于-20 ℃過夜，最后以上清液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳檢測，切割并回收目的DNA條帶，送出測序。

1.5 序列比對

將上述菌株16S rDNA的V5～V9區(qū)、V6～V8區(qū)序列測序結(jié)果，在NCBI數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行BLAST比對分析，尋找同源性最高的序列進(jìn)行種屬鑒定。

1.6 產(chǎn)甾體皂苷內(nèi)生菌株的篩選

1.6.1 菌株發(fā)酵液總皂苷提取物的制備

按照“1.3.2”項(xiàng)下方法完成菌株的液體震蕩培養(yǎng)，將發(fā)酵液-80 ℃急凍后進(jìn)行低溫冷凍干燥，再按以下步驟完成菌株發(fā)酵液總皂苷的提?。豪鋬龈稍锏陌l(fā)酵產(chǎn)物研成粉末，加入75%乙醇在60 ℃下抽提3 h，重復(fù)抽提兩次，合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得浸膏。浸膏加水溶解后，加入乙醚進(jìn)行萃取，保留水層部分，再加入水飽和正丁醇萃取4次(15、10、5、5 mL)，保留并合并正丁醇層部分。減壓濃縮去除正丁醇后獲得浸膏，即菌株發(fā)酵液總皂苷提取物。浸膏根據(jù)后續(xù)不同的檢測需要，選擇不同的溶劑進(jìn)行溶解，分裝后于-20 ℃保存待用。

1.6.2 發(fā)酵液總皂苷提取物的顏色反應(yīng)

分別取上述菌株發(fā)酵液總皂苷提取物進(jìn)行顏色反應(yīng)，初步檢測所提取的菌株發(fā)酵產(chǎn)物中是否含有皂苷。如果有，再判斷其是屬于甾體皂苷還是三萜皂苷(見表1)。

表1 內(nèi)生菌株發(fā)酵液總皂苷提取物的顏色反應(yīng)

1.6.3 發(fā)酵液總皂苷提取物的TLC檢測

陽性對照的制備：稱取襄麥冬塊根粉末10 g，加入100 mL甲醇，80 ℃索氏提取3 h至無色，對提取液進(jìn)行減壓濃縮，得浸膏，后續(xù)提取步驟與“1.6.1”項(xiàng)下方法相同，最終獲得襄麥冬總皂苷提取物，用2 mL甲醇溶解，即獲得陽性對照。

TLC檢測：將上述提取的菌株發(fā)酵液總皂苷提取物配成甲醇溶液，取10 μL點(diǎn)樣于G型硅膠板上，設(shè)置陽性對照。層析液為氯仿-甲醇(100∶1)，顯色液為15%硫酸乙醇溶液，105 ℃烘3 min，直至顯出清晰紅色斑點(diǎn)為止。

1.6.4 發(fā)酵液總皂苷提取物的HPLC檢測

色譜條件：檢測器：SPD-20A；柱溫箱：CTU-10AS 并配有在線脫氣機(jī)DGU-20A；色譜柱：Inert Sustain C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動(dòng)相：A水，B乙腈；梯度洗脫(0～25 min，5%B→30%B；25～35 min，30%B→55%B；35～45 min，55%B→65%B；45～55 min，65%B→85%B；55～70 min，85%B→100%B；70～75 min，100%B；75～75.5 min，100%B→5%B；75.5～80 min，5%B)。流速1 mL/min，檢測波長為210 nm，進(jìn)樣量10 μL，記錄80 min數(shù)據(jù)，信號強(qiáng)度單位為μV。

2 結(jié)果與分析

2.1 可純培襄麥冬內(nèi)生細(xì)菌的分離及鑒定

通過傳統(tǒng)的細(xì)菌分離純化方法，本實(shí)驗(yàn)完成對不同生育期襄麥冬塊根和須根的初步分離，獲得50株可純培的內(nèi)生細(xì)菌，其中28株來自須根，22株來自塊根。觀察記錄它們的菌落形態(tài)特征，并對其16s rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增、測序、BLASTn比對，具體結(jié)果見表2。根據(jù)菌落形態(tài)，并結(jié)合序列比對結(jié)果，初步表明：上述50株內(nèi)生細(xì)菌分屬15個(gè)屬22個(gè)種。其中，芽孢桿菌屬Bacillus、葡萄球菌屬Staphylococcus各分離出4種菌，假單胞菌屬Pseudomonas分離出2種菌，其余的12個(gè)屬，包括沙門氏菌屬Salmonella、腸桿菌屬Enterobacter、假黃單胞菌屬Pseudoxanthomonas、摩根菌屬M(fèi)organella、農(nóng)桿菌屬Agrobacterium、微桿菌屬M(fèi)icrobacterium、產(chǎn)卟啉桿菌屬Porphyrobacter、不動(dòng)桿菌屬Acinetobacter、賴氨酸芽孢桿菌屬Lysinibacillus、鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas、鞘氨醇桿菌屬Sphingobacterium、短小桿菌屬Curtobacterium，每個(gè)屬只有1種菌。

表2 襄麥冬可純培內(nèi)生細(xì)菌的形態(tài)特征及其16s RNA基因序列比對結(jié)果

上述完成鑒定的22種內(nèi)生細(xì)菌分別為：韋氏芽胞桿菌Bacillusweihenstephanensis(Accession登記號：KC329820)，嗜氣桿菌Bacillusaerophilus(Accession登記號：KC329821)，巨大芽孢桿菌Bacillusmegaterium(Accession登記號：KC329822)，尼爾森桿菌Bacillusnealsonii(Accession登記號：KC329823)，琥珀葡萄球菌琥珀亞種Staphylococcussuccinussubsp.Succinus(Accession登記號：KC329824)，山羊葡萄球菌Staphylococcuscaprae(Accession登記號：KC329825)，溶血性葡萄球菌Staphylococcushaemolyticus(Accession登記號：KC329826)，表皮葡萄球菌Staphylococcusepidermidis(Accession登記號：KC329827)，羅氏假單胞菌Pseudomonasrhodesiae(Accession登記號：KC329817)，極端東方化假單胞菌Pseudomonasextremorientalis(Accession登記號：KC329818)，邦戈?duì)柹抽T氏菌Salmonellabongori(Accession登記號：KC329819)，墨西哥假黃單胞菌PseudoxanthomonasMexicana(Accession登記號：KC329828)，根癌土壤桿菌Agrobacteriumtumefaciens(Accession登記號：KC329829)，檸檬色短小桿菌Curtobacteriumcitreum(Accession登記號：KC329830)，紡錘形賴氨酸芽孢桿菌Lysinibacillusfusiformis(Accession登記號：KC329831)，溶血不動(dòng)桿菌Acinetobacterhaemolyticus(Accession登記號：KC329832)，浮游產(chǎn)卟啉桿菌Porphyrobacterneustonensis(Accession登記號：KC329833)，磚紅色微桿菌Microbacteriumtestaceum(Accession登記號：KC329834)，陰溝腸桿菌Enterobactercloacae(Accession登記號：KC329835)，韓國鞘氨醇單胞菌Sphingomonaskoreensis(Accession登記號：KC329836)，泗陽鞘氨醇桿菌Sphingobacteriumsiyangense(Accession登記號：KC329837)，摩氏摩根菌Morganellamorganii(Accession登記號：KC329838)。

2.2 內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA-DGGE圖譜分析

2.2.1 內(nèi)生細(xì)菌 16S rDNA的V5～V9、V6～V8片段的擴(kuò)增

用通用引物擴(kuò)增襄麥冬塊根內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA V5～V9的4個(gè)高變區(qū)，得到兩條條帶，分別為730 bp和840 bp(見圖1A)，其中730 bp的條帶為目的片段，進(jìn)行切膠回收。以上述回收DNA片段為PCR擴(kuò)增模板，用帶GC夾的968F和1378R，擴(kuò)增出大小為450 bp的V6～V8的目的片段(見圖1B)。

圖1 襄麥冬內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA高變區(qū)電泳圖

2.2.2 內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA-DGGE圖譜分析

對不同生育期的襄麥冬塊根內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行DGGE圖譜分析(見圖2)，結(jié)果表明：襄麥冬塊根始見期、塊根迅速膨大期和塊根采收期這3個(gè)生育期采集的塊根樣品中，內(nèi)生菌群結(jié)構(gòu)基本相同，細(xì)菌類群差異很小。分別將分離的21個(gè)區(qū)分明顯的條帶割膠回收、測序比對，發(fā)現(xiàn)這21個(gè)序列分屬15個(gè)屬，共計(jì)21種不同細(xì)菌(見表3)。其中，芽孢桿菌屬Bacillus、葡萄菌屬Staphylococcus各有3種細(xì)菌，沙雷氏菌屬Serratia、假黃單胞菌屬Pseudomonas各有2種，其余的11個(gè)屬，包括假單孢屬Pseudomonas、果膠桿菌屬Pectobacterium、鮑特氏菌屬Bordetella、寡養(yǎng)單胞菌屬Stenotrophomonas、產(chǎn)卟啉桿菌屬Porphyrobacter、短小桿菌屬Curtobacterium、腸桿菌屬Enterobacter、甲基桿菌屬M(fèi)ethylobacterium、固氮菌屬Azotobacter、微桿菌屬M(fèi)icrobacterium、假棍狀桿菌屬Pseudoclavibacter，均只有1種菌。DGGE所測結(jié)果與上述分離得到的22種可純培內(nèi)生細(xì)菌菌株相比，又增加了7個(gè)屬：沙雷氏菌屬Serratia、果膠桿菌屬Pectobacterium、鮑特氏菌屬Bordetella、寡養(yǎng)單胞菌屬Stenotrophomonas、甲基桿菌屬M(fèi)ethylobacterium、固氮菌屬Azotobacter、假棍狀桿菌屬Pseudoclavibacter。

表3 DGGE條帶序列比對結(jié)果

圖2 襄麥冬內(nèi)生細(xì)菌16S rRNA V6～V8高變區(qū)DGGE圖譜

2.3 產(chǎn)甾體皂苷內(nèi)生菌株的篩選

2.3.1 顏色反應(yīng)篩選結(jié)果

根據(jù)Liebermann反應(yīng)、Liebermann-Burchard反應(yīng)、三氯乙酸反應(yīng)以及氯仿-濃硫酸反應(yīng)的需要，分別將上述制備的22株可純培內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液總皂苷提取物，配制成不同溶劑的樣品溶液。顏色反應(yīng)結(jié)果表明：有3株細(xì)菌初步具有產(chǎn)甾體皂苷的特征，分別是磚紅色微桿菌Microbacteriumtestaceum(EBPDAK002)、墨西哥假黃單胞菌Pseudoxanthomonasmexicana(EBNDX002)、山羊葡萄球菌Staphylococcuscaprae(EBNDX003)，具體反應(yīng)結(jié)果見表4。

表4 菌株發(fā)酵液提取物甾體皂苷顏色反應(yīng)結(jié)果

2.3.2 TLC篩選結(jié)果

分別取上述3株內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液總皂苷提取物和襄麥冬總皂苷提取物的甲醇溶液，進(jìn)行薄層層析分析。在展開劑的作用下，襄麥冬總皂苷最終跑出7個(gè)條帶(目前，已從襄麥冬中分離出14種甾體皂苷分子[3]，這表明本實(shí)驗(yàn)中襄麥冬甾體皂苷的提取條件以及TLC展開條件均有待繼續(xù)優(yōu)化)，菌株 EBPDAK002、EBNDX002、EBNDX003分別跑出3、2、6個(gè)條帶，TLC圖譜表明(見圖3)，3個(gè)樣品與襄麥冬總皂苷提取物均有相對應(yīng)的條帶，對應(yīng)的遷移率Rf值也大致相同(見表5)：與襄麥冬總皂苷提取物TLC條帶相比，EBPDAK002有4個(gè)條帶的遷移距離與其相近，EBNDX002、EBNDX003則各有1個(gè)條帶相近。以上結(jié)果進(jìn)一步證明了3株內(nèi)生細(xì)菌具有產(chǎn)甾體皂苷特征。

表5 內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液總皂苷提取物TLC結(jié)果

圖3 內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液總皂苷提取物TLC圖譜

2.3.3 HPLC篩選結(jié)果

以提取的襄麥冬塊根總甾體皂苷為陽性對照，對上述3株內(nèi)生菌發(fā)酵液總皂苷提取物進(jìn)行HPLC梯度檢測，結(jié)果進(jìn)一步證明上述3種內(nèi)生細(xì)菌具有自主代謝產(chǎn)生甾體皂苷的能力。由圖4A可知，墨西哥假黃單胞菌的發(fā)酵液總皂苷，其樣品過柱子以后，分別在3.15、15.98、54.85、57.64、75.19 min等時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)了與陽性對照對應(yīng)的特征峰，表明該菌株能產(chǎn)生的甾體皂苷至少有5種與寄主植物的一樣。由圖4B可知，來自山羊葡萄球菌的樣品，在4.42、15.98、20.73、57.64、75.19 min時(shí)間點(diǎn)也出現(xiàn)了5個(gè)特征峰與陽性對照一致；圖4C則顯示了磚紅色微桿菌提取物樣品在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)即15.98、57.64、75.19 min出現(xiàn)了三個(gè)與陽性對照對應(yīng)的特征峰。有趣的是，2種內(nèi)生菌株均在15.98、57.64、75.19 min時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)了特征峰，這表明在它們代謝產(chǎn)生的甾體皂苷中，至少有3種是相同的種類。

圖4 內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)物總皂苷提取物的HPLC色譜圖

3 討論與結(jié)論

利用傳統(tǒng)微生物純培方法，本研究從不同生育期襄麥冬塊根和須根中分離獲得15屬22種的內(nèi)生細(xì)菌，其中芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬各有4種菌，假單胞菌屬有2種菌，其余的12個(gè)屬，包括沙門氏菌屬Salmonella、腸桿菌屬Enterobacter、假黃單胞菌屬Pseudoxanthomonas、摩根菌屬M(fèi)organella、農(nóng)桿菌屬Agrobacterium、微桿菌屬M(fèi)icrobacterium、產(chǎn)卟啉桿菌屬Porphyrobacter、不動(dòng)桿菌屬Acinetobacter、賴氨酸芽孢桿菌屬Lysinibacillus、鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas、鞘氨醇桿菌屬Sphingobacterium、短小桿菌屬Curtobacterium，均只有1種菌。

通過16S rDNA-PCR-DGGE鑒定，本研究發(fā)現(xiàn)在襄麥冬的塊根始見期、迅速膨大期、成熟采收期，其內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)基本相同，菌株類群差異很小。通過序列比對，從分離序列中鑒定出15屬21種的細(xì)菌類群，其中芽孢桿菌屬Bacillus、葡萄菌屬Staphylococcus各有3種細(xì)菌，沙雷氏菌屬Serratia、假黃單胞菌屬Pseudomonas各有2種，其余的11個(gè)屬，包括假單孢屬Pseudomonas、果膠桿菌屬Pectobacterium、鮑特氏菌屬Bordetella、寡養(yǎng)單胞菌屬Stenotrophomonas、產(chǎn)卟啉桿菌屬Porphyrobacter、短小桿菌屬Curtobacterium、腸桿菌屬Enterobacter、甲基桿菌屬M(fèi)ethylobacterium、固氮菌屬Azotobacter、微桿菌屬M(fèi)icrobacterium、假棍狀桿菌屬Pseudoclavibacter，均只有1種菌株。相比上述22株可純培內(nèi)生細(xì)菌，DGGE又新鑒定出7個(gè)屬：沙雷氏菌屬Serratia、果膠桿菌屬Pectobacterium、鮑特氏菌屬Bordetella、寡養(yǎng)單胞菌屬Stenotrophomonas、甲基桿菌屬M(fèi)ethylobacterium、固氮菌屬Azotobacter、假棍狀桿菌屬Pseudoclavibacter。

本研究對可純培內(nèi)生菌株的產(chǎn)皂苷能力進(jìn)行了評估，初步鑒定墨西哥假黃單胞菌Pseudoxanthomonasmexicana、山羊葡萄球菌Staphylococcuscaprae、磚紅色微桿菌Microbacteriumtestaceum3株細(xì)菌具有明顯產(chǎn)甾體皂苷特征。根據(jù)HPLC檢測結(jié)果，這三株內(nèi)生細(xì)菌均在15.98、57.64、75.19min時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)了特征峰，表明它們的發(fā)酵物中至少可能有3種皂苷是相同結(jié)構(gòu)，這有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明。目前，對甾體皂苷類化合物的檢測有兩種主要策略：一種是直接檢測，另一種是通過對裂解的皂苷元進(jìn)行定性、定量分析來間接檢測。有學(xué)者采用HPLC法先后對穿山龍[18]、箭根薯[19]、劍麻[20]、百合珠芽[21]中的薯蕷皂苷元進(jìn)行了測定。本實(shí)驗(yàn)由于未獲得襄麥冬甾體皂苷標(biāo)準(zhǔn)品和分離的純品，暫用制備的襄麥冬塊根甾體皂苷(混合物)作為陽性對照，通過比對相同檢測條件下能否出現(xiàn)相同時(shí)間點(diǎn)特征峰的方式，初步鑒定了內(nèi)生細(xì)菌的產(chǎn)苷特性，后續(xù)本實(shí)驗(yàn)室將進(jìn)一步對發(fā)酵產(chǎn)物皂苷提取物進(jìn)行分離純化，采用質(zhì)譜、核磁共振等手段進(jìn)行更精確地表征。

根據(jù)16S rDNA V6～V8高變區(qū)DGGE分析結(jié)果，并結(jié)合可產(chǎn)甾體皂苷的可純培內(nèi)生細(xì)菌的篩選結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)一個(gè)現(xiàn)象：在襄麥冬塊根迅速膨大期和成熟采收期，均能從其塊根中檢測到墨西哥假黃單胞菌P.mexicana的存在，而始見期塊根中卻未能檢測出。已經(jīng)證實(shí)襄麥冬塊根的生物量以及甾體皂苷的含量是從始見期開始逐步升高，會在迅速膨大期和成熟期采收達(dá)到頂點(diǎn)[22,23]。這種現(xiàn)象是不是意味著，墨西哥假黃單胞菌在襄麥冬塊根甾體皂苷的累積中發(fā)揮著正相關(guān)的作用？這同樣有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明。