廣東省中山地區(qū)臨床初檢RhD陰性人群中D變異體分布及特征分析

陳勇高，吳少梅，易 冰

(中山市人民醫(yī)院a.輸血科；b.分子診斷中心，廣東中山 528400)

關(guān)鍵字：RhD陰性；D變異體；弱D表型；部分D表型；Del表型

Rh血型系統(tǒng)，是人類紅細胞血型中最復(fù)雜最具遺傳多態(tài)性的一個系統(tǒng)，也是輸血醫(yī)學(xué)中除ABO血型外最為重要的血型系統(tǒng)。目前已發(fā)現(xiàn)50多種Rh抗原，其中RhD抗原的免疫原性最強，因其常常引起溶血性輸血反應(yīng)、新生兒溶血?。╤emolytic disease of the newborn，HDN）和自身免疫性溶血性貧血等而備受重視。RHD基因容易發(fā)生變異，會產(chǎn)生一系列具有RhD陰性特征且易與 RhD陰性血型相混淆的D變異體（部分D、弱D和Del型）[1]。本研究通過血清學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)方法對中山地區(qū)RhD變異型及其發(fā)生的分子機制進行探究，為指導(dǎo)本地區(qū)臨床輸血和育齡婦女采取恰當(dāng)?shù)念A(yù)防新生兒溶血病措施提供更準(zhǔn)確的檢測結(jié)果和科學(xué)依據(jù)，對輸血安全和稀有血型的合理應(yīng)用都具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象 本研究選取了2017年12月～2019年2月中山市人民醫(yī)院門診和住院的本地患者24 286例。平均年齡40.56±20.61歲，基本覆蓋了本地區(qū)不同年齡階段的人群。

1.2 試劑與儀器 主要試劑：ABO-RH血型檢測卡（微柱凝膠法）、抗人球蛋白檢測卡(IgG+C3d)均購自北京斑珀斯科貿(mào)有限責(zé)任公司；單克隆抗D (IgM+IgG) 購自英國密理博公司；單克隆抗D（IgM），單克隆抗D（IgG），單克隆抗C, c, E, e（IgM）血型定型試劑購自上海血液生物醫(yī)藥有限公司；紅細胞IgG抗體釋放劑（酸放散法）購自廣州展全生物科技有限公司；基因組DNA提取試劑盒、人類紅細胞RhD基因分型檢測試劑盒（PCRSSP法）購自天津秀鵬生物技術(shù)開發(fā)有限公司。所有試劑均在有效期內(nèi)使用，且嚴(yán)格按照說明書操作。常用儀器為Baso2005-2離心機，恒溫箱等。

1.3 方法

1.3.1 RhD陰性篩查：采用ABO-Rh微柱凝膠血型卡對本院門診及住院病人的血液樣本進行ABO血型的鑒定和RhD陰性篩選。同時，以IgM抗-E,e, C, c分型試劑對初檢后陰性樣本進行表型鑒定。

1.3.2 RhD變異體血清學(xué)確認(rèn)試驗：使用IgM,IgG和IgM+IgG抗-D單克隆抗體，通過間接抗人球蛋白技術(shù)（indirect antiglobulin test, IAT），對上述篩選出的RhD陰性樣本進行確認(rèn)，有1種或1種以上抗體示抗-D陽性，判定為D變異（弱D或部分D）。隨后進行吸收放散試驗對IAT法確認(rèn)后的RhD陰性樣本進行Del表型鑒定，步驟為：將1ml在正常離子強度鹽水中洗滌過的紅細胞與等體積單克隆IgG抗-D混合液混合在試管中，置于37℃環(huán)境下孵育1h后使用酸放散液檢測Del型。

1.3.3 RHD基因分型檢測和1～10外顯子測序：采用離心柱法從受檢者外周血中分離獲得基因組DNA，測定提取DNA的濃度和純度，并置于-20℃保存。再通過人類紅細胞RHD分型試劑盒[聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物（polymerase chain reaction sequence specifie primmer, PCRSSP法）]，按照試劑盒說明書進行實驗操作，得到的電泳結(jié)果與試劑盒的結(jié)果分型表比對，判定基因分型結(jié)果。RHD外顯子1～10測序工作由天津市秀鵬生物科技技術(shù)開發(fā)有限公司協(xié)助完成。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 Rh血型表型頻率和單倍型頻率等計數(shù)資料采用百分比(%)表示，通過SPSS 26.0軟件對相關(guān)數(shù)據(jù)進行Pearsonχ2檢驗或Fisher精確檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RhD陰性確認(rèn)和基因分型結(jié)果 與抗D單克隆抗體凝集強度見表1。對我院24 286例門診和住院患者血液樣本進行檢測，凝膠卡法初步篩查出102例陰性樣本，初檢陰性比例為0.42%。對102例樣本進行IAT確認(rèn)試驗、吸收放散試驗和PCR-SSP基因分型檢測。IAT確認(rèn)試驗檢出弱D或部分D共7例（6.86%）。再對其余陰性樣本進行吸收放散試驗，共檢出Del型25例。對所有初檢陰性樣本進行基因分型試驗，結(jié)果顯示：RHD全缺失型58例（56.86 %），RHD1227A型31例（30.39%），RHD-CE(2-9)-D型7例（6.86%），RHDⅥ typeⅢ型2例（1.96%），RHD1227A/D型1例（0.98%）和3例（2.94%）國內(nèi)外鮮有報道的等位基因，它們分別為RHDEXON4:491 A＞T，RHD*01N.47，RHD*01N.67。在PCR-SSP確認(rèn)Del型中，有3例為吸收放散試驗中漏檢樣本。Del型變異占27.45%（28/102），其等位基因均是RHD1227A型，暫未見其他等位基因。RHD（1～10）外顯子測序發(fā)現(xiàn)了弱D型基因測序部分結(jié)果見圖1。

表1 弱D或部分D與抗-D試劑凝集強度表（IAT法）

圖1 弱D RHDEXON4:491A＞T測序結(jié)果

2.2 RhD變異體及RhCcEe表型分布 見表2。對102例初檢RhD陰性樣本進行RhCcEe表型鑒定，結(jié)果顯示ccee和Ccee表型占比分別為46.08%（47/102）和36.27 %（37/102），其余表型占比分別為CCee 12.75%（13/102），ccEe 2.94%（3/102）和CcEe 1.96%（2/102）。對所有樣本的RhCcEe表型觀察頻率與理論頻率進行卡方檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=2.625，P=0.676）。提示本研究所納入的所有初檢RhD陰性血液樣本的RhCE表型分布符合 Hardy-Weinberg 遺傳平衡。統(tǒng)計方法主要參照文獻[2]。表2可見67例RhD非變異體樣本中，RhCcEe表型仍主要以ccee和Ccee為主，占比分別為70.15%（47/67）和19.40%（13/67），35例RhD變異體中CCee，CCee占比分別為68.57%（24/35）和28.57%（10/35）。Del型變異體中，僅見Ccee和CCee，未見其他表型。經(jīng)Fisher檢驗分析得RhCcEe表型分布頻數(shù)在RhD變異體與RhD陰性樣本間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 ）。

表2 RHD初檢陰性血清學(xué)分類和RhCcEe分型交叉表[n(%)]

3.討論

RH基因位于人類第1號染色體短臂,包括RHD和RHCE兩個緊密連鎖排列的基因，它們分別編碼D抗原以及C，c，E和e抗原。RHD基因和RHCE基因高度同源（93.8%），均有10個外顯子和9個內(nèi)含子，且均編碼417個氨基酸，即D抗原和CcEe抗原。由于其獨特的基因構(gòu)造容易發(fā)生雜交，從而導(dǎo)致RHD基因丟失，稱為RhD陰性單倍體；或者產(chǎn)生基因變異，形成一系列影響D抗原表達的RhD血清學(xué)亞型，即D變異體。臨床上常規(guī)用抗-D抗體（IgM）對Rh血型進行初步篩查，通常將陰性結(jié)果視為Rh陰性血型。但這些初檢陰性樣本中低頻存在有一系列D變異體，它們并不是真正意義上的D抗原完全陰性，紅細胞上D抗原的表達有量或質(zhì)的改變。隨后通過IAT和吸收放散法可鑒定弱D、部分D和Del表型。由于血清學(xué)試驗步驟多，過程繁瑣，且結(jié)果判定受人為因素較大，因此常會出現(xiàn)誤檢漏檢等情況。如果對D變異體表型鑒定不清，極有可能導(dǎo)致抗-D同種免疫反應(yīng)的發(fā)生。RhD陰性新生兒、孕婦或其他患者輸用RhD變異型血液時面臨RhD同種免疫的潛在危險[3]；或者，初檢使用高效價的單克隆抗體，會出現(xiàn)一些部分D型樣本呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，被誤判為RhD陽性的情況。由于紅細胞表面缺乏一個或數(shù)個D抗原表位，當(dāng)患者妊娠RhD陽性胎兒或輸RhD陽性血時，會針對自身缺乏的這部分表位產(chǎn)生抗-D抗體，造成溶血性輸血反應(yīng)、新生兒溶血病等嚴(yán)重的臨床免疫反應(yīng)。

近年來隨著對RH基因結(jié)構(gòu)和Rh抗原分子特征的研究，尤其分子遺傳背景逐漸明了，基于分子生物學(xué)基因分型技術(shù)在Rh血型鑒定中得到越來越廣泛的應(yīng)用[4]。以往文獻報告顯示：相較于高加索人和黑人，亞洲人群中RHD基因的遺傳背景更為復(fù)雜，其中RHD變異頻率遠高于其他人種。

部分D形成的分子機制主要為錯義突變和RHD-CE-D融合等位基因形成，即RHD基因中的一部分基因被RHCE基因替換形成融合基因而產(chǎn)生。由于RHD和RHCE基因緊密連鎖，高度同源性且方向相反，易形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)從而發(fā)生交換重組，并且在遺傳學(xué)上該融合基因可以穩(wěn)定遺傳[10]。本研究確認(rèn)的2例部分D樣本均為DⅥ typeⅢ，占D抗原弱表現(xiàn)的28.57%，占初檢陰性樣本的1.96%，此結(jié)果與先前文獻報道的結(jié)果相近[5]。

目前GenBank記錄和文獻報道的弱D變異種類已近百種。中國人群中主要以弱D15型和弱D12型為主，其中弱D15型約占80%以上[6]。本次研究發(fā)現(xiàn)中山地區(qū)弱D變異體的基因型表現(xiàn)多樣，5例弱D樣本中，存在3例等位基因為RHD1227A純合型，1例為RHD1227A/D 雜合型，1例經(jīng)進一步RHD（1～10）外顯子測序確認(rèn)為第4外顯子的第491號堿基上發(fā)生了由A突變成T的純合突變，記為RHDEXON4:491A＞T。弱D樣本中均未見弱D15型和弱D12型，可能與本次研究中收集的D變異體樣本量過少有關(guān)。

雖然Rh-Del表型具有完整的RHD基因，但紅細胞上D抗原的表達極弱，通常需進行吸收放散實驗鑒定Del型，但因其步驟繁瑣，結(jié)果判讀受主觀因素影響較大，不適合大規(guī)模的臨床應(yīng)用。所以一直以來，變異在臨床上長期被視為RhD陰性個體，未被正確認(rèn)識。但近年來，隨著國內(nèi)外文獻報道有Rh陰性患者輸注Del型血液產(chǎn)生抗-D抗體的病例[7]，Rh-Del變異體也逐漸被重視。與高加索人相比，Del型變異在亞洲RhD陰性人群中占比較高，先前研究報道的數(shù)據(jù)分別為：沈陽（31.3%）[8]，武漢（24.2%）[9]，合肥（27.2%）[10]，韓國（17.9%）[11]，泰國（20%）[12]。Del型中攜帶的RHD1227A等位基因為亞洲人種特有，所以常被稱“亞洲型”。本次研究結(jié)果顯示，Del型占初檢Rh陰性樣本的27.45%（28/102），其中25例樣本由吸收放散試驗鑒定出，后續(xù)采用PCR-SSP基因分型法防止了另外3例Del樣品被漏檢。這一結(jié)果與中國和亞洲其他地區(qū)文獻中數(shù)據(jù)相似。本次所檢測的28例Del變異體均為RHD1227A純合子，RHD1227A等位基因在中山地區(qū)RhD陰性人群中占比31.37%（32/102），其中1例為RHD1227A/D雜合子，略高于先前針對亞洲人群的文獻報告。

對RhCcEe表型檢測結(jié)果顯示，本次納入的Rh血型樣本表型分布符合群體實際分布和 Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律。67例RhD陰性樣本中，CcEe表型以ccee和Ccee的頻率最高，其分布情況與先前報道的四川地區(qū)漢族人群分布相似[4]，提示RHD陰性與ce單倍體密切相關(guān)，其背后的機制有待進一步探究。RhD變異體與RhC+表型高度相關(guān)，28例Del型中Ccee占比最多（75.0%），其次是CCee（25.0%），未檢測出其他表型。先前的文獻中也可見類似分布，例如：126例來自臺灣的Del型血液樣本中，Ccee占比84.9%（107/126）,CCee占比15.1%（19/126）[13]，泰國50例Del型樣本中，Ccee占比84.0%（42/50），CCee占比16.0%（8/50）[10]。經(jīng)研究，Del變異型與RhC+表型之間的這種關(guān)聯(lián)可以用C的抑制作用來解釋，其中C抗原的表達可以抑制D抗原的表達密度[14]。

綜上，中山地區(qū)人群中RhD變異體具有極其豐富的多態(tài)性和復(fù)雜性，存在一系列RhD變異體。僅靠血清學(xué)檢測難以準(zhǔn)確區(qū)分RhD變異和RhD陰性個體，或確定D變異的基因型。目前，血清學(xué)聯(lián)合分子生物學(xué)方法，有利于提高血型檢測結(jié)果準(zhǔn)確度和規(guī)范檢測標(biāo)準(zhǔn)化。因此，對本研究中鑒定的各型RhD變異體將會進行特殊管理，建立更加細化的輸血規(guī)則，旨在節(jié)約RhD 陰性血液資源的同時，最大限度保障輸血安全及療效，避免嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生。