三烏膠提取物水凝膠的制備及其對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療作用研究

肖素蕓，羅才琴，呂 冬，王承瀟，崔秀明, 3*

·藥劑與工藝·

三烏膠提取物水凝膠的制備及其對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療作用研究

肖素蕓1, 2，羅才琴1, 2，呂 冬1, 2，王承瀟1, 2，崔秀明1, 2, 3*

1. 昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500 2. 云南省三七資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500 3. 國(guó)家中藥材產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系昆明綜合試驗(yàn)站，云南 昆明 650500

制備三烏膠提取物水凝膠并進(jìn)行表征及考察其對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療作用。采用Franz池法考察三烏膠提取物中二苯乙烯苷、苯甲酰新烏頭堿、8-去乙酰滇烏堿、去乙酰粗莖烏頭堿甲、草烏甲素和大黃素的體外滲透效果，制備出三烏膠提取物水凝膠并對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行表征；同時(shí)，建立膠原誘導(dǎo)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（collagen-induced rheumatoid arthritis，CIA）大鼠模型，研究經(jīng)皮遞送模式下三烏膠提取物對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療作用。制備的三烏膠提取物水凝膠在常規(guī)情況下始終保持凝膠狀態(tài)；并且其三維交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可使藥物更好的持續(xù)性地釋放，從而達(dá)到緩釋效果。體內(nèi)藥理實(shí)驗(yàn)表明，三烏膠提取物水凝膠顯著降低CIA大鼠的足厚度、足體積、關(guān)節(jié)炎指數(shù)水平和血清中類風(fēng)濕因子（rheumatoid factor，RF）、C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）和B細(xì)胞淋巴瘤因子-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）的水平及升高Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）水平；與口服相比，水凝膠能降低谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、肌酐和尿素氮水平和臟器病變程度。采用經(jīng)皮遞送的局部給藥模式，三烏膠提取物在保留治療作用的同時(shí)降低了由于口服給藥引起的臟器毒性，為今后三烏膠提取物外用制劑的研究提供了可能性。

三烏膠提取物；水凝膠；經(jīng)皮藥物遞送；體外滲透；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；生物毒性；二苯乙烯苷；苯甲酰新烏頭堿；8-去乙酰滇烏堿；去乙酰粗莖烏頭堿甲；草烏甲素；大黃素；類風(fēng)濕因子；C反應(yīng)蛋白；B細(xì)胞淋巴瘤因子-2；Bcl-2相關(guān)X蛋白；谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶；肌酐；尿素氮

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以滑膜增生和慢性炎癥為特征的慢性全身性自身免疫性疾病[1]。RA的主要癥狀是炎癥、關(guān)節(jié)腫脹、伴隨關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行性損傷，甚至功能障礙[2-4]。目前臨床上RA的主要治療藥物是疾病修飾抗風(fēng)濕藥物（disease modifying antirheumatic drugs，DMARDs），但是副作用較為明顯，長(zhǎng)期或大劑量服用會(huì)損傷胃腸道和產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)，甚至肝腎功能異常和骨髓抑制[5-6]，因此，開(kāi)發(fā)抗RA的天然藥物尤為重要。

臨床上常用烏頭類中藥及炮制品治療風(fēng)濕類疾病。三烏膠丸是云南黑藥的代表品種之一，由黃草烏Kom、川烏Debx.、何首烏Thunb、附片（黑順片）Debx和白附子Engl組成；其主要用于風(fēng)寒濕邪、風(fēng)痰、瘀血引起的風(fēng)濕麻木、中風(fēng)偏癱、口眼歪斜及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、RA等[7-8]。有關(guān)研究表明，三烏膠丸中烏頭堿類成分能夠影響細(xì)胞的增殖和凋亡，且具有免疫調(diào)節(jié)特性，可能是治療自身免疫性疾病的潛在有效藥物[9-10]，但其原料藥對(duì)臟器具有毒性作用[11-13]。因此，為提高三烏膠丸用藥安全性，對(duì)其傳統(tǒng)口服給藥治療方式進(jìn)行改良，針對(duì)其局部病癥的特點(diǎn)，尋找一種能維持血藥濃度相對(duì)穩(wěn)定的給藥方式具有重要意義。

經(jīng)皮給藥系統(tǒng)（transdermal drug delivery，TDDS）具有避免肝腸首過(guò)效應(yīng)、提高用藥安全、提高患者依從性和維持血藥濃度穩(wěn)定性等特點(diǎn)，其中新型載體水凝膠不僅能夠滿足三烏膠提取物的給藥需求，而且能增加水難溶性藥物的溶解度，其交聯(lián)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)能延長(zhǎng)藥物滯留時(shí)間，從而達(dá)到緩釋作用[14-15]。據(jù)此，本研究首先考察了三烏膠提取物中6種指標(biāo)性成分的體外滲透能力，以皮膚透過(guò)量為指標(biāo)，對(duì)三烏膠提取物溶劑種類和促滲劑用量進(jìn)行篩選；基于此，制備三烏膠提取物水凝膠并對(duì)其進(jìn)行表征，同時(shí)采用膠原誘導(dǎo)型RA大鼠為模型，進(jìn)一步評(píng)估三烏膠提取物水凝膠經(jīng)皮遞送對(duì)RA的治療效果和生物毒性，為三烏膠丸后續(xù)深入研究提供新的研究思路和策略。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-2030Plus型高效液相色譜儀，日本島津公司；梅特勒AL-104型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；KQ5200E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；RYJ-12B型Franz擴(kuò)散試驗(yàn)儀，上海黃海藥檢儀器有限公司；UPT-I-20T型優(yōu)普系列超純水器，成都超純科技有限公司；RCT基型磁力攪拌加熱器，德國(guó)艾卡有限公司；SM600型酶標(biāo)儀，上海永創(chuàng)醫(yī)療器械有限公司；DMO-412型低速離心機(jī)，美國(guó)Scilogex公司；SU8100型掃描電子顯微鏡（SEM），日本Hitachi公司。

1.2 藥品與試劑

三烏膠提取物是參照云南金烏黑藥制藥有限公司優(yōu)化后的煎煮制備流程，并按照三烏膠丸處方比例，將9 g黃草烏、6 g川烏、1.5 g黑順片、4.5 g何首烏和3 g生白附子提取制備成干浸膏，相當(dāng)于原生藥1.71 g/g；對(duì)照品二苯乙烯苷（2,3,5,4′- tetrahydroxy stilbene 2--β--glucoside，TSG，批號(hào)Yz021521）、苯甲酰新烏頭堿（benzoylmesaconine，BMA，批號(hào)wkq20041701）、8-去乙酰滇烏堿（8- deacetylyunaconitine，8-DCA，批號(hào)Yz0201221）、草烏甲素（crassicauline A，批號(hào)Yz042122）、大黃素（emodin，批號(hào)Yz080920），質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為98%，購(gòu)自南京源植生物科技有限公司；對(duì)照品去乙酰粗莖烏頭堿甲（sinapic acid crassicauline，SAC，批號(hào)19112201），質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%，購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司；二甲基甲酰胺（,- dimethylformamide，DMF，批號(hào)D111999）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批號(hào)），均購(gòu)自上海百舜生物科技有限公司；聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG），批號(hào)8598479，購(gòu)自武漢卡諾斯科技有限公司；聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP），批號(hào)20190404，購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠；羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na），批號(hào)20180718，購(gòu)自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；甲氨蝶呤（批號(hào)RH221275）、牛II型膠原蛋白（CII，批號(hào)L22S11C125306）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；完全弗氏佐劑（CFA，批號(hào)SLCH4887）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；類風(fēng)濕因子（rheumatoid factor，RF，批號(hào)202109）、C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP，批號(hào)202109）、B細(xì)胞淋巴瘤因子2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2，批號(hào)202109）和Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax，批號(hào)202109）的試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST，批號(hào)C010-2-1）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT，批號(hào)C009-2-1）、肌酐（批號(hào)C011-2-1）和尿素氮（批號(hào)C013-2-1）的試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；所用的化學(xué)藥品和試劑都是分析純級(jí)別。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（湘）2019- 0004，體質(zhì)量160～200 g。動(dòng)物在恒定的室溫（25 ℃，相對(duì)濕度70%～75%）下飼養(yǎng)。所有動(dòng)物研究經(jīng)昆明理工大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為PZWH（滇）K2021-0004。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取物中6種指標(biāo)性成分分析方法的建立

2.1.1 色譜條件 參考本課題組前期發(fā)表的文獻(xiàn)方法[16]。色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.2%二乙胺（磷酸調(diào)節(jié)pH為4.0）水溶液-乙腈，流動(dòng)相梯度為0～15 min，10%～20%乙腈；15～45 min，20%～40%乙腈；45～55 min，40%～70%乙腈；55～70 min，70%乙腈；體積流量為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為25 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為245 nm；柱溫為30 ℃；理論塔板數(shù)按照所有峰計(jì)算均不低于3000。

2.1.2 線性關(guān)系考察 精密稱取TSG、BMA、8- DCA、SAC、草烏甲素、大黃素各適量，用酸性甲醇溶液制成質(zhì)量濃度分別為700、800、700、800、500、200 μg/mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液；分別精密移取混合對(duì)照品溶液加酸性甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列混合對(duì)照品溶液。照“2.1.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行HPLC檢測(cè)，以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），峰面積值為縱坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸，得回歸方程分別為TSG＝11 727 831.648 4－57 860.619 3，＝0.999 1，線性范圍0.007～70.000 μg/mL；BMA＝9 523 875.004 0－21 540.034 1，＝0.999 8，線性范圍0.008～80.000 μg/mL；8-DCA＝14 880 359.851 2－24 512.274 0，＝0.999 9，線性范圍0.007～70.000 μg/mL；SAC＝22 665 612.465 5－42 921.655 5，＝0.999 9，線性范圍0.008～80.000 μg/mL；草烏甲素＝30 000 947.232 9－42 758.540 0，＝0.999 8，線性范圍0.005～50.000 μg/mL；大黃素＝41 750 102.139 7－21 304.199 6，＝0.999 9，線性范圍0.002～20.000 μg/mL。

2.1.3 供試品溶液的配制 取各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的透皮接收液，吹干，殘?jiān)蛹状级ㄈ葜? mL，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得透皮供試品溶液。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取6種指標(biāo)性成分的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液25 μL，照上述色譜條件測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣6次，進(jìn)行精密度試驗(yàn)，結(jié)果TSG、BMA、8-DCA、SAC、草烏甲素、大黃素峰面積的RSD分別為1.08%、1.19%、0.75%、1.06%、0.19%、0.49%，結(jié)果表明儀器系統(tǒng)精密度良好。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取6份同一時(shí)間點(diǎn)的透皮供試品溶液25 μL，照上述色譜條件測(cè)定，進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果TSG、BMA、8-DCA、SAC、草烏甲素、大黃素質(zhì)量濃度的RSD分別為0.80%、0.92%、0.70%、0.94%、1.25%、1.07%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取透皮供試品溶液，分別于制備后0、2、4、6、12、24 h進(jìn)行HPLC測(cè)定，進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，結(jié)果TSG、BMA、8-DCA、SAC、草烏甲素、大黃素峰面積的RSD分別為0.77%、1.08%、1.66%、0.75%、1.75%、0.80%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密取6種指標(biāo)性成分含量已測(cè)定的透皮供試品溶液25 μL，加入適量混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，進(jìn)HPLC測(cè)定6種指標(biāo)性成分的總含量，計(jì)算得平均加樣回收率，結(jié)果TSG、BMA、8-DCA、SAC、草烏甲素、大黃素的平均加樣回收率分別為96.96%、97.50%、96.43%、99.57%、96.71%、95.38%，RSD分別為2.44%、1.62%、1.74%、1.86%、1.35%、2.39%，結(jié)果表明該方法的加樣回收率良好。

2.1.8 樣品測(cè)定 精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液、透皮供試品溶液、空白溶劑各25 μL，按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，結(jié)果表明該方法專屬性良好，HPLC圖見(jiàn)圖1。

1-TSG 2-BMA 3-8-DCA 4-SAC 5-草烏甲素 6-大黃素

2.2 數(shù)據(jù)處理與分析

2.3 提取物溶解度的測(cè)定

分別稱取1.2 g提取物加入5種不同的溶劑10 mL，超聲處理（功率300 W、頻率40 kHz、水溫40 ℃以下）2 h，放冷，12 000 r/min離心（離心半徑為6.3 cm）10 min，取上清液，吹干，加入1 mL酸性甲醇，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行HPLC測(cè)定，考察5種不同溶劑對(duì)提取物中6種指標(biāo)性成分溶解度的影響，結(jié)果如表1所示，TSG、8-DCA、SAC、草烏甲素和大黃素在10%乙醇中溶解度最高，BMA在水溶液中溶解度最高。綜合可知，提取物中6種指標(biāo)性成分溶解度總和在10%乙醇中最高，分別為40.41、60.01、25.72、12.62、5.84、1.71 μg/mL。

2.4 體外透皮試驗(yàn)

2.4.1 溶劑考察 分別取1.2 g提取物加入10 mL 5種不同的溶劑，超聲處理（功率300 W、頻率40 kHz、水溫40 ℃以下）2 h，放冷，12 000 r/min離心（離心半徑為6.3 cm）10 min，取上清液，即得供給池溶液。參考有關(guān)文獻(xiàn)方法[17]進(jìn)行離體鼠皮的制備和體外透皮實(shí)驗(yàn)，以pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）為接收液，轉(zhuǎn)速約600 r/min，保持透皮儀內(nèi)溫度恒定為37 ℃，接收池體積為7 mL，透皮擴(kuò)散面積2.8 cm2。在24 h時(shí)取1.0 mL接收液樣品，離心、濾過(guò)，取上清液，通過(guò)“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行分析，根據(jù)6種指標(biāo)性成分的峰面積，計(jì)算透皮供試品溶液中各成分藥物質(zhì)量濃度，并按公式計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)6種指標(biāo)性成分的皮膚透過(guò)量（Δ）。

表1 不同溶劑下6種指標(biāo)性成分的溶解度(, n = 3)

Table 1 Solubility of six index components in different solvents (, n = 3)

溶劑溶解度/(μg?mL?1) TSGBMA8-DCASAC草烏甲素大黃素總和 水37.01±0.84b60.77±0.45a24.46±0.18a12.16±0.73a5.69±0.17ab1.68±0.07a141.76±0.61b 10%乙醇40.41±0.64a60.01±0.48a25.72±0.25a12.62±0.81a5.84±0.11a1.71±0.10a146.31±1.81a DMSO40.06±0.34a59.53±0.52a19.32±0.28b11.42±0.58a4.07±0.19d1.54±0.18b135.94±1.40c DMF39.36±0.95b51.43±0.49b17.50±0.22b12.38±0.69a5.11±0.16c1.53±0.12b127.31±1.19d PEG35.16±0.84c27.73±0.33c12.53±0.16c8.78±0.21b5.40±0.15bc1.54±0.12b91.14±1.75e

不同字母表示相同指標(biāo)不同處理差異顯著（＜0.05），下表同

different letters indicate that the same index is significantly different from different treatments(< 0.05), same as below tables

Δ＝CV/e

C為某一時(shí)間點(diǎn)透皮接收液中的藥物質(zhì)量濃度，為接收液的體積，e為擴(kuò)散池的有效面積

由表2可知，提取物中6種指標(biāo)性成分的皮膚滲透作用在不同溶劑中呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律，如TSG、BMA、SAC和大黃素的Δ在10%乙醇中最多，而8-DCA在DMSO中最多；因此本研究以6種指標(biāo)性成分Δ的總和來(lái)確定提取溶劑。結(jié)果表明采用10%乙醇作為溶劑時(shí)Δ最高，因此，選擇10%乙醇作為提取溶劑進(jìn)行后續(xù)研究。

2.4.2 促滲劑用量考察 根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇氮酮作為促滲劑。采用“2.4.1”項(xiàng)下方法，對(duì)氮酮用量進(jìn)行考察。結(jié)果如表3所示，在3%氮酮作用下，有效成分的Δ均相對(duì)較高，比10%乙醇提高約2倍。根據(jù)上述研究，在10%乙醇作為溶劑和3%氮酮作為促滲劑的情況下，提取物具有較強(qiáng)的經(jīng)皮滲透能力。

2.5 提取物水凝膠的制備

選擇以上條件制備水凝膠。參考文獻(xiàn)報(bào)道的方法[18]，取1.2 g提取物，加入10 mL 10%乙醇溶液，超聲離心，得上清液并濃縮為2 g，再加入氮酮0.06 g，即得提取物10%乙醇儲(chǔ)備液。精密稱取0.15 g PVP置于50 mL燒杯中，每份加入0.2 g CMC-Na，混合均勻后，加入0.5 g甘油，加入5 mL去離子水，室溫放置溶脹12 h后，制得空白基質(zhì)；隨后取提取物10%醇儲(chǔ)備液，與空白基質(zhì)混合均勻，補(bǔ)足去離子水至凝膠體系為10 g，即得提取物水凝膠，水凝膠制備流程圖見(jiàn)圖2-A，水凝膠示意圖見(jiàn)圖2-B。

表2 不同溶劑下6種指標(biāo)性成分的ΔM(, n = 3)

Table 2 ΔM of six index components in different solvents (, n = 3)

溶劑ΔM/(μg?cm?2) TSGBMA8-DCASAC草烏甲素大黃素總和 水1.23±0.16ab2.15±0.30a0.31±0.10b0.29±0.02b0.16±0.02a0.22±0.03ab4.36±0.63b 10%乙醇1.56±0.32a2.20±0.13a0.38±0.07b0.58±0.03a0.17±0.01a0.27±0.04a5.16±0.56a DMSO0.82±0.22bc1.08±0.26b0.29±0.02a0.11±0.01c0.16±0.01b0.17±0.01ab2.63±0.47c DMF1.05±0.12cd0.89±0.12b0.78±0.04b0.18±0.01c0.13±0.01a0.22±0.01b3.25±0.10c PEG0.63±0.09a0.13±0.03c0.44±0.03b0.02±0.00d0.04±0.00c0.06±0.00c1.32±0.11d

表3 不同用量的氮酮對(duì)6種指標(biāo)性成分的ΔM(, n = 3)

Table 3 ΔM of six index components by different concentrations of azone (, n = 3)

用量/%ΔM/(μg?cm?2) TSGBMA8-DCASAC草烏甲素大黃素總和 11.20±0.07a4.83±0.05c0.46±0.01d0.98±0.07bc0.35±0.06b0.20±0.06b8.02±0.13b 21.31±0.04a5.22±0.07ab0.53±0.04c0.95±0.06c0.43±0.06ab0.25±0.06b8.69±0.16b 31.53±0.08a5.83±0.77a0.68±0.06a1.41±0.11a0.51±0.11a0.32±0.06a10.28±0.90a 41.49±0.09b5.19±0.73b0.61±0.01b1.09±0.04b0.44±0.04ab0.24±0.07b9.06±0.91b 51.43±0.02b5.23±0.66b0.56±0.03bc1.07±0.05bc0.23±0.05c0.25±0.02b8.77±0.65b

圖2 提取物水凝膠制備流程圖(A) 和示意圖(B)

2.6 提取物水凝膠中6種指標(biāo)性成分含量的測(cè)定

按“2.5”項(xiàng)下方法制備3批提取物水凝膠溶解于10 mL超純水中，12 000 r/min離心（離心半徑為6.3 cm）10 min，濾過(guò)，吹干，加入1 mL酸性甲醇，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，進(jìn)行HPLC檢測(cè)。結(jié)果表明，6種指標(biāo)性成分TSG、BMA、8-DCA、SAC、草烏甲素和大黃素的質(zhì)量濃度分別為（25.53±0.52）、（58.01±6.80）、（12.46±0.33）、（11.62±0.81）、（5.26±0.31）、（1.42±0.09）μg/mL。

2.7 提取物水凝膠的表征

2.7.1 pH值的測(cè)定 取3批提取物水凝膠，分別稱取1 g置于小燒杯中，并加入25 mL水稀釋，分別測(cè)定其pH值。結(jié)果pH值分別為5.60、5.65、5.55，與皮膚pH值相接近，刺激性較小，符合皮膚局部外用制劑對(duì)pH值的要求。

2.7.2 流變學(xué)測(cè)試

（1）振幅掃描：在凝膠線性黏彈區(qū)（linear viscoelastic region of gel，LVER）內(nèi)進(jìn)行動(dòng)態(tài)振蕩試驗(yàn)，其測(cè)試結(jié)果可得到凝膠結(jié)構(gòu)被破壞所能承受的最大形變。在剪切應(yīng)變（）為0.01%～100%，溫度為25 ℃、角頻率（）為1 rad/s的振幅掃描條件下測(cè)定樣品的LVER的結(jié)果。如圖3-A所示，＜45%，儲(chǔ)能模量（′）＞損耗模量（″），彈性占主體，即樣品表現(xiàn)出凝膠結(jié)構(gòu)；當(dāng)′＝″時(shí)，凝膠結(jié)構(gòu)完全被破壞；當(dāng)＞45%，′＜″，黏性占主體，表現(xiàn)出流體性質(zhì)。證明控制在45%以內(nèi)，提取物水凝膠呈凝膠狀態(tài)。

（2）頻率掃描：在非破壞性變形范圍內(nèi)，樣品的時(shí)間相關(guān)特性用頻率掃描來(lái)描述。在為1%，溫度為25 ℃，為0.1～100 rad/s條件下對(duì)凝膠進(jìn)行頻率掃描。如圖3-B所示。在整個(gè)頻率掃描中，′曲線始終高于″曲線，明顯表現(xiàn)出以彈性為主的特性，始終呈現(xiàn)凝膠狀態(tài)；且′較穩(wěn)定，未出現(xiàn)顯著的頻率依賴性，表明該提取物凝膠具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。

（3）溫度掃描：在動(dòng)態(tài)模式下，固定為1 rad/s，為1%，樣品以2 ℃/min的速率加熱，溫度在20～50 ℃條件下對(duì)凝膠進(jìn)行溫度掃描。如圖3-C所示，在20～50 ℃，隨著溫度升高，′一直大于″，呈凝膠狀態(tài)；但′和″呈不斷下降趨勢(shì)，這可能是由于溫度升高，分子熱運(yùn)動(dòng)程度加劇，高分子鏈之間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被破壞造成的，表明在常規(guī)溫度下，該凝膠始終保持凝膠狀態(tài)。

（4）時(shí)間掃描：在動(dòng)態(tài)模式下，固定為1 rad/s，為1%，溫度25 ℃的條件下，在0～30 min內(nèi)對(duì)凝膠進(jìn)行時(shí)間掃描。如圖3-D所示，在0～30 min，隨著時(shí)間增加，′一直大于″，明顯表現(xiàn)出以彈性為主的特性，表明該凝膠始終呈凝膠狀態(tài)。

2.7.3 SEM測(cè)試 將提取物水凝膠真空冷凍干燥，取適量?jī)龈煞勰瑖娊鹛幚?，利用SEM觀察凝膠微觀形貌。結(jié)果如圖4所示，凝膠內(nèi)部為三維交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這使其具有較好的延展能力及皮膚滯留特性，也為經(jīng)皮遞送提供了穩(wěn)定的物化環(huán)境，藥物可更好的持續(xù)性地釋放，從而達(dá)到緩釋效果。

2.7.4 初步穩(wěn)定性考察 將4批提取物水凝膠分別置于不同溫度（4、25、35、45 ℃）下，考察0、5、10 d凝膠中6種指標(biāo)性成分含量總和、pH值的變化情況，以確定提取物水凝膠最佳存放條件。由表4可知，溫度對(duì)提取物水凝膠的穩(wěn)定性影響顯著，隨著時(shí)間的推移，提取物水凝膠中6種指標(biāo)性成分含量不斷減少，且pH值也隨之增加。4 ℃的存放環(huán)境對(duì)提取物水凝膠的穩(wěn)定性影響較小，因此，該凝膠貯藏于4 ℃為宜。

圖4 不同放大倍數(shù)下提取物水凝膠SEM圖

表4 提取物水凝膠初步穩(wěn)定性考察

Table 4 Stability investigation of extract-hydrogel

t/d6種指標(biāo)性成分含量的總和/%pH值 4 ℃25 ℃35 ℃45 ℃4 ℃25 ℃35 ℃45 ℃ 0101.03±1.0399.90±2.3099.98±2.0699.83±3.885.59±0.025.67±0.015.63±0.025.77±0.02 598.47±3.9499.23±2.7798.89±2.9598.16±5.545.58±0.035.63±0.025.52±0.035.67±0.02 1094.84±11.2993.94±7.2294.35±3.8293.31±6.695.68±0.035.65±0.025.69±0.045.72±0.02

2.8 提取物水凝膠對(duì)RA治療作用的研究

2.8.1 RA模型的建立 參考相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行膠原誘導(dǎo)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（collagen-induced rheumatoid arthritis，CIA）大鼠模型的建立[19]。將CII凍干粉溶解于0.1 mol/L的醋酸中，制成2 mg/mL的CII醋酸溶液，與等體積CFA置于冰上研磨乳化至滴入水中不散開(kāi)為止，即得1 mg/mL乳劑I；同法與等體積IFA配成乳劑II。開(kāi)始對(duì)每只大鼠進(jìn)行尾根部皮內(nèi)2個(gè)位點(diǎn)共注射配制好的乳劑I 0.1 mL，第21天，每只大鼠相同部位重復(fù)注射相同劑量的乳劑II以加強(qiáng)免疫（二次免疫），空白對(duì)照組大鼠在相同的部位每次注射相同體積的生理鹽水代替膠原蛋白混合物。

2.8.2 分組及給藥 第21天后，將造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組（等劑量生理鹽水，ig），提取物灌胃組（1.05 g/kg，ig，根據(jù)三烏膠丸成人服用劑量換算成大鼠給藥劑量；以下簡(jiǎn)稱口服組）、提取物水凝膠組（1 g/只，關(guān)節(jié)涂抹；以下簡(jiǎn)稱水凝膠組），甲氨蝶呤（1 mg/kg，ig）組，每組6只。甲氨蝶呤組3 d/次，其余各組1次/d。二次免疫當(dāng)天開(kāi)始給藥，直到第48天，結(jié)束給藥。治療結(jié)束時(shí)，各組大鼠踝關(guān)節(jié)狀態(tài)見(jiàn)圖5。

2.8.3 關(guān)節(jié)炎療效的評(píng)估 將造模當(dāng)天定為第0天，每隔4 d稱定大鼠體質(zhì)量，右后肢的足厚度和足體積進(jìn)行測(cè)定；參考有關(guān)文獻(xiàn)方法[19]每隔4 d對(duì)給藥后大鼠的關(guān)節(jié)炎程度進(jìn)行臨床評(píng)分。處死大鼠，收集胸腺和脾進(jìn)行稱定質(zhì)量，計(jì)算各組臟器指數(shù)。并收集血液，取上清液按ELISA試劑盒說(shuō)明書的操作測(cè)定RF、CRP、Bcl-2和Bax的含量。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖6）表明，各組之間大鼠體質(zhì)量無(wú)顯著性差異；與空白組相比，模型組大鼠足厚度和足體積顯著升高，表明造模成功。持續(xù)給藥一段時(shí)間后，甲氨蝶呤組可顯著降低足厚度、足體積和關(guān)節(jié)炎指數(shù)水平；提取物經(jīng)過(guò)口服和經(jīng)皮給藥均可降低降低足厚度、足體積和關(guān)節(jié)炎指數(shù)水平，且與甲氨蝶呤相比，無(wú)顯著性差異；表明采用局部經(jīng)皮給藥的模式，未降低提取物對(duì)CIA大鼠的治療作用。

圖5 各組大鼠給藥結(jié)束后踝關(guān)節(jié)情況

與空白組比較：###＜0.001；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01

###< 0.001blank group;*< 0.05**< 0.01model group

Fig. 6 Effects of different treatments on the degree of arthritis in rats (,= 6)

同時(shí)進(jìn)一步計(jì)算臟器指數(shù)，根據(jù)胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)評(píng)價(jià)提取物對(duì)RA的治療作用；結(jié)果（圖7）表明，與空白組相比，模型組胸腺和脾臟器指數(shù)均顯著升高。與模型組相比，各給藥組均能顯著降低胸腺和脾的臟器指數(shù)。隨后測(cè)定血清中炎癥相關(guān)因子RF及蛋白CRP，抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax的含量，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中RF、CRP和Bcl-2的水平顯著升高，Bax的水平顯著降低；與模型組比較，甲氨蝶呤組可顯著降低RF、CRP和Bcl-2水平和升高Bax水平，口服和水凝膠組均可顯著降低RF、CRP和Bcl-2水平和升高Bax水平，且效果與甲氨蝶呤相比無(wú)顯著差異；這表明各給藥組可能通過(guò)降低炎癥，抑制滑膜組織的異常增生和增加凋亡來(lái)起到治療關(guān)節(jié)炎的作用。

2.8.4 毒性評(píng)估 進(jìn)一步研究各給藥組對(duì)大鼠毒性的影響，按照試劑盒說(shuō)明書中使用標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定大鼠血清中與肝毒性相關(guān)指標(biāo)AST和ALT及腎毒性相關(guān)指標(biāo)尿素氮和肌酐水平，從而評(píng)價(jià)不同給藥組對(duì)CIA大鼠的肝腎損傷情況。如表5所示，與空白組比較，模型組大鼠肝臟中ALT、AST、肌酐和尿素氮水平顯著升高；與模型組比較，持續(xù)口服甲氨蝶呤和提取物，ALT、AST、肌酐和尿素氮水平均升高；通過(guò)在炎癥部位進(jìn)行提取物水凝膠局部給藥，ALT、AST、肌酐和尿素氮的升高趨勢(shì)均得到了有效抑制。與口服組相比，水凝膠組能顯著降低ALT、AST、肌酐和尿素氮水平，表明提取物水凝膠經(jīng)皮給藥能通過(guò)降低ALT、AST、肌酐和尿素氮水平，減輕對(duì)CIA大鼠毒性作用。

同時(shí)，取各組大鼠心、肝、脾、肺、腎和胸腺組織，于4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋，切片，蘇木素-伊紅（HE）染色，于顯微鏡下觀察組織病理變化，見(jiàn)圖8?？瞻讓?duì)照組大鼠各臟器組織的病理形態(tài)改變無(wú)明顯差異；如圖中圈出部分所示，模型組大鼠心臟組織斷裂、血管擴(kuò)張瘀血；肝小葉中度水腫，脾小結(jié)內(nèi)淋巴細(xì)胞增生、髓索增粗纖維化；肺泡間隔增厚，色素沉著，纖維結(jié)締組織增生；腎皮質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)多發(fā)靜脈管腔擴(kuò)張，瘀血，提示瘀血性疾病形成；胸腺相鄰小葉皮質(zhì)之間纖維間隔明顯擴(kuò)張，可見(jiàn)靜脈擴(kuò)張瘀血。與模型組比較，甲氨蝶呤組和口服組對(duì)各臟器病理組織損傷程度有所緩和，而水凝膠組病變損傷程度最輕，表明提取物水凝膠對(duì)CIA大鼠毒性作用最小，經(jīng)皮給藥可降低提取物的毒性。

與空白組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 ***P＜0.001 ****P＜0.000 1

表5 不同處理對(duì)CIA大鼠血清中ALT、AST、肌酐和尿素氮水平的影響 (, n = 6)

Table 5 Effects of different treatments on the levels of ALT, AST, creatinine and blood urea nitrogen in serum of CIA rats (, n = 6)

組別劑量ALT/(U?L?1)AST/(U?L?1)肌酐/(μmol?L?1)尿素氮/(mmol?L?1) 空白?27.32±2.4918.66±1.8343.88±2.187.72±0.69 模型?30.73±2.08#22.79±2.09#47.89±2.28#8.95±0.59# 甲氨蝶呤1 mg?kg?133.67±2.53*31.41±1.88***55.94±3.41***10.38±1.33* 口服1.05 g?kg?133.18±0.91*28.20±3.67*54.98±2.36***9.71±0.46* 水凝膠1 g?只?128.49±1.42*???20.14±0.70*???44.96±1.88*?8.11±0.53*??

與空白組比較：#＜0.05；與模型組比較：*＜0.05***＜0.001；與口服組比較：?＜0.05??＜0.01???＜0.001

#< 0.05blank group;*< 0.05***< 0.001model group;?< 0.05??< 0.01???< 0.001oral group

3 討論

三烏膠丸口服給藥方式具有復(fù)雜的體內(nèi)代謝和整體的調(diào)控機(jī)制，這限制了其對(duì)局部關(guān)節(jié)炎的治療效果。而經(jīng)皮給藥是指在皮膚或黏膜表面給藥，使藥物按恒定、接近恒定或需要的速率通過(guò)皮膚各層或黏膜，進(jìn)入體循環(huán)，在全身和局部病灶維持有效的藥物濃度而產(chǎn)生治療作用，能夠避免口服給藥等引起的血藥濃度峰谷現(xiàn)象和有效解決生物大分子在體內(nèi)易失活及半衰期短等問(wèn)題的一種給藥方式[20]。因此，本研究改變傳統(tǒng)給藥途徑，通過(guò)局部經(jīng)皮給藥模式，使藥物高效、迅速地在病變部位富集和積累，從而提高三烏膠提取物的用藥安全性，獲得減毒增效的治療效果。

圖8 不同處理對(duì)大鼠臟器HE病理學(xué)的影響 (×200)

三烏膠提取物活性成分多且復(fù)雜，因此選擇6種指標(biāo)性成分進(jìn)行系統(tǒng)考察，而不是單一成分。經(jīng)皮給藥制劑關(guān)鍵在于提高藥物的透皮速率，藥物促滲透作用與選擇適宜的溶劑和促滲劑有密不可分的關(guān)系[21]，則本實(shí)驗(yàn)以皮膚透過(guò)量為考察指標(biāo)來(lái)篩選溶劑種類和氮酮用量，結(jié)果表明，以10%乙醇作為溶劑和3%氮酮作為促滲劑，6種活性成分的整體經(jīng)皮滲透性最好。

考慮到無(wú)法采用溶液直接進(jìn)行關(guān)節(jié)炎局部給藥，并且提取物中既有水溶性成分又有脂溶性成分，因此，利用水凝膠是具有三維網(wǎng)狀交聯(lián)結(jié)構(gòu)的高分子體系，具有優(yōu)越的生物相容性等特點(diǎn)[22]，選擇水凝膠為劑型載體進(jìn)行經(jīng)皮給藥。

本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，水凝膠組與甲氨蝶呤陽(yáng)性藥都可顯著降低CIA大鼠血清中RF、CRP和Bcl-2水平及顯著升高Bax水平，表明提取物水凝膠對(duì)RA具有治療作用；與口服組比較，水凝膠組可顯著性降低AST、ALT、肌酐和尿素氮水平并且各臟器病變程度更輕，表明其毒性有所降低。綜上，本實(shí)驗(yàn)制備的提取物水凝膠具有良好滲透性能且在保證活性的同時(shí)能降低毒性，這為今后三烏膠提取物新劑型的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供一定的理論參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Preparation of Sanwujiao extract-hydrogel and its therapeutic effect on rheumatoid arthritis

XIAO Su-yun1, 2, LUO Cai-qin1, 2, LYU Dong1, 2, WANG Cheng-xiao1, 2, CUI Xiu-ming1, 2, 3

1. School of Life Science and Technology, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China 2. Key Laboratory ofResources Sustainable Development and Utilization, Kunming 650500, China 3. National Chinese Herbal Medicine Industry Technology System Kunming Comprehensive Test Station, Kunming 650500, China

To prepare and characterize Sanwujiao extract-hydrogel and investigate its therapeutic activity on rheumatoid arthritis.Franz cell method was used to investigate thepermeation effects of 2,3,5,4′-tetrahydroxy stilbene 2--β--glucoside, benzoylmesaconine, 8-deacetylyunaconitine, sinapic acid crassicauline, crassicauline A and emodin in the Sanwujiao extract. The Sanwujiao extract-hydrogel was prepared and its physical and chemical properties were characterized; At the same time, the CIA rat model was established to study the therapeutic activity of Sanwujiao extract on rheumatoid arthritis under percutaneous delivery mode.The Sanwujiao extract-hydrogel was always in the state of gel under normal conditions; And its three-dimensional cross-linked network structure can make the drug release better and continuously, so as to achieve the sustained-release effect. In vivo pharmacological tests showed that the Sanwujiao extract-hydrogel significantly decreased the foot thickness, foot volume, arthritis index level, RF, CRP and Bcl-2 levels in serum and increased Bax levels in CIA rats; It can also reduce the levels of AST, ALT, creatinine and blood urea nitrogen and the degree of organ lesions.Using the local delivery mode of percutaneous delivery, Sanwujiao extract can retain the therapeutic activity and reduce the organ toxicity caused by oral administration, which provides the possibility for the study of external preparations of Sanwujiao extract in the future.

Sanwujiao extract; hydrogel; transdermal drug delivery; topical application; rheumatoid arthritis; biological toxicity; 2,3, 5,4′-tetrahydroxy stilbene 2--β--glucoside; benzoylmesaconine; 8-deacetylyunaconitine; sinapic acid crassicauline; crassicauline A; emodin; rheumatoid factor; C-reactive protein; B-cell lymphoma-2; Bcl-2-associated X protein; aspartate aminotransferase; alanine aminotransferase; creatinine; blood urea nitrogen

R283.6

A

0253 - 2670(2022)13 - 3929 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.13.006

2022-01-13

國(guó)家重大科技專項(xiàng)（202002AA100004-2）；國(guó)家重大科技專項(xiàng)（202102AA310045）；國(guó)家重大科技專項(xiàng)（202002AA1000056）

肖素蕓（1997—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樾滦椭兴幹苿el: 13766227297 E-mail: xsy13766227297@163.com

崔秀明（1963—），男，研究員，主要從事中藥資源研究。Tel: 18387186037 E-mail: sanqi37@vip.sina.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]