基于指紋圖譜及體外抗氧化活性試驗(yàn)的燈盞花標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)

李艷榮，杜義龍，趙勝男，王子怡，周維維,3，潘海峰*

1承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所；2河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3承德市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，承德 067000

燈盞花又名燈盞細(xì)辛，為菊科植物短葶飛蓬Erigeronbreviscapus(Vant.)Hand.-Mazz.的干燥全草，春秋兩季采收，收載于2020年版《中國(guó)藥典》一部，具有活血通絡(luò)止痛，祛風(fēng)散寒之功效[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，燈盞花具有神經(jīng)保護(hù)、心腦血管保護(hù)、抗氧化、抗癌、等藥理作用[2]。癌癥、心腦血管等疾病與機(jī)體內(nèi)過多的活性氧如超氧陰離子自由基、羥基自由基和脂質(zhì)自由基等導(dǎo)致的氧化損傷密切相關(guān)[3]。適當(dāng)服用抗氧化劑可以清除體內(nèi)過多的自由基，有利于人類的身體健康和疾病的預(yù)防控制[4,5]。文獻(xiàn)[6,7]表明燈盞花有很好的抗氧化活性。燈盞花化學(xué)成分復(fù)雜，化學(xué)成分與活性量效關(guān)系尚不十分清楚。中藥化學(xué)指紋圖譜因其能夠表征中藥所含的物質(zhì)成分，符合中醫(yī)藥理論的整體性和模糊性，已廣泛用于中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)[8]。但因其僅反映中藥的化學(xué)信息，未能與中藥療效間建立關(guān)系而使應(yīng)用越來越受到限制。2020年國(guó)家藥監(jiān)局藥審中心發(fā)布了《中藥生物效應(yīng)檢測(cè)研究技術(shù)指導(dǎo)(試行)》，倡導(dǎo)建立與活性相關(guān)的質(zhì)量控制方法以保證中藥在臨床應(yīng)用中的安全性和有效性。中藥“譜效關(guān)系”研究能使中藥活性成分整體特征表達(dá)與多指標(biāo)、多靶點(diǎn)的作用緊密聯(lián)系，可合理確定藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[9]，也符合中藥的作用特點(diǎn)。

中藥標(biāo)準(zhǔn)湯劑是經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化工藝制備而成的單味中藥飲片水煎劑，用于標(biāo)化臨床用藥，保障用藥的準(zhǔn)確性和計(jì)量的一致性[10]，作為衡量中藥配方顆粒是否與臨床湯劑基本一致的標(biāo)準(zhǔn)參照物。標(biāo)準(zhǔn)湯劑的提出，為實(shí)現(xiàn)基于中藥水煎液的劑型的質(zhì)量一致性、建立有效的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法提供了物質(zhì)基準(zhǔn)。本文以燈盞花標(biāo)準(zhǔn)湯劑為研究對(duì)象，以體外清除DPPH和ABTS自由基活性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其抗氧化作用，同時(shí)建立其HPLC指紋圖譜并測(cè)定總黃酮含量；采用雙變量相關(guān)性分析篩選出顯著相關(guān)的抗氧化成分，對(duì)篩選的成分進(jìn)行聚類分析(CA)和主成分分析(PCA)，進(jìn)一步利用正交偏最小二乘-判別分析(OPLS-DA)找出差異成分；對(duì)其抗氧化作用進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，以其為燈盞花及其制劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀(在線脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器和DAD檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫公司)；AG245電子分析天平(十萬分之一，梅特勒-托利多)；電子分析天平(千分之一，JA5003，天津天馬衡基儀器有限公司)HC-2062高速離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司)；紫外-可見分光光度計(jì)(島津UV-2600 probe)；上海亞榮旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52AA)；Thermo Fisher Scientific酶標(biāo)儀(美國(guó))。

1.2 試藥

DPPH(批號(hào)：464RB-GE，上海化成工業(yè)發(fā)展有限公司)；ABTS(批號(hào)：M0403A，澤浩公司)；陽性對(duì)照維生素C(Vc，批號(hào)：J1024A，澤浩公司)；過硫酸鉀(K2S2O8，天津歐博凱化工有限公司)；對(duì)照品咖啡酸(批號(hào)：110885-200102)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定院，綠原酸(批號(hào)161217)、洋薊素(批號(hào)17041106)、異綠原酸A(批號(hào)17061201)、燈盞花乙素(批號(hào)18032206)、異綠原酸B(批號(hào)17121201)、燈盞花甲素(批號(hào)18032802)、異綠原酸C(批號(hào)170824)均購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司，以上對(duì)照品均供含量測(cè)定用。乙腈、甲酸為色譜純，其他試劑為分析純，水為娃哈哈純凈水。

收集燈盞花藥材共16批，詳見表1。由河北民族師范學(xué)院董建新教授鑒定均為菊科植物短亭飛蓬Erigeronbreviscapus(Vant.)Hand.-Mazz.的干燥全草。

表1 16批燈盞花藥材產(chǎn)地信息

2 方法與結(jié)果

2.1 燈盞花標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備[10]

取燈盞花藥材100 g，加12倍蒸餾水浸泡30 min，一煎煮武火沸后文火煎煮30 min，趁熱過濾，二煎加10倍蒸餾水武火煮沸后文火煎煮20 min，趁熱過濾，合并兩次濾液，60 ℃水浴濃縮至500 mL，制得生藥濃度為0.2 g/mL的燈盞花標(biāo)準(zhǔn)湯劑。

2.2 燈盞花標(biāo)準(zhǔn)湯劑體外抗氧化活性的測(cè)定

2.2.1 陽性對(duì)照維生素C溶液的制備

取維生素C約50 mg，精密稱定，置10 mL量瓶，用蒸餾水溶解并定容，作為儲(chǔ)備液。取上述儲(chǔ)備液適量用蒸餾水稀釋成系列濃度的待測(cè)液，備用。

2.2.2 DPPH溶液的制備

精密稱定DPPH約12 mg置100 mL量瓶，用70%乙醇溶解并定容，備用。

2.2.3 ABTS溶液的制備

精密稱定ABTS 40 mg和K2S2O818 mg分別置10 mL量瓶，用蒸餾水制得ABTS和K2S2O8初始溶液。分別精密吸取2.5 mL的ABTS和K2S2O8初始溶液置100 mL容量，蒸餾水定容得ABTS溶液，避光12～16 h備用。

2.2.4 供試品溶液的制備

按“2.1”項(xiàng)下方法制備16批燈盞花標(biāo)準(zhǔn)湯劑，過濾取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.5 清除DPPH自由基能力的測(cè)定

取“2.2.4”項(xiàng)下供試品溶液，用蒸餾水制成系列濃度的溶液作為待測(cè)液。以維生素C為陽性對(duì)照，分別精密吸取50 μL的陽性對(duì)照和各批標(biāo)準(zhǔn)湯劑的待測(cè)液于96孔板，取系列各孔ABTS溶液加入量為100 μL，避光反應(yīng)6 min，734 nm處吸光度，其他及計(jì)算方法同“2.2.5”項(xiàng)下。計(jì)算對(duì)照維生素C和各待測(cè)液的ABTS清除率。

2.2.7 數(shù)據(jù)處理

計(jì)算半清除率IC50時(shí)，各提取液對(duì)自由基的清除率與濃度不呈線性關(guān)系，故本實(shí)驗(yàn)利用SPSS 19.0軟件中Probit方法進(jìn)行回歸分析，擬合得相應(yīng)的方程Probit(p)= Intercept + Bx，再通過卡方檢驗(yàn)后得到IC50值(Probit=0.50時(shí)提取液的濃度)。

2.3 燈盞花標(biāo)準(zhǔn)湯劑中總黃酮的含量測(cè)定

2.3.1 蘆丁對(duì)照品溶液的制備

取蘆丁對(duì)照品約10 mg，精密稱定用適量乙醇溶解，加蒸餾水稀釋并定容，得濃度為0.2 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備

分別取“2.2.4”項(xiàng)16批燈盞花標(biāo)準(zhǔn)湯劑200 μL，加入蒸餾水1 800 μL，搖勻即得供試品溶液。

我們使用了定焦鏡頭配合大光圈（f/1.8和f/2.8），確保前景或背景是模糊的。要想讓二者在構(gòu)圖中同時(shí)發(fā)揮作用，可以采用一反常規(guī)的做法，不把焦點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)人物讓背景模糊，而是對(duì)準(zhǔn)背景讓人物模糊。

2.3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取顯色后的蘆丁對(duì)照品溶液和供試品溶液(S001)使用紫外-可見分光光度計(jì)于400～650 nm波長(zhǎng)進(jìn)行掃描，光譜圖見圖1，結(jié)果顯示對(duì)照品溶液和供試品溶液顯色后在505 nm均有最大吸收，故選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為505 nm。

圖1 對(duì)照品蘆丁和燈盞花標(biāo)準(zhǔn)湯劑顯色后的光譜圖

2.3.4 線性關(guān)系考察

參照2020年版《中國(guó)藥典》一部中總黃酮的含量測(cè)定方法(亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法)顯色[11]。精密量取蘆丁對(duì)照品溶液0、1、2、3、4、5、6 mL分別置25 mL量瓶(記作1～7號(hào)瓶)，各加水至6 mL，加5%NaNO2溶液1 mL搖勻，放置6 min；加10% Al(NO3)3溶液1 mL搖勻，放置6 min；加NaOH試液10 mL，加水至刻度搖勻，放置15 min。以1號(hào)瓶為空白，測(cè)定505 nm下各吸光度A為縱坐標(biāo)(Y)，濃度(C，mg/mL)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：Y=12.8X-0.002 9，r=0.999 4，線性范圍為0.007 85～0.047 09 mg/mL。

2.3.5 精密度試驗(yàn)

精密量取蘆丁對(duì)照品溶液3 mL置25 mL量瓶，按“2.3.4”項(xiàng)下的方法，自“加水至6 mL”起依法顯色并測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定6次，記錄吸光度A，計(jì)算吸光度的RSD為0.59%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密吸取“2.2.4”項(xiàng)下燈盞花標(biāo)準(zhǔn)湯劑(S001)，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行制備6份，精密量取1 mL供試品溶液置25 mL量瓶，按“2.3.4”項(xiàng)下的方法，顯色并測(cè)定吸光度，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中總黃酮的含量，總黃酮含量的RSD為1.14%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取“2.3.4”項(xiàng)下燈盞花標(biāo)準(zhǔn)湯劑(S001)，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密量取1 mL供試品溶液置25 mL量瓶，按“2.3.2”項(xiàng)下的方法顯色，分別于顯色后0、5、10、15、25、30 min測(cè)定吸光度，計(jì)算吸光度的RSD為1.97%，表明供試品溶液顯色30 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知總黃酮含量的燈盞花標(biāo)準(zhǔn)湯劑(S001)100 μL，加入蘆丁對(duì)照品適量，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行制備6份，分別精密量取1 mL供試品溶液置25 mL量瓶，按“2.3.2”項(xiàng)下的方法顯色并測(cè)定吸光度并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表2。

表2 蘆丁的加樣回收率結(jié)果

2.3.9 燈盞花標(biāo)準(zhǔn)湯劑總黃酮的測(cè)定

取“2.3.2”項(xiàng)下各批供試品溶液1 mL按“2.3.4”項(xiàng)下方法顯色，測(cè)定其吸光度，帶入“2.3.4”項(xiàng)下回歸方程，計(jì)算各批標(biāo)準(zhǔn)湯劑總黃酮的含量。結(jié)果16批樣品總黃酮的含量分別為：8.30、7.77、6.79、5.35、8.53、8.59、5.35、5.70、7.52、11.3、2.85、7.36、7.93、8.02、7.48、9.62 mg/mL。

2.4 總黃酮含量與抗氧化之間的雙變量相關(guān)性分析

采用SPSS 19.0中的Person雙變量相關(guān)性分析計(jì)算16批樣品抗氧化活性(IC50，mg/mL)與總黃酮含量(mg/mL)的相關(guān)系數(shù)，結(jié)果DPPH IC50和ABTS IC50與總黃酮的相關(guān)系數(shù)分別為-0.718和-0.841，表明燈盞花標(biāo)準(zhǔn)湯劑總黃酮的含量和抗氧化活性(IC50)之間在0.01水平(雙側(cè))顯著相關(guān)(P<0.01)，且為負(fù)相關(guān)。結(jié)果表明燈盞花標(biāo)準(zhǔn)湯劑對(duì)DPPH和ABTS自由基有一定的清除能力，且清除ABTS自由基的能力更強(qiáng)；總黃酮含量高的樣品抗氧化能力強(qiáng)。

2.5 燈盞花標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜的建立

2.5.1 供試品溶液的制備

精密吸取“2.2.4”項(xiàng)下各燈盞花標(biāo)準(zhǔn)湯劑1 mL置10 mL量瓶用蒸餾水定容；精密吸取上述溶液1 mL置離心管，精密加入1 mL 20%的乙腈混勻，12 000 r/min離心10 min，上清液過0.45 μm微孔濾膜作為供試品溶液。

2.5.2 對(duì)照品溶液的制備

分別取各對(duì)照品適量，精密稱定，用甲醇溶解分別制成含綠原酸、咖啡酸、洋薊素、燈盞花乙素、異綠原酸B、燈盞花甲素、異綠原酸A和異綠原酸C分別為877、204、713、1053、683、645、627、913 μg/mL的貯備液。分別精密吸取各儲(chǔ)備液分別制成含綠原酸、咖啡酸、洋薊素、燈盞花乙素、異綠原酸B、燈盞花甲素、異綠原酸A和異綠原酸C分別為21.93、3.40、3.56、78.98、6.83、6.45、15.68、22.83 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.5.3 色譜條件

Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.1%甲酸水為流動(dòng)相B，按表3中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為：(0～9 min，252 nm；9～60 min，330 nm)；流速為0.8 mL/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

表3 流動(dòng)相的梯度洗脫程序

2.5.4 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：取S001號(hào)標(biāo)準(zhǔn)湯劑按“2.5.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，采用“2.2”項(xiàng)下色譜方法連續(xù)進(jìn)樣6針。以綠原酸為參比峰，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于1.6%，方法精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取S001號(hào)標(biāo)準(zhǔn)湯劑按“2.5.1”項(xiàng)下方法平行制備6份，按“2.4”項(xiàng)下色譜方法進(jìn)樣。以綠原酸為參比峰，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于1.8%，方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取S001號(hào)標(biāo)準(zhǔn)湯劑按照“2.5.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣。以綠原酸為參比峰，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于2.0%，供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.5 HPLC指紋圖譜的建立與共有峰的確認(rèn)

將16批燈盞花湯劑按“2.5.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液進(jìn)行HPLC測(cè)定，分別記錄各批的色譜圖，將各批AIA格式的色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng) 2012版》評(píng)價(jià)軟件，以S001為參照?qǐng)D譜，采用“中位數(shù)法”生成對(duì)照?qǐng)D譜，共生成21個(gè)共有峰，經(jīng)對(duì)照品比對(duì)6、9、10、13、14、15、18、19分別是綠原酸、咖啡酸、洋薊素、燈盞花乙素、異綠原酸B、燈盞花甲素、異綠原酸A和異綠原酸C。16批樣品的疊加圖、對(duì)照指紋圖譜和混合對(duì)照品溶液的色譜圖見圖2、圖3和圖4。

圖2 16批燈盞花標(biāo)準(zhǔn)湯劑的疊加色譜圖

圖3 燈盞花標(biāo)準(zhǔn)湯劑對(duì)照指紋圖譜

圖4 混合對(duì)照品溶液色圖譜

2.5.6 相似度評(píng)價(jià)

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng) 2012A版》評(píng)價(jià)軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果16批燈盞花標(biāo)準(zhǔn)湯劑的相似度分別為：0.993、0.962、0.955、0.965、0.966、0.992、0.961、0.968、0.993、0.993、0.964、0.975、0.982、0.855、0.991、0.770，相似度有一定差異。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析

2.6.1 雙變量相關(guān)性分析法篩選燈盞花標(biāo)準(zhǔn)湯劑體外抗氧化活性物質(zhì)

16批燈盞花標(biāo)準(zhǔn)湯劑DPPH和ABTS的IC50值結(jié)果見表4。以共有峰峰面積為自變量，以DPPH和ABTS的IC50值為抗氧化活性指標(biāo)作為因變量，采用SPSS19.0進(jìn)行皮爾森(Pearson)雙變量相關(guān)性分析，篩選出與清除DPPH自由基顯著相關(guān)(P<0.05)的共有峰10個(gè)(記作“DPPH組”)：峰3、4、6(綠原酸)、7、11、13(燈盞花乙素)、14(異綠原酸B)、15(燈盞花甲素)、17和19(異綠原酸C)；與清除ABTS自由基顯著相關(guān)的色譜峰13個(gè)(記作“ABTS組”)：與清除ABTS自由基顯著相關(guān)的色譜峰13個(gè)：峰3、4、6、7、8、11、13、14、15、16、17、18(異綠原酸A)和19。結(jié)果見表5。

表4 不同批次的燈盞花標(biāo)準(zhǔn)湯劑的抗氧化活性

表5 燈盞花標(biāo)準(zhǔn)湯劑共有峰與抗氧化作用指標(biāo)的相關(guān)性分析結(jié)果

2.6.2 聚類分析(CA)

利用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分別將篩選出的“DPPH組”色譜峰和總黃酮含量數(shù)據(jù)、“ABTS組”色譜峰和總黃酮含量數(shù)據(jù)為變量，采用聚類方法為最遠(yuǎn)鄰元素，度量標(biāo)準(zhǔn)為區(qū)間平方Euclidean距離，對(duì)燈盞花標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品進(jìn)行聚類分析。聚類結(jié)果基本一致，樹狀圖分別見圖5和圖6。當(dāng)類間距大于10時(shí)分為兩類，即野生的S014和S016分為一類，其余14批種植的分為一類。推測(cè)可能與燈盞花的生長(zhǎng)環(huán)境(光照、海拔、經(jīng)緯度)、采收期等因素有關(guān)。

圖5 DPPH組聚類樹狀圖

圖6 ABTS組聚類樹狀圖

2.6.3 主成分分析(PCA)及樣品綜合得分的計(jì)算

利用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分別將篩選出的“DPPH組”色譜峰面積和總黃酮含量、“ABTS組”色譜峰面積和總黃酮含量為變量進(jìn)行主成分分析，并進(jìn)行KMO檢驗(yàn)及Bartlett球形檢驗(yàn)。其中“DPPH組”“ABTS組”的KMO度量值分別為0.625、0.583，Bartlett球形檢驗(yàn)結(jié)果P值均小于0.001，提示各變量之間存在顯著的相關(guān)性，可進(jìn)行主成分分析。按照特征值>1的原則分別提取主成分，“DPPH組”提取3個(gè)主成分，初始特征值累積貢獻(xiàn)率為92.457%，第一個(gè)主成分特征值為7.920，貢獻(xiàn)率為71.99%；第二主成分特征值為1.235，貢獻(xiàn)率為11.23%；第三主成分特征值為1.015，貢獻(xiàn)率為9.227%。“ABTS組”提取3個(gè)主成分，初始特征值累積貢獻(xiàn)率為91.896%，第一個(gè)主成分特征值為9.807，貢獻(xiàn)率為70.05%；第二主成分特征值為1.847，貢獻(xiàn)率為13.19%；第三主成分特征值為1.212，貢獻(xiàn)率為8.657%。根據(jù)公式Fi=Zx×A計(jì)算各主成分得分，其中A為特征向量矩陣，Zx為標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)矩陣。結(jié)合各成分的貢獻(xiàn)率，建立評(píng)分模型：FDPPH=0.7199F1+0.1123F2+0.09927F3，F(xiàn)ABTS=0.7005F1+0.1319F2+0.08657F3。各主成分得分、綜合得分及排序見表6。由表6，兩組的評(píng)分結(jié)果相似，野生的2批藥材排分比較靠前且清除DPPH自由基和ABTS自由基的能力較強(qiáng)。將上述分析變量分別導(dǎo)入SPSS 19.0軟件，進(jìn)行主成分分析。主成分二維得分圖分別見圖7和圖8。樣品均被分成兩組，野生的S014和S016分成一組，其余14批分成一組，主成分分析與聚類分析結(jié)果基本一致。

圖7 DPPH組主成分得分圖

圖8 ABTS組主成分得分圖

表6 燈盞花標(biāo)準(zhǔn)湯劑主成分得分及排序

2.6.4 正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)

為了更好地觀察樣品間的組間差異，在主成分分析的基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行有監(jiān)督的OPLS-DA分析，將“DPPH組”色譜峰面積和總黃酮含量數(shù)據(jù)、“ABTS組”色譜峰面積和總黃酮含量數(shù)據(jù)為變量導(dǎo)入SIMCA14.1軟件，獲得相應(yīng)的模型。由模型驗(yàn)證參數(shù)可知，“DPPH組”和“ABTS組”模型的穩(wěn)定性好、交叉驗(yàn)證預(yù)測(cè)力較高(DPPH組：R2X=0.921，R2Y=0.666，Q2=0.457；ABTS組：R2X=0.914，R2Y=0.660，Q2=0.459)?！癉PPH組”和“ABTS組”的OPLS-DA得分圖見圖9和圖10。采用OPLS-DA變量重要性投影值(VIP)篩選出差異性質(zhì)量標(biāo)志物。95%置信區(qū)間內(nèi)，VIP>1的成分在分類中起重要作用[12,13]，“DPPH組”和“ABTS組”變量重要性投影值(VIP)結(jié)果見圖11和圖12。“DPPH組”中峰11、15、14和峰13是VIP>1說明這幾個(gè)色譜峰是燈盞花標(biāo)準(zhǔn)湯劑清除DPPH自由基的差異性標(biāo)志物；“ABTS組”中峰11、15、14和峰19 VIP>1說明這幾個(gè)色譜峰是燈盞花標(biāo)準(zhǔn)湯劑除ABTS自由基的差異性標(biāo)志物。

圖9 DPPH組OPLS-DA得分圖

圖10 ABTS組OPLS-DA得分圖

圖1 DPPH組變量重要性投影值(VIP)

圖12 ABTS組變量重要性投影值(VIP)

3 討論

DPPH和ABTS自由基經(jīng)常作為衡量活性成分體外抗氧化活性的指標(biāo)，DPPH法通過與具有孤對(duì)電子的物質(zhì)結(jié)合來測(cè)定藥材的抗氧化能力，ABTS法通過與親水性和親脂性物質(zhì)結(jié)合來測(cè)定抗氧化能力[14]。燈盞花的主要活性成分包括黃酮類化合物[15]，本文測(cè)定了16批燈盞花標(biāo)準(zhǔn)湯劑的總黃酮含量為2.85～11.28 mg/mL，以清除DPPH和ABTS自由基為抗氧化指標(biāo)評(píng)價(jià)了其體外抗氧化活性，DPPH的IC50值為1.00～3.39 mg/mL，對(duì)ABTS的IC50值為0.254～2.16 mg/mL，表明燈盞花標(biāo)準(zhǔn)湯劑清除ABTS自由基的能力強(qiáng)于清除DPPH自由基。采用Pearson雙變量相關(guān)性分析，表明2種體外抗氧化活性(IC50值)與總黃酮的含量顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.714和-0.841，即IC50值越小、總黃酮含量越高提取液的抗氧化能力越強(qiáng)。故總黃酮的含量是影響燈盞花抗氧化強(qiáng)弱的指標(biāo)之一，可作為評(píng)價(jià)燈盞花抗氧化強(qiáng)弱的指標(biāo)。

在指紋圖譜建立過程中，實(shí)驗(yàn)考察了Agilent ZORBAX-SB C18、Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18、Agilent Extend C18色譜柱，根據(jù)色譜峰個(gè)數(shù)、分離程度等比較得出Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18效果較好；考察了不同流速(0.8、1、1.2 mL/min)，結(jié)果0.8 mL/min分離效果比較好；考察了不同梯度的0.1%甲酸水-甲醇、0.1%甲酸水-乙腈兩元系統(tǒng)、0.1%甲酸水-乙腈-四氫呋喃三元系統(tǒng)，得出0.1%甲酸水-乙腈-四氫呋喃的分離效果更好，且基線較為平穩(wěn)；篩選200～400 nm檢測(cè)波長(zhǎng)，結(jié)果不同時(shí)間段變化波長(zhǎng)得到的色譜峰多且基線平穩(wěn)，最終確定0～9 min是252 nm，9～60 min是330 nm。

近幾年文獻(xiàn)對(duì)燈盞花藥材指紋圖譜的研究多采用HPLC法，對(duì)指紋圖譜進(jìn)行了相似度評(píng)價(jià)和共有峰的確定[16-20]；文獻(xiàn)[16-18]對(duì)指紋圖譜采用CA和PCA進(jìn)行了化學(xué)模式識(shí)別，對(duì)藥材進(jìn)行了分類，但未對(duì)差異性原因進(jìn)行深入分析。本文前期燈盞花藥材指紋圖譜[18]的基礎(chǔ)上建立了燈盞花標(biāo)準(zhǔn)湯劑的指紋圖譜，相似度為0.770～0.993，得到21個(gè)共有峰，用對(duì)照品指認(rèn)出8個(gè)已知成分。本文采用雙變量相關(guān)性分析篩選出峰3、4、6(綠原酸)，峰7、11、13(燈盞花乙素)，峰14(異綠原酸B)，峰15(燈盞花甲素)，峰17、19(異綠原酸C)10個(gè)色譜峰與清除DPPH自由基能力顯著負(fù)相關(guān)(即共有峰峰面積越大IC50值越小)，Person相關(guān)系數(shù)分別為：-0.552、-0.733、-0.626、-0.665、-0.537、-0.518、-0.767、-0.754、-0.541和-0.748，表明所對(duì)應(yīng)化學(xué)物質(zhì)是清除DPPH自由基的主要活性成分。峰3、4、6、7、8、11、13、14、15、16、17、18(異綠原酸A)和19共13個(gè)色譜峰與清除ABTS自由基顯著負(fù)相關(guān)，Person相關(guān)系數(shù)為：-0.594、-0.861、-0.761、-0.829、-0.645、-0.583、-0.676、-0.721、-0.740、0.574、-0.652、-0.720和-0.518，對(duì)應(yīng)物質(zhì)是清除ABTS自由基的主要活性成分。兩種抗氧化方法測(cè)定的抗氧化活性(IC50值)均與已知成分綠原酸、燈盞花乙素、異綠原酸B、燈盞花甲素和綠原酸C顯著相關(guān)，提示這5種成分是燈盞花抗氧化的主要活性物質(zhì)。

試驗(yàn)以篩選出的DPPH顯著相關(guān)的10個(gè)共有峰和總黃酮含量為變量，ABTS顯著相關(guān)的13個(gè)共有峰和總黃酮含量為變量分別進(jìn)行CA和PCA分析，均將樣品分成兩類，即野生的S014和S016為一類，其余14批種植的為一類。推測(cè)可能與燈盞花的生長(zhǎng)環(huán)境(光照、海拔、經(jīng)緯度等)、采收期等因素有關(guān)。同時(shí)，以這些成分為變量建立了燈盞花標(biāo)準(zhǔn)湯劑的評(píng)分模型，16批標(biāo)準(zhǔn)湯劑的得分排序與體外抗氧化活性強(qiáng)弱排序基本一致。筆者在CA和PCA的基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行OPLS-DA分析，找出了與清除DPPH自由基相關(guān)的4個(gè)主要差異成分：峰11、15(燈盞花甲素)、14(異綠原酸B)和峰13(燈盞花乙素)；與清除ABTS自由基相關(guān)的4個(gè)主要差異成分：峰11、15、14和峰8(燈盞花乙素)。研究結(jié)果提示在控制燈盞花質(zhì)量時(shí)，應(yīng)在控制含量較高的燈盞花乙素(即野黃芩苷)[1]的基礎(chǔ)上，應(yīng)適當(dāng)增加其他藥效活性較強(qiáng)的質(zhì)控指標(biāo)。

綜上，本研究將化學(xué)指紋圖譜與生物活性評(píng)價(jià)相結(jié)合，通過譜效相關(guān)性研究，初步探討了燈盞花標(biāo)準(zhǔn)湯劑的抗氧化活性成分，所建立的方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果可靠，可為進(jìn)一步研究燈盞花的藥理作用及質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。后續(xù)可以加大樣本量，采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)湯劑未知成分的共有峰進(jìn)行指認(rèn)、藥理活性及綜合多種藥理活性的譜效關(guān)系研究，為燈盞花的質(zhì)量研究提供依據(jù)。