黑面神乙酸乙酯部位化學成分研究

江 程，顧 瓊

1深圳技師學院，深圳 518116；2中山大學藥學院藥物分子設計研究中心，廣州 510006

黑面神Breyniafruticosa為大戟科黑面神屬的多年生灌木的嫩枝葉。分布于浙江、福建、廣東、海南、廣西、四川、貴州、云南等省區(qū)，散生于山坡、平地曠野灌木叢中或林緣，又名鬼畫符，鍋蓋木，青丸木，狗腳刺等，具有清熱祛濕、活血解毒的功效?？捎糜谥文c胃炎、咽喉腫痛、風濕骨痛、濕疹、高血脂病、風濕痹痛，產后乳汁不通，陰癢癥等；全株煲水外洗可治瘡癤、皮炎等[1,2]。前人研究工作表明黑面神的主要化學成分包括黃酮類化合物、木脂素類、香豆素類、倍半萜、三萜、原兒茶醛類、甾體類化合物以及多糖類、有機酸等[3-6]。藥理研究則表明黑面神具有抗炎、抑菌、抗病毒、免疫抑制作用、抗皮膚Ⅰ型超敏反應作用、抑制酪氨酸酶作用及抗小鼠慢性皮炎濕疹等作用[7-10]?；谡n題組調研清熱解毒植物的抗病毒作用，發(fā)現(xiàn)黑面神的95%乙醇提取物具有明顯的體外抑制EB病毒DNA裂解復制的活性，因此，為了尋找抗EBV病毒活性成分，我們利用活性導向分離方法，發(fā)現(xiàn)活性成分存在于乙酸乙酯萃取部位，并對這一組分進行了系統(tǒng)的化學成分研究，以期闡明黑面神抗EBV的藥效物質基礎，為進一步開發(fā)利用其藥用價值提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

AM-400型核磁共振儀(Brucker公司)；Agilent 1200型HPLC；Zorbax SB-C-18色譜柱(分析柱4.6 mm×250 mm，5 μm；半制備柱9.4 mm×250 mm，5 μm)；柱色譜硅膠(200～300目)；薄層色譜硅膠G；硅膠GF254(青島海洋化工廠)；反相填充材料C-18、Rp-18(Merck公司)；Sephadex LH-20凝膠(Pharmacia公司)；顯色劑為5%硫酸-乙醇溶液。

P3HR1細胞(中山大學中山醫(yī)學院人類病毒學實驗室)。

RPIM1640(E500026-0500，生工生物股份有限公司)；胎牛血清E510008-0100(生工生物)；鏈霉素(100 μg/mL，生工生物股份有限公司)；青霉素(100 IU，生工生物股份有限公司)；12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酯(TPA，16561-29-8，生工生物股份有限公司)；丁酸鈉(生工生物股份有限公司)；DMSO(生工生物股份有限公司)；LightCyclerFastStart DNA MasterPlus SYBR green試劑盒(生工生物股份有限公司)。

本研究所用材料為黑面神地上部分枝葉。黑面神藥材于2015年6月采于貴州省龍里縣，并由中國科學院昆明植物研究所韓春艷博士鑒定，標本存放于中山大學藥學院藥物設計實驗室。

1.2 提取與分離

黑面神(B.fruticosa)干燥枝葉7.5 kg，剪切后用95%乙醇室溫回流提取3次(3×20 L)，每次24 h。浸提液合并后減壓濃縮至浸膏狀。將得到的浸膏(220 g)用適量水(1.0 L)混懸后，依次用乙酸乙酯(3 × 3 L)、正丁醇(3 × 3 L)萃取，然后分別濃縮得到乙酸乙酯和正丁醇萃取部分浸膏。乙酸乙酯部分浸膏(84 g)和正丁醇部分浸膏(20 g)。把這兩個部位用于抗EBV活性平臺測試，乙酸乙酯部分顯示了較好的活性，接著對乙酸乙酯部位進行了系統(tǒng)的分離。乙酸乙酯部分用1.2倍硅膠拌樣裝柱后，用二氯甲烷/甲醇體系進行梯度洗脫(二氯甲烷/甲醇，100∶1、10∶1、1∶1)，劃分為Fr1～Fr3三個部分，F(xiàn)r1進一步利用硅膠柱(石油醚/乙酸乙酯，100∶1、20∶1、9∶1、2∶1、1∶1、0∶1)得到Fr1A、Fr1B、Fr1C以及化合物17(16 mg)、19(12 mg)。Fr1A～C進一步利用薄層制備板(環(huán)己烷/乙酸乙酯，150∶1、80∶1、20∶1、4∶1、1∶1、0∶1)，得到化合物18(32 mg)、20(8 mg)、21(120 mg)、22(52 mg)。Fr2利用反相中壓(甲醇/水，30%、50%、70%)得到Fr2A、Fr2B、Fr2C三個不同極性的小段，其中Fr2A通過凝膠柱分段，然后經過高效液相(甲醇/水體系，65∶35)得到化合物1(6 mg)、2(10 mg)、3(9 mg)、23(9 mg)。Fr2B通過硅膠柱(二氯甲烷/甲醇，120∶1、60∶1、15∶1、3∶1)進行劃段，再通過高效液相(甲醇/水體系，63∶37)得到化合物9(8 mg)、10(4 mg)、11(2 mg)、13(5 mg)。Fr2C利用正相中壓柱(石油醚/乙酸乙酯，100∶1、20∶1、9∶1、2∶1、1∶1、0∶1)得到Fr2C1～Fr2C5五個小組分，各小組分再經過高效液相(甲醇/水，60∶40)，得到化合物12(18 mg)、4(4 mg)、5(7 mg)、6(14 mg)、7(3 mg)、8(6 mg)。Fr3組分，利用反相(乙醇/水，30%→90%)梯度洗脫得到三個部分Fr3A、Fr3B、Fr3C。Fr3A利用凝膠(甲醇/水，1∶1)得到化合物24(10 mg)；Fr3B利用制備液相(甲醇/水，60∶40)得到化合物14(15 mg)、16(2.3 g)；Fr3C抽濾得到析出的固體，然后用二氯甲烷洗去色素得到化合物15(1.2 g)。

1.3 抗EBV活性篩選

體外培養(yǎng)P3HR-1細胞(原發(fā)性滲出性淋巴瘤細胞系，含有潛伏感染期的EBV)。使用含有10%血清，鏈霉素(100 μg/mL)，青霉素(100 IU/mL)的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37 ℃，5%二氧化碳濃度條件下進行常規(guī)維持培養(yǎng)和傳代。調整對數生長期P3HR-1細胞密度為3×105個/mL，使用20 ng/mL的12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酯(TPA)和丁酸鈉(0.3 mmol/L)誘導P3HR-1細胞進入裂解復制期。使用DMSO將待測化合物與陽性對照分別配置不同濃度藥物溶液。P3HR-1細胞經TPA處理3 h后，對細胞進行不同濃度的化合物處理，每個濃度設3個平行復孔，并設不進行TPA誘導和不經化合物處理的對照組進行比較。P3HR1細胞經TPA誘導2天后收集細胞，提取細胞的總DNA，應用實時定量PCR技術，用Light Cycler Fast Start DNA Master Plus SYBR green試劑盒、EBNA1引物(正義鏈：5′-CATTGAGTCGTCTCCCCTTTGGAAT-3′；反義鏈：5′-TCATAACAAGGTCCTTAATCG CATC-3′)和GAPDH引物分別檢測上述細胞總DNA中EBNA1和GADPH的拷貝數，并計算EBNA1/GADPH相對比值?；衔餃y試結果用IC50值表示，細胞毒性(CC50)在給細胞加化合物2天后測試，(+)-Rutamarin為陽性對照。

按照公式：EBV裂解復制相對抑制數=[(TPA誘導且加化合物組EBNA1/GAPDH)-(僅加化合物組EBNA1/GAPDH)]/[(TPA誘導但不加化合物組EBNA1/GAPDH)-(不誘導且不加化合物組EBNA1/GAPDH)]計算各化合物在不同濃度下的EBV裂解復制相對抑制數。以EBV相對抑制數為縱坐標，藥物濃度為橫坐標繪制各化合物對EBV裂解復制的抑制曲線圖，并計算各藥物的復制半數抑制劑量(IC50)以評價各化合物對EBV裂解復制的抑制活性。相對毒性=[1-加化合物組OD/不加化合物組OD]×100%計算各化合物不同濃度下的相對毒性和半數致死劑量(CC50)，用于評價各化合物的細胞毒性。另按照公式：選擇性常數(selective index，SI)=CC50/IC50計算各化合物的選擇性常數，以評價各化合物的用藥安全性。

2 實驗結果

2.1 結構鑒定

化合物1白色固體粉末；ESI-MS：m/z417[M-H]-；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：6.56(4H，s，H-2′，2″，6′，6″)，5.49(2H，s，4′，4″-OH)，4.70(2H，d，J=4.4 Hz，H-2，6)，4.25(2H，dd，J=9.2，6.8 Hz，H-4，8)，3.87～3.89(2H，m，H-4，8)，3.88(12H，s，3′，5′，3″，5″-OCH3)，3.07(2H，m，H-1，5)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：54.6(d，C-1，5)，86.3(d，C-2，6)，72.1(t，C-4，8)，132.3(s，C-1′，1″)，103.0(d，C-2′，6′，2″，6″)，147.4(s，C-3′，5′，3″，5″)，56.6(q，3′，5′，3″，5″-OCH3)，134.5(s，C-4′，4″)。以上數據與文獻[11]報道基本一致，故鑒定化合物1為(-)-丁香樹脂酚。

化合物2白色固體粉末；ESI-MS：m/z417[M-H]-；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：6.52(4H，s，H-2′，2″，6′，6″)，4.83(1H，d，J=5.0 Hz，H-6)，4.41(1H，d，J=7.5 Hz，H-2)，4.07(1H，d，J=10.0 Hz，H-8)，3.90(12H，s，3′，5′，3″，5″-OCH3)，3.70～3.89(2H，m，H-4，8)，3.28(2H，m，H-1，4)，2.84(1H，m，H-5)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：54.4(d，C-1，5)，88.0(d，C-2，6)，71.6(t，C-4)，69.8(t，C-8)，132.1(d，C-1′)，103.0(d，C-2′)，147.2(s，C-3′，5′)，134.3(s，C-4′)，102.8(d，C-6′)，130.0(d，C-1′′)，102.7(d，C-2′′)，147.0(s，C-3″，5″)，133.7(s，C-4″)，102.5(d，C-6″)，56.2(q，3′，5′，3″，5″-OCH3)。以上數據與文獻[12]報道基本一致，故鑒定化合物2為(+)-表丁香脂素。

化合物3白色固體粉末；ESI-MS：m/z417[M-H]-；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：6.55(4H，s，H-2′，2″，6′，6″)，5.63(2H，s，OH)，4.70(2H，d，J=4.0 Hz，H-2，6)，4.25(2H，dd，J=9.0，6.7 Hz，H-4，8)，3.88(2H，dd，J=9.0，3.4 Hz，H-4，8)，3.85(12H，s，3′，5′，3″，5″-OCH3)，3.08(2H，m，H-1，5)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：54.3(d，C-1，5)，86.0(d，C-2，6)，71.7(t，C-4，8)，132.1(s，C-1′，1″)，102.8(d，C-2′，6′，2″，6″)，147.2(s，C-3′，5′，3″，5″)，134.4(s，C-4′，4″)，56.3(q，3′，5′，3″，5″-OCH3)。以上數據與文獻[13]報道基本一致，故鑒定化合物3為(+)-丁香樹脂酚。

化合物4白色粉末；ESI-MS：m/z419[M-H]-；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：6.58(4H，s，H-2′)，6.37(2H，s，H-2，6)，4.29(1H，d，J=5.4 Hz，H-7)，3.85(3H，s，4′-OCH3)，3.73(6H，s，3，5-OCH3)，3.59(1H，dd，J=10.8，5.0 Hz，H-9)，3.50(2H，d，J=5.2 Hz，H-9′)，3.48(1H，m，H-9)，3.38(3H，s，5′-OCH3)，2.67(1H，dd，J=15.1，5.0 Hz，H-7′)，2.56(1H，dd，J=15.1，11.2 Hz，H-7′)，1.96(1H，m，H-8)，1.61(1H，m，H-8′)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：140.1(s，C-1)，107.8(d，C-2，6)，150.0(s，C-3，5)，135.4(s，C-4)，43.2(d，C-7)，50.7(d，C-8)，65.1(t，C-9)，131.0(s，C-1′)，108.9(d，C-2′)，139.8(s，C-3′)，56.6(q，3′-OCH3)，149.6(s，C-4′)，148.6(s，C-5′)，127.0(s，C-6′)，34.5(d，C-7′)67.6(t，C-9′)，57.4(q，3，5-OCH3)，61.1(q，5′-OCH3)。以上數據與文獻[14]報道基本一致，故鑒定化合物4為(+)-(8′R,8R,7′S)-南燭木樹脂酚。

化合物5白色粉末；ESI-MS：m/z389[M-H]-；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：6.70(4H，s，H-2′)，6.44(2H，s，H-2，6)，6.20(1H，s，H-5′)，3.84(1H，d，J=8.5 Hz，H-7)，3.83(3H，s，3′-OCH3)，3.80(6H，s，3，5-OCH3)，3.71(2H，m，H-9′)，3.68(1H，m，H-9)，3.42(1H，dd，J=11.2，3.9 Hz，H-9)，2.79(2H，d，J=7.2 Hz，H-7′)，2.03(1H，m，H-8)，1.82(1H，m，H-8′)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：137.7(s，C-1)，107.8(d，C-2，6)，150.0(s，C-3，5)，135.0(s，C-4)，48.5(d，C-7)，47.9(d，C-8)，62.1(t，C-9)，129.1(s，C-1′)，112.4(d，C-2′)，147.2(s，C-3′)，145.3(s，C-4′)，117.4(d，C-5′)，134.1(s，C-6′)，33.6(d，C-7′)，40.1(d，C-8′)，65.8(t，C-9′)，56.7(q，3，5-OCH3)，56.4(q，3′-OCH3)。以上數據與文獻[15]報道基本一致，故鑒定化合物5為(+)-5-甲氧基-異落葉松樹脂酚。

化合物6白色固末；ESI-MS：m/z419[M-H]-；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：6.56(2H，s，H-2，6)，6.20(1H，s，H-2′)，3.96(1H，m，H-8)，3.83(3H，s，3′-OCH3)，3.80(6H，s，3，5-OCH3)，3.76(1H，d，J=3.8 Hz，H-7)，3.76(1H，m，H-9′)，3.58(2H，m，H-9，9′)，3.42(1H，dd，J=11.2，3.9 Hz，H-9)，2.79(2H，d，J=7.2 Hz，H-7′)，2.05(1H，m，H-8)，1.84(1H，m，H-8′)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：140.1(s，C-1)，107.8(d，C-2，6)，150.0(s，C-3，5)，135.4(s，C-4)，42.1(d，C-7)，49.6(d，C-8)，65.4(t，C-9)，131.0(s，C-1′)，108.9(d，C-2′)，139.8(s，C-3′)，56.6(q，3′-OCH3)，149.6(s，C-4′)，148.6(s，C-5′)，127.0(s，C-6′)，35.2(d，C-7′)，67.7(t，C-9′)，57.4(q，3，5-OCH3)，61.3(q，5′-OCH3)。以上數據與文獻[16]報道基本一致，故鑒定化合物6為表南燭木樹脂酚。

化合物7白色粉末；ESI-MS：m/z359[M-H]-；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：6.73(1H，s，H-2′)，6.70(1H，d，J=1.8 Hz，H-2)，6.64(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，6.45(1H，dd，J=8.0，1.7 Hz，H-6)，6.34(1H，s，H-5′)，4.21(1H，d，J=3.2 Hz，H-7)，3.84(3H，s，3′-OCH3)，3.75(3H，s，3-OCH3)，3.57(2H，m，H-9′)，3.53(1H，dd，J=10.2，5.9 Hz，H-9)，3.40(1H，dd，J=10.4，6.9Hz，H-9)，2.95(1H，dd，J=16.3，4.0 Hz，H-7′)，2.65(1H，dd，J=16.8，9.6 Hz，H-7′)，2.08(2H，m，H-8，8′)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：136.0(s，C-1)，115.2(d，C-2)，148.6(s，C-3)，145.9(s，C-4)，115.6(d，C-5)，124.0(d，C-6)，46.5(d，C-7)，44.6(d，C-8)，63.5(t，C-9)，128.4(s，C-1′)，112.4(d，C-2′)，147.9(s，C-3′)，145.3(s，C-4′)，117.1(d，C-5′)，133.1(s，C-6′)，33.2(t，C-7′)，35.6(d，C-8′)，65.7(t，C-9′)，56.4(q，3，3′-OCH3)。以上數據與文獻[17]報道一致，故鑒定化合物7為burselignan。

化合物8白色固體；ESI-MS：m/z359[M-H]-；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：6.77(1H，d，J=7.7，H-6)，6.75(1H，s，H-2)，6.65(1H，s，H-5′)，6.63(1H，d，J=7.7，H-5)，6.18(1H，s，H-2′)，3.82(4H，m，H-9，9′)，3.78(6H，s，3，3′-OCH3)，3.41(1H，d，J=7.2，H-7)，2.75(2H，m，H-7′)，1.98(1H，m，H-8)，1.81(1H，m，H-8′)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：133.9(s，C-1)，113.6(d，C-2)，146.4(s，C-3)，145.2(s，C-4)，115.5(d，C-5)，122.8(d，C-6)，48.3(d，C-7)，48.1(d，C-8)，62.2(t，C-9)，128.5(s，C-1′)，111.9(d，C-2′)，148.2(s，C-3′)，145.8(s，C-4′)，116.9(d，C-5′)，138.4(s，C-6′)，33.7(t，C-7′)，40.4(d，C-8′)，65.9(t，C-9′)，56.2(q，3，3′-OCH3)。以上數據與文獻[18]報道基本一致，故鑒定化合物8為(-)-異落葉松樹脂酚。

化合物9白色粉末；ESI-MS：m/z435[M-H]-；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：6.74(4H，s，H-2，2′，6，6′)，4.87(2H，d，J=8.1 Hz，H-7，7′)，3.82(12H，s，3，3′，5，5′-OCH3)，3.72(2H，dd，J=10.8，3.3 Hz，H-9a，9′a)，3.61(2H，dd，J=10.8，6.6 Hz，H-9b，9′b)，2.26(2H，m，H-8，8′)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：136.2(s，C-1，1′)，104.8(d，C-2，2′，6，6′)，148.6(s，C-3，3′，5，5′)，134.6(s，C-4，4′)，83.9(d，C-7，7′)，56.9(d，C-8，8′)，62.7(t，C-9，9′)，56.7(q，3，3′，5，5′-OCH3)。以上數據與文獻[19]報道一致，故鑒定化合物9為(-)-(7S,7′S,8R,8′R)-3,3′,5,5′-tetramethoxy-7,7′-epoxylignane-4,4′,9,9′-tetraol。

化合物10白色粉末；ESI-MS：m/z375[M-H]-；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.10(1H，s，H-2′)，6.95～6.97(2H，m，H-5′，6′)，6.80～6.85(2H，m，H-2，5)，6.78(1H，d，J=8.1 Hz，H-6)，5.10(1H，d，J=7.9 Hz，H-7)，4.65(1H，d，J=8.6 Hz，H-7′)，3.88(3H，s，3′-OCH3)，3.85(3H，s，3-OCH3)，3.71(1H，dd，J=11.0，4.7 Hz，H-9′b)，3.64(1H，dd，J=11.0，6.1 Hz，H-9′a)，3.23(1H，dd，J=10.4，5.1 Hz，H-9b)，3.16(1H，dd，J=10.4，10.0 Hz，H-9a)，2.56(1H，m，H-8)，2.28(1H，m，H-8′)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：136.2(s，C-1，1′)，99.1(d，C-2)，149.1(s，C-3，3′)，147.8(s，C-4，4′)，102.5(d，C-5)，106.3(d，C-6)，76.2(d，C-7)，50.5(d，C-8)，61.0(t，C-9)，98.9(d，C-2′)，102.7(d，C-5′)，106.1(d，C-6′)，77.1(d，C-7′)，54.2(d，C-8′)，60.5(t，C-9′)，54.9(q，3，3′-OCH3)。以上數據與文獻[20]報道基本一致，鑒定化合物10為(7S,7′R,8S,8′S)-3,3′-dimethoxy-7,7′-epoxylignane-4,4′,9,9′-tetraol。

化合物11白色粉末；ESI-MS：m/z465[M+H]+。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：6.86(4H，s，H-2，2′，6，6′)，5.05(1H，m，H-7)，4.96(1H，d，J=7.0 Hz，H-7′)，3.86(6H，s，4，4′-OCH3)，3.76(12H，s，3，5，3′，5′-OCH3)，3.71(1H，dd，J=11.0，4.7 Hz，H-9′b)，3.64(1H，dd，J=11.0，6.1 Hz，H-9′a)，3.22(1H，dd，J=10.4，5.1 Hz，H-9b)，3.16(1H，dd，J=10.4，10.0 Hz，H-9a)，2.56(1H，m，H-8)，2.28(1H，m，H-8′)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：134.2(s，C-1)，104.3(d，C-2，2′)，154.1(s，C-3，3′)，137.7(s，C-4)，148.3 s，C-5，5′)，104.1(d，C-6，6′)，82.8(d，C-7)，53.8(d，C-8，8′)，61.6(t，C-9)，135.3(s，C-1′)，139.8(s，C-4′)，83.3(d，C-7′)，60.9(t，C-9′)，56.2(q，3，3′，5，5′-OCH3)，54.6(q，4，4′-OCH3)。以上數據與文獻[21]報道基本一致，鑒定化合物11為(+)-大木姜子素。

化合物12黃色膠狀；ESI-MS：m/z329[M+H]+。1H NMR(400 MHz，(CD3)2CO)δ：7.80(1H，d，J=7.3 Hz，H-6′)，7.44(1H，d，J=7.6 Hz，H-3′)，7.27(1H，m，H-4′)，7.23(1H，m，H-5′)，6.54(1H，s，H-3)，6.04(2H，s，H-7)，4.58(2H，s，H-9′)，3.89(3H，s，6-OCH3)，3.72(3H，s，4-OCH3)；13C NMR(100 MHz，(CD3)2CO)δ：131.6(s，C-1)，152.5(s，C-2)，90.1(d，C-3)，155.9(s，C-4)，104.9(s，C-5)，143.8(s，C-6)，102.5(t，C-7)，147.5(s，C-1′)，119.9(s，C-2′)，111.6(d，C-3′)，122.9(d，C-4′)，124.6(d，C-5′)，121.4(d，C-6′)，155.8(s，C-7′)，130.0(s，C-8′)，56.4(t，C-9′)，57.0(q，4-OCH3)，60.3(q，6-OCH3)。以上數據與文獻[22]報道基本一致，鑒定化合物12為1,2-methylenedioxy-4-methoxy-seco-pterocarpan。

化合物13白色粉末；ESI-MS：m/z257[M+H]+。1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：6.99(1H，d，J=8.1 Hz，H-6′)，6.86(1H，d，J=1.5 Hz，H-3′)，6.74(1H，d，J=1.5，8.1Hz，H-5′)，4.15(1H，m，H-2)，3.84(3H，s，2′-OCH3)，3.58～3.75(4H，m，H-1，3)，3.56(2H，t，J=6.6 Hz，H-9′)，2.62(2H，m，H-7′)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：61.7(t，C-1，3)，83.0(d，C-2)，146.5(s，C-1′)，151.6(s，C-2′)，113.8(d，C-3′)，138.1(s，C-4′)，121.6(d，C-5′)，119.2(d，C-6′)，32.4(t，C-7′)，35.3(t，C-8′)，61.9(t，C-9′)，56.1(q，2′-OCH3)。以上數據與文獻[23]報道基本一致，故鑒定化合物13為2-[4-(3-hydroxypropyl)-2-methoxyphenoxy]-propane-1,3-diol。

化合物14黃色固體；ESI-MS：m/z199[M-H]-；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.18(1H，d，J=9.0 Hz，H-8)，6.84(1H，d，J=2.0 Hz，H-5)，6.71(1H，dd，J=9.0，2.0 Hz，H-7)，4.79(1H，q，J=8.0 Hz，H-1)，3.70(1H，m，H-3)，3.45(1H，m，H-3)，3.02(2H，m，H-4)，1.72(3H，d，J=8.0 Hz，1-CH3)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：49.8(d，C-1)，130.7(s，C-1a)，16.8(q，1-CH3)，41.7(t，C-3)，18.6(t，C-4)105.0(s，C-4a)，102.0(d，C-5)，127.0(s，C-5a)，150.9(s，C-6)，111.8(d，C-7)，112.4(d，C-8)，132.0(s，C-8a)。以上數據與文獻[24]報道基本一致，故鑒定化合物14為shepherdine。

化合物15棕色粉末；ESI-MS：m/z327[M-H]-；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：6.98(1H，s，H-6)，4.95(1H，d，J=10.3 Hz，H-1′)，4.05(1H，m，H-6′)，3.97(1H，m，H-3′)，3.76(3H，s，4-OCH3)，3.68(1H，m，H-2′)，3.67(1H，m，H-6′)，3.62(1H，m，H-5′)，3.24(1H，m，H-4′)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：119.4(d，C-1)，117.3(t，C-2)，142.3(s，C-3)，152.4(s，C-4)，149.5(s，C-5)，111.0(d，C-6)，165.7(s，C-7)，74.3(d，C-1′)，75.6(d，C-2′)，81.4(d，C-3′)，71.9(d，C-4′)，83.0(d，C-5′)，62.7(t，C-6′)，60.9(q，4-OCH3)。以上數據與文獻[25]報道基本一致，故鑒定化合物15為4-甲氧基異虎耳草素。

化合物16棕色粉末；ESI-MS：m/z327[M-H]-；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.13(1H，s，H-6)，4.86(1H，d，J=10.3 Hz，H-1′)，4.01(1H，m，H-6′)，3.95(1H，m，H-3′)，3.81(3H，s，5-OCH3)，3.78(1H，m，H-2′)，3.68(1H，m，H-6′)，3.62(1H，m，H-5′)，3.44(1H，m，H-4′)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：118.6(d，C-1)，107.6(t，C-2)，144.9(s，C-3)，151.5(s，C-4)，150.8(s，C-5)，107.5(d，C-6)，167.8(s，C-7)，74.6(d C-1′)75.8(d，C-2′)，81.4(d，C-3′)，71.8(d，C-4′)，82.8(d，C-5′)，62.7(t，C-6′)，56.3(q，5-OCH3)。以上數據與文獻[25]報道基本一致，故鑒定化合物16為5-甲氧基異虎耳草素。

化合物17白色粉末；ESI-MS：m/z443[M+H]+，441[M-H]-；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：5.56(1H，dd，J=8.1，3.2 Hz，H-12)，3.72(1H，m，H-16)，2.57(1H，m，H-11a)，2.33(1H，m，H-11b)，2.08(1H，m，H-2)，1.14(3H，s，H-27)，1.12(3H，s，H-26)，1.05(3H，s，H-23)，0.99(3H，s，H-28)，0.95(3H，s，H-29)，0.93(6H，s，H-24，25)，0.83(3H，s，H-30)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：38.6(t，C-1)，27.2(t，C-2)，78.9(d，C-3)，38.8(s，C-4)，55.1(d，C-5)，18.3(t，C-6)，32.6(t，C-7)，39.7(s，C-8)，47.6(d，C-9)，36.9(s，C-10)，23.5(t，C-11)，122.3(d，C-12)，144.2(s，C-13)，41.2(s，C-14)，31.1(t，C-15)，70.0(d，C-16)，46.5(s，C-17)，42.3(d，C-18)，48.0(t，C-19)，30.9(s，C-20)，34.1(t，C-21)，31.0(t，C-22)，28.0(q，C-23)，15.5(q，C-24，25)，16.7(q，C-26)，25.9(q，C-27)，29.7(q，C-28)，33.2(q，C-29)，26.1(q，C-30)。以上數據與文獻[26]報道基本一致，故鑒定化合物17為馬尼拉二醇。

化合物18白色粉末；ESI-MS：m/z443[M+H]+，441[M-H]-；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：5.34(1H，d，J=6.2 Hz，H-12)，3.76(1H，m，H-22)，3.17(1H，t，J=5.1 Hz，H-3)，2.10(1H，m，H-18)，1.98(1H，m，H-5)，1.90(1H，m，H-11)，1.78(1H，m，H-1)，1.67(2H，m，H-2)，1.60(1H，m，H-1)，1.19(3H，s，H-27)，1.17(3H，s，H-26)，1.08(3H，s，H-23)，1.03(3H，s，H-28)，0.96(3H，s，H-29)，0.88(6H，s，H-24，25)，0.83(3H，s，H-30)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：38.7(t，C-1)，28.1(t，C-2)，78.9(d，C-3)，39.6(s，C-4)，55.1(d，C-5)，19.9(t，C-6)，36.8(t，C-7)，41.3(s，C-8)，47.5(d，C-9)，37.3(s，C-10)，23.5(d，C-11)，122.4(d，C-12)，143.8(s，C-13)，42.0(s，C-14)，25.4(q，C-15)，28.2(t，C-16)，38.5(s，C-17)，44.6(d，C-18)，46.0(t，C-19)，30.5(s，C-20)，42.0(t，C-21)，76.5(d，C-22)，28.0(q，C-23)，15.6(q，C-24)，16.9(q，C-25)，19.9(q，C-26)，25.9(q，C-27)，27.1(q，C-28)，32.8(q，C-29)，23.4(q，C-30)。以上數據與文獻[27]報道基本一致，故鑒定化合物18為olean-12-ene-3β,22β-diol。

化合物19白色粉末；ESI-MS：m/z427[M+H]+，425[M-H]-；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：5.25(1H，t，J=6.2 Hz，H-15)，3.52(1H，m，H-3)，1.90～1.56(2H，m，H-18)，1.90(1H，m，H-11)，1.78(1H，m，H-1)，1.67(2H，m，H-2)，1.60(1H，m，H-1)，1.33(3H，s，H-27)，1.27(3H，s，H-28)，1.19(3H，s，H-26，28)，1.08(3H，s，H-23)，0.96(3H，s，H-29)，0.92(6H，s，H-24，25)，0.80(3H，s，H-30)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：38.1(d，C-1)，27.3(t，C-2)，79.2(d，C-3)，39.1(s，C-4)，55.7(d，C-5)，19.0(t，C-6)，35.8(t，C-7，12)，38.9(s，C-8)，48.9(d，C-9)，37.9(s，C-10，13)，17.7(t，C-11)，158.1(s，C-14)，117.0(d，C-15)，36.9(t，C-16)，38.1(d，C-17)，49.4(d，C-18)，41.4(t，C-19)，29.0(s，C-20)，33.9(t，C-21)，33.2(t，C-22)，28.1(q，C-23)，15.6(q，C-24，25)，30.1(q，C-26，28)，26.0(q，C-27)，33.5(q，C-29)，21.5(q，C-30)。以上數據與文獻[28]報道基本一致，故鑒定化合物19為taxaxerol。

化合物20白色粉末；ESI-MS：m/z443[M+H]+，441[M-H]-；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：5.24(1H，d，J=3.2 Hz，H-12)，4.58(1H，m，H-6)，3.17(1H，d，J=5.1 Hz，H-3)，1.98(1H，m，H-18)，1.90(1H，m，H-11)，1.78(1H，m，H-1)，1.67(2H，m，H-2)，1.60(1H，m，H-1)，1.33(3H，s，H-27)，1.32～0.90(16H，m，CH2)，1.27(3H，s，H-28)，1.19(3H，s，H-26)，1.11(3H，s，H-23)，1.08(3H，s，H-29)，0.88(6H，s，H-24，25)，0.83(3H，s，H-30)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：40.7(s，C-1)，27.2(t，C-2)，78.9(d，C-3)，39.6(s，C-4)，55.6(d，C-5)，23.7(t，C-6)，32.6(t，C-7)，38.8(s，C-8)，46.8(s，C-9)，36.4(s，C-10)，26.0(t，C-11)，122.0(d，C-12)，144.3(s，C-13)，42.3(s，C-14)，31.1(t，C-15)，68.7(d，C-16)，47.9(d，C-17)，40.8(d，C-18)，47.2(t，C-19)，30.9(s，C-20)，37.1(t，C-21)，31.0(t，C-22)，28.3(q，C-23)，17.0(q，C-24，25)，18.4(q，C-26)，28.3(q，C-27)，29.7(q，C-28)，34.7(q，C-29)，33.3(q，C-30)。以上數據與文獻[29]報道基本一致，故鑒定化合物20為曼陀羅萜二醇。

化合物21白色粉末；ESI-MS：m/z387[M+H]+，385[M-H]-；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：5.56(1H，dd，J=6.8，3.2 Hz，H-6)，2.57(1H，dd，J=16.0，7.1 Hz，H-7a)，2.33(1H，dd，J=15.8，3.2 Hz，H-7b)，2.08(1H，dt，J=12.7，3.3 Hz，H-8)，1.14(3H，s，H-19)，0.95(3H，s，H-18)，0.93(6H，d，J=17.4 Hz，H-25，26)，0.83(3H，s，H-27)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：37.2(t，C-1)，31.7(t，C-2)，71.8(d，C-3)，42.3(t，C-4)，140.7(s，C-5)，121.7(d，C-6)，31.9(s，C-7，8)，50.1(d，C-9)，36.5(s，C-10)，21.1(s，C-11)，39.7(t，C-12)，42.3(s，C-13)，56.8(d，C-14)，24.3(t，C-15)，28.2(t，C-16)，56.1(d，C-17)，11.9(q，C-18)，19.4(q，C-19)，36.2(d，C-20)，33.7(t，C-21)，30.5(t，C-22)，39.0(d，C-23)，31.4(t，C-24)，17.6(q，C-25)，20.5(q，C-26)，15.4(q，C-27)。以上數據與文獻[30]報道基本一致，故鑒定化合物21為二氫菜子甾醇。

化合物22白色粉末；ESI-MS：m/z415[M+H]+，413[M-H]-；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：5.32(1H，d，J=5.5 Hz，H-6)，4.59(1H，m，3-OH)，3.53(1H，m，H-3)，1.00(3H，s，H-19)，0.90(3H，d，J=6.5 Hz，H-21)，0.86(3H，t，J=6.7 Hz，H-29)，0.83(3H，d，J=6.5 Hz，H-26)，0.80(3H，t，J=7.8 Hz，H-27)，0.66(3H，s，H-18)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：37.2(t，C-1)，28.0(t，C-2)，73.9(d，C-3)，38.4(t，C-4)，139.9(s，C-5)，122.8(d，C-6)，32.2(t，C-7)，32.1(d，C-8)，50.3(d，C-9)，36.8(s，C-10)，21.3(t，C-11)，39.9(t，C-12)，32.1(s，C-13)，56.9(d，C-14)，24.5(t，C-15)，28.5(t，C-16)，56.3(d，C-17)，12.1(q，C-18)，19.5(q，C-19)，36.4(d，C-20)，19.0(q，C-21)，34.2(t，C-22)，26.3(t，C-23)，46.1(d，C-24)，29.3(t，C-25)，20.5(q，C-26)，19.3(q，C-27)，22.9(t，C-28)，12.2(q，C-29)。以上數據與文獻[31]報道一致，故鑒定22為β-谷甾醇。

化合物23白色粉末；ESI-MS：m/z333[M-H]-；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.55(1H，d，J=15.9 Hz，H-3)，7.06(1H，d，J=1.9 Hz，H-5)，6.98(1H，dd，J=8.1，2.0 Hz，H-9)，6.84(1H，d，J=8.1 Hz，H-8)，6.24(1H，d，J=15.9 Hz，H-2)，4.16(2H，t，J=6.7 Hz，H-10)，3.81(3H，s，6-OCH3)，1.31～1.18(16H，m，H-2(～9′)，0.86(3H，t，J=6.7 Hz，H-1′)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：167.9(s，C-1)，114.5(d，C-2)，144.8(d，C-3)，127.9(s，C-4)，116.1(d，C-5)，144.1(s，C-6)，146.5(s，C-7)，115.6(d，C-8)，122.6(d，C-9)，65.0(t，C-1′)，32.2(t，C-2′)，29.9～28.9(t，C-3′，4′，5′，6′，7′)，26.2(t，C-8′)，22.9(t，C-9′)，14.3(q，C-10′)，56.2(s，6-OCH3)。以上數據與文獻[32]報道一致，故鑒定23為(E)-6-methoxyl-decyl caffeate。

化合物24黃色油狀；ESI-MS：m/z293[M-H]-；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：6.04(1H，dd，J=15.0，1.1 Hz，H-10)，5.97～5.84(2H，m，H-11，15)，5.58(1H，dd，J=15.0，1.9 Hz，H-9)，5.53～5.44(1H，m，H-16)，5.40(1H，dd，J=15.4，1.6 Hz，H-8)，4.46～4.37(1H，m，H-7)，2.46(1H，td，J=12.5，2.4 Hz，H-2)，2.29(1H，td，J=12.3，5.4 Hz，H-2)，2.08～1.97(4H，m，H-12，14)，2.00～1.85(2H，m，H-17)，1.50～1.35(1H，m，H-13)，1.26(1H，m，H-13)，1.24～1.15(8H，m，H-3～6)，0.97(3H，t，J=6.5 Hz，H-18)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：178.5(s，C-1)，38.2(t，C-2)，30.7(t，C-3)，28.5(t，C-4)，24.9(t，C-5)，37.2(t，C-6)，72.8(d，C-7)，137.3(d，C-8)，125.5(d，C-9)，128.5(d，C-10)，130.4(d，C-11)，26.9(t，C-12)，28.6(t，C-13)，31.4(t，C-14)，129.2(d，C-15)，131.7(d，C-16)，27.1(t，C-17)，14.1(q，C-18)。以上數據與文獻[33]報道一致，故鑒定24為(8E,10Z,15E)-7-hydroxyoctadeca-8,10,15-trienoic acid。

2.2 抗EBV活性篩選結果

將24個化合物均測試其體外抗EBV活性，結果顯示在30 μmol/L的濃度下，共有2個化合物抑制EB病毒裂解復制達到50%以上。隨后繼續(xù)測試這2個化合物的IC50、CC50以及SI(見表1)，測試結果顯示化合物14陽性對照右旋蕓香苦素相比，具有更高活性跟選擇性。

表1 黑面神中活性化合物的抑制EBV裂解復制活性及細胞毒性

3 討論與結論

黑面神作為藥用的多年生灌木，在我國南方地區(qū)有著廣泛的分布，植物資源非常豐富。本實驗采用現(xiàn)代色譜技術對黑面神95%提取物的醋酸乙酯部位進行了化學成分研究，從中分離得到24個化合物，化合物1～11為木脂素類化合物，化合物15、16為虎耳素類化合物，化合物17～22為三萜及甾體類化合物，其他化合物為芳香醇、酯以及生物堿等化合物，以上化合物除了1、3、4、8、22外均為首次從該植物中獲得。此外，還對所得的化合物進行抑制EBV裂解復制活性及細胞毒性活性篩選從結果來看，所得化合物12和14對抑制EBV裂解復制活性較明顯，其中14抑制EBV活性高于右旋蕓香苦素抑制活性。根據文獻報道，目前關于黑面神抗病毒活性成分的報道主要集中在流感病毒、水泡性口炎病毒腺、病毒[7,10]，為進一步研究抗病毒的物質基礎，我們還將繼續(xù)研究其化學成分，并重點關注生物堿，以期獲得具有較好抑制EBV裂解復制活性的化合物。本研究內容豐富了黑面神的化學成分信息，也在一定程度上為進一步開發(fā)其藥用價值提供了物質基礎和科學依據。