利用新會柑果漿培養(yǎng)海洋假絲酵母的發(fā)酵工藝

李義勇，陳柏忠，沈許源，葉偉，吳振強(qiáng)

1. 華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院（廣州 510006）；2. 廣東新寶堂生物科技有限公司（江門 529101）；3. 黑龍江大學(xué)生命科學(xué)院（哈爾濱 150080）；4. 廣東省科學(xué)院微生物研究所（廣州 510070）

海洋假絲酵母（Candida orthopsilosis）是近年來單分出的種屬[1]，無明顯致病性，無抗性也不耐藥[2]，具耐酸、耐高溫等環(huán)境適應(yīng)能力[3]，并且表現(xiàn)出良好的拮抗作用[4]，對水果霉病有抑制作用，可用于生產(chǎn)可食保鮮膜[1]，具有廣闊的開發(fā)利用前景[5]。前提條件是實(shí)現(xiàn)海洋假絲酵母的規(guī)?；l(fā)酵培養(yǎng)，但卻鮮有該方面的報(bào)道。為了實(shí)現(xiàn)對海洋假絲酵母的工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，一方面需要采用廉價(jià)易得的培養(yǎng)基，另一方面需要降低發(fā)酵工藝要求。

新會陳皮是中國地理標(biāo)志產(chǎn)品，為廣東省十大道地藥材之首，藥用價(jià)值以及經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高。陳皮取自新會柑的果皮，而果肉因味酸、口感不佳、產(chǎn)量巨大、又不耐存放等原因被當(dāng)作廢料處理，丟棄量達(dá)20萬 t/年，對周邊的土壤和水體環(huán)境造成不良影響。為此，當(dāng)?shù)卣膭钇髽I(yè)采用多種途徑開發(fā)利用新會柑果肉，包括制作酵素、釀造果酒和生產(chǎn)有機(jī)肥，但仍只能消納小部分（約20%）。果肉丟棄現(xiàn)象仍然普遍存在。有研究表明，新會柑果肉營養(yǎng)豐富，其果漿可以直接作為培養(yǎng)基使用[6]。

前期從新會柑果肉中分離到1株內(nèi)生真菌，經(jīng)鑒定為海洋假絲酵母，且該菌株在新會柑果漿中生長良好。為研發(fā)基于新會柑果漿的海洋假絲酵母培養(yǎng)技術(shù)，試驗(yàn)在開放式環(huán)境下，探討果漿稀釋與牛肉浸粉/葡萄糖/CaCO3添加等工藝條件對海洋假絲酵母生長的影響，獲得優(yōu)化的工藝條件，為后續(xù)大規(guī)模的利用新會柑果漿培養(yǎng)海洋假絲酵母提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 海洋假絲酵母

1株分離自新會柑果肉的內(nèi)生真菌，經(jīng)鑒定為海洋假絲酵母C.orthopsilosis，保藏于廣東省微生物研究所藥用真菌課題組。

1.2 材料與試劑

新會柑果漿，將-30 ℃冷凍保存的新會柑果肉自然解凍后，經(jīng)擠壓和紗布過濾，得到的液體即為果漿，其主要成分為：總糖6.78 g/100 mL，其中還原糖3.95 g/100 mL；總酸1.192 5 g/100 mL，pH 3.70；維生素C 0.021 4 g/100 mL。

牛肉浸粉（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；CaCO3、葡萄糖（廣州東巨實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

1.3 儀器與設(shè)備

HZQ-X500C恒溫振蕩器（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；HT-CJ-2S無菌操作臺（安徽航天生物科技有限公司）；LDZX-75KBS立式高壓蒸汽滅菌鍋（上海中安醫(yī)療器械廠）。

1.4 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：新會柑果漿，現(xiàn)制現(xiàn)用。

營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基、馬丁培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基：均參照NY/T 2321—2013《微生物肥料產(chǎn)品檢驗(yàn)規(guī)程》附錄B配制[7]。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)條件

取250 mL三角錐形瓶，裝入100 mL的培養(yǎng)基，在搖床中進(jìn)行有氧發(fā)酵。接種量10%、培養(yǎng)溫度30 ℃、自然pH、搖床轉(zhuǎn)速120 r/min、培養(yǎng)周期24 h。

1.5.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.5.2.1 海洋假絲酵母直接開放式發(fā)酵

從活化后的海洋假絲酵母斜面上刮取1環(huán)菌苔，置于10 mL無菌生理鹽水中，制成菌懸液，將制得的菌懸液稀釋10倍后以1∶10的比例接種至裝有基礎(chǔ)培養(yǎng)基（未滅菌）的潔凈三角錐形瓶中，直接進(jìn)行開放式發(fā)酵。24 h后，測定發(fā)酵液中的活菌數(shù)，并檢測雜菌數(shù)。

1.5.2.2 海洋假絲酵母培養(yǎng)條件優(yōu)化

在直接開放式試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，改變果漿稀釋倍數(shù)（以無菌水為溶劑，稀釋0，2，4，6，8和10倍）、牛肉浸粉添加量（0，0.070，0.125，0.250，0.500和1.000 g）、葡萄糖添加量（0，0.250，0.500，1.000，2.000和4.000 g）及CaCO3添加量（0，0.025，0.050，0.075，0.100和0.125 g），探討這些條件對海洋假絲酵母生長的影響。每批次試驗(yàn)后測定24 h時(shí)的發(fā)酵液活菌數(shù)，確定最佳生長條件。

1.5.3 活菌數(shù)的測定

采用平板菌落計(jì)數(shù)法，其菌落計(jì)數(shù)方法參照NY/T 2321—2013[7]進(jìn)行。

1.5.4 雜菌數(shù)的測定

采用平板菌落計(jì)數(shù)法，其結(jié)果計(jì)算方法參照NY/T 2321—2013[7]進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 海洋假絲酵母直接開放式發(fā)酵

前期研究表明，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板上，該菌株的菌落為乳白色，質(zhì)地均勻，正反面和邊緣、中央部位的顏色都很均一（見圖1），說明新會柑果漿可直接作為該菌株的培養(yǎng)基使用。

圖1 海洋假絲酵母菌落形態(tài)

經(jīng)直接開放式發(fā)酵發(fā)現(xiàn)，該菌可適應(yīng)新會柑果漿酸性環(huán)境，無需外加任何營養(yǎng)物質(zhì)，在新會柑果漿中生長良好，發(fā)酵培養(yǎng)24 h后的活菌數(shù)可達(dá)6.5×107CFU/mL，無雜菌發(fā)生，發(fā)酵液pH 4.01，且氣味正常，無腐敗氣味。值得指出的是，一般認(rèn)為，在開放式發(fā)酵體系中，未滅菌的發(fā)酵原料及空氣環(huán)境會帶入一定量雜菌，因此應(yīng)該采取措施抑制雜菌生長[8]。試驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)雜菌，可能的原因是新會柑果漿原料（果肉）本身相對潔凈，且該菌株為新會柑果肉內(nèi)生真菌，本身更容易占據(jù)生態(tài)位優(yōu)勢。

2.2 海洋假絲酵母培養(yǎng)條件優(yōu)化

為進(jìn)一步提高活菌數(shù)，探討果漿稀釋和牛肉浸粉/葡萄糖/CaCO3添加等條件對海洋假絲酵母生長的影響。

2.2.1 不同果漿稀釋倍數(shù)對海洋假絲酵母生長的影響

有研究表明，適度降酸有利于酵母菌生長[9]。由于新會柑果漿呈明顯酸性（pH 3.70），可能對海洋假絲酵母存在不良影響，因此，考察果漿稀釋度對該菌株生長的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 不同果漿稀釋倍數(shù)對海洋假絲酵母生長的影響

由圖2可知，隨著稀釋度增加，活菌數(shù)呈現(xiàn)先增加后減少趨勢，說明直接使用新會柑果漿仍會對該菌株產(chǎn)生一定抑制作用，而適當(dāng)稀釋可以緩解此抑制作用，有利于該菌株的生長。然而，過度稀釋可能造成營養(yǎng)成分不足，反而不利于該菌株的生長?？梢?，最佳條件為果漿稀釋4倍，此時(shí)活菌數(shù)達(dá)到7.8×108CFU/mL，最終pH為4.00。

2.2.2 不同牛肉浸粉添加量對海洋假絲酵母生長的影響

氮源對酵母菌生長有顯著影響，且有機(jī)氮源對酵母生長的促進(jìn)作用要大于無機(jī)氮源[10-11]，故考察不同牛肉浸粉添加量對海洋假絲酵母生長的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，隨著牛肉浸粉添加，活菌數(shù)呈現(xiàn)先快速增加后緩慢減少的趨勢，說明適量補(bǔ)充牛肉浸粉十分有利于該菌株的生長。然而，過量添加的作用不大，因?yàn)樗芴峁┑臓I養(yǎng)已經(jīng)飽和。為節(jié)省發(fā)酵原料，建議最佳條件為0.125 g/L，此時(shí)活菌數(shù)達(dá)到1.7×108CFU/mL，最終pH為4.06。

圖3 不同牛肉浸粉添加量對海洋假絲酵母生長的影響

2.2.3 不同葡萄糖添加量對海洋假絲酵母生長的影響

有研究表明，適當(dāng)提高糖度可以更好地滿足酵母菌生長[9]，故考察不同葡萄糖添加量對海洋假絲酵母生長的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 不同葡萄糖添加量對海洋假絲酵母生長的影響

由圖4可知，隨著葡萄糖添加量增加，活菌數(shù)呈現(xiàn)先穩(wěn)步增加后快速減少趨勢，說明適當(dāng)補(bǔ)充葡萄糖的確有利于該菌株的生長。然而，一旦添加過量，其副作用立即凸顯。因此，建議最佳條件為1.000 g/L，此時(shí)活菌數(shù)達(dá)4.7×108CFU/mL，最終pH為4.67。

2.2.4 不同CaCO3添加量對海洋假絲酵母生長的影響

除了2.2.1的稀釋法降酸，還可通過添加CaCO3調(diào)節(jié)酸性，因此，考察不同CaCO3添加量對海洋假絲酵母生長的影響，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，隨著CaCO3添加，活菌數(shù)呈現(xiàn)先緩慢后快速增加的趨勢，說明補(bǔ)充一定量的CaCO3的確有利于該菌株的生長。然而，添加量0.125 g/L時(shí)，開始出現(xiàn)CaCO3未被完全利用的情況。因此，建議最佳條件為0.125 g/L，此時(shí)活菌數(shù)達(dá)到5.0×109CFU/mL，最終pH為4.75。

圖5 不同CaCO3添加量對海洋假絲酵母生長的影響

綜上可見，牛肉浸粉添加、葡萄糖添加、果漿稀釋度和CaCO3的添加對海洋假絲酵母生長都產(chǎn)生明顯影響，且影響程度依次增強(qiáng)。其最優(yōu)工藝條件為牛肉浸粉添加量0.125 g/L、葡萄糖添加量1.000 g/L、果漿稀釋4倍和CaCO3添加量0.125 g/L。

2.3 海洋假絲酵母最佳培養(yǎng)工藝

在優(yōu)化工藝條件下，其活菌數(shù)可達(dá)9.5×109CFU/mL，且隨之發(fā)生絮凝現(xiàn)象（圖6），從而有利于后續(xù)回收利用[12]。

圖6 海洋假絲酵母的絮凝現(xiàn)象

通過試驗(yàn)發(fā)酵工藝，一方面可以充分利用廉價(jià)易得的新會柑果漿培養(yǎng)基，另一方面可以降低對無菌發(fā)酵的嚴(yán)格工藝要求，能夠更好地滿足海洋假絲酵母的工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)需求。既獲得了有價(jià)值的海洋假絲酵母，又實(shí)現(xiàn)新會柑果肉的資源化利用，具有經(jīng)濟(jì)和環(huán)保雙重效益。

3 結(jié)論

新會柑果漿可直接作為海洋假絲酵母菌株的培養(yǎng)基使用。經(jīng)直接開放式發(fā)酵培養(yǎng)24 h后，活菌數(shù)可達(dá)6.5×107CFU/mL，無雜菌發(fā)生。

牛肉浸粉添加量、葡萄糖添加量、果漿稀釋度和CaCO3添加量等對海洋假絲酵母生長都產(chǎn)生了明顯影響，且影響程度依次增強(qiáng)。其最優(yōu)工藝條件為牛肉浸粉添加量0.125 g/L、葡萄糖添加量1.000 g/L、果漿稀釋4倍和CaCO3添加量0.125 g/L。

在最優(yōu)工藝條件下，其活菌數(shù)可達(dá)9.5×109CFU/mL，且隨之發(fā)生絮凝現(xiàn)象，有利于后續(xù)回收利用。

采用新會柑果漿開放式培養(yǎng)海洋假絲酵母是可行的，不僅培養(yǎng)基廉價(jià)易得，而且發(fā)酵和回收便利，能夠滿足工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)需求，既獲得有價(jià)值的海洋假絲酵母，又實(shí)現(xiàn)新會柑果肉的資源化利用。