應(yīng)用基因密碼子優(yōu)化技術(shù)建立高效人降鈣素原的原核表達(dá)方法及產(chǎn)品純化和鑒定

羅玄梅，黃 薇，孫高遠(yuǎn)，湯小琨，王璐瑤，鄒麗輝

（北京醫(yī)院 a.國家老年醫(yī)學(xué)中心; b.臨床生物樣本管理中心，北京 100730）

降鈣素原（procalcitonin, PCT）是降鈣素的無激素活性前體，大小約13 kDa[1]。PCT濃度可反映炎癥的類型及嚴(yán)重程度，在疾病早期診斷及指導(dǎo)抗生素治療等方面發(fā)揮重大作用[2-3]。臨床上，PCT檢測方法的建立及質(zhì)量控制均依賴PCT蛋白參考品。然而其多購于國外公司，價格昂貴，且國內(nèi)外少有報道關(guān)于高效制備PCT蛋白參考物質(zhì)的方法。為此，本文基于密碼子優(yōu)化技術(shù)在原核表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)可溶性PCT蛋白，旨在為臨床檢測提供優(yōu)質(zhì)價廉的參考品。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 恒溫?fù)u床（蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；電泳儀（Bio-Rad公司）；超聲細(xì)胞粉碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；生物梅里埃VIDAS全自動熒光免疫分析儀（法國生物梅里埃公司）；E.coliDH5及E.coliBL21(DE3) pLysS菌株（Takara公司）；pRSF-Duet為筆者實(shí)驗(yàn)室保存；BamHI，XhoI和 T4 DNA連 接 酶（Thermo Fisher Scientific公司）；質(zhì)粒提取試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒（Axygen Scientific公司）；瓊脂粉，卡那霉素抗生素，咪唑，Ni-NTA鎳離子親和樹脂及親和層析柱，IPTG（生工生物工程股份有限公司）；EK酶及卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)液為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 方法

1.2.1 優(yōu)化密碼子和合成新基因：從 NCBI數(shù)據(jù)庫檢索PCT基因的全長CDS序列，使用E.coliCodon Usage Analyzer 2.1軟件分析密碼子使用情況，用大腸埃希菌偏好密碼子替換稀有密碼子，添加6His標(biāo)簽，委托華大基因公司合成。

1.2.2 構(gòu)建高效表達(dá)菌株：將合成序列的BamHI和XhoI雙酶切片段插入含麥芽糖結(jié)合蛋白（maltose-binding protein, MBP）標(biāo)簽的pRSF-Duet載體。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coliDH5，接種于卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)液。挑選陽性單克隆菌株并提取質(zhì)粒，經(jīng)Sanger測序鑒定插入序列及位置。

1.2.3 表達(dá)及純化PCT蛋白：將構(gòu)建的pMBPPCT-pRSF質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3) pLysS。取單菌落于LB培養(yǎng)液中37℃ 200r/min過夜培養(yǎng)，按1:500比例接種至500 ml LB培養(yǎng)液，37℃ 200 r/min培養(yǎng)至A600nm=0.4～0.6。加終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，20℃ 200 r/min培養(yǎng)16h，誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)。離心收集菌體沉淀，重懸于蛋白提取緩 沖 液（50 mmol/L Na3PO4，pH 8.0，500 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑），加入終濃度為1%的Triton-100，冰浴30 min，轉(zhuǎn)移至超聲細(xì)胞粉碎儀冰浴超聲5 min，離心留上清。上清與 Ni-NTA 4℃孵育1h，用咪唑洗脫液（50 mmol/L Na3PO4，pH 8.0，500 mmol/L NaCl，250 mmol/L咪唑）洗脫，流出液即為PCT融合蛋白。EK酶去除MBP標(biāo)簽，酶切產(chǎn)物與Ni-NTA 4℃孵育1h，咪唑洗脫液洗脫，流出液即為PCT蛋白。

1.2.4 PCT蛋白濃度檢測、穩(wěn)定性及均勻性評價：采用全自動熒光免疫分析儀及配套試劑檢測PCT蛋白濃度。參考CNAS-GL003-2018《能力驗(yàn)證樣本均勻性和穩(wěn)定性評價指南》，于1，2，4，8，16，32，64周，在4℃和-20℃儲存的樣品總體中隨機(jī)抽取3份樣品檢測濃度，評價穩(wěn)定性。在儲存80周的樣本總體中，隨機(jī)抽取10個樣品，每個樣品平行測定3次，評價均勻性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS 25.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。均勻性評價和穩(wěn)定性評價采用單因素方差分析，計算F統(tǒng)計量，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCT蛋白基因的密碼子優(yōu)化 見圖1。用E.coliCodon Usage Analyzer 2.1軟件分析發(fā)現(xiàn)，在編碼PCT蛋白的氨基酸中，24個氨基酸由大腸埃希菌的稀有密碼子編碼。鑒于稀有密碼子會顯著降低目的蛋白的表達(dá)，故使用偏好密碼子替換頻率較低的密碼子，優(yōu)化后氨基酸序列與GenBank報道完全一致。

圖1 PCT基因密碼子優(yōu)化

2.2 pMBP-PCT-pRSF高效表達(dá)載體的構(gòu)建 見圖2。T7啟動子控制PCT基因轉(zhuǎn)錄，6His及MBP標(biāo)簽分別用于純化及增強(qiáng)目的蛋白可溶性。陽性單克隆質(zhì)粒經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切，獲得大小約450bp的酶切產(chǎn)物，與合成序列的PCR產(chǎn)物大小一致。經(jīng)NCBI Blastn軟件比對，測序結(jié)果與預(yù)期質(zhì)粒圖譜完全一致，表明pMBP-PCT-pRSF載體構(gòu)建成功。

圖2 構(gòu)建和驗(yàn)證重組表達(dá)載體pMBP-PCT-pRSF

2.3 PCT蛋白的表達(dá)分析及純化鑒定 見圖3。第一次親和純化產(chǎn)物15g/dl SDS-PAGE電泳圖可見大小約60 kDa的蛋白條帶，與預(yù)期融合蛋白大小一致，條帶單一，純度達(dá)95%以上，表明目標(biāo)MBP-PCT融合蛋白獲得了高效表達(dá)。使用EK酶處理后，可見 MBP標(biāo)簽被高效切除，獲得PCT蛋白。

圖3 MBP-PCT蛋白SDS-PAGE電泳圖

2.4 PCT蛋白穩(wěn)定性評價 見表1。純化所得PCT蛋白濃度達(dá)168（168.00±2.65）mg/L。在4℃（F=2.016,P=0.116 4）和-20℃（F=2.620,P=0.052 5）儲存期間，組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，表明PCT蛋白適合低溫長時間保存。

表1 PCT蛋白不同儲存時間穩(wěn)定性測定結(jié)果（±s,mg/L）

表1 PCT蛋白不同儲存時間穩(wěn)定性測定結(jié)果（±s,mg/L）

儲存溫度（℃） 0周 1周 2周 4周 8周 16周 32周 64周4 168.00±2.65 167.67±2.52 166.67±2.52 166.33±1.53 165.00±2.00 164.67±2.08 163.67±3.79 161.00±4.36-20 168.00±2.65 167.67±1.15 167.00±1.00 166.33±0.58 165.67±0.58 165.00±1.00 164.33±1.53 162.67±4.04

2.5 PCT蛋白均勻性評價 見表2。分別從4℃（F=0.727 3,P=0.679 6）和-20℃（F=0.973 9,P=0.489 3）儲存的樣品總體中隨機(jī)多次取樣檢測，PCT蛋白濃度的組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明均勻性檢測合格。

表2 PCT蛋白均勻性測定結(jié)果（mg/L）

3 討論

近年來，PCT作為炎癥反應(yīng)的血清學(xué)標(biāo)志物被廣泛應(yīng)用于臨床檢測[4]。相較于其他炎癥因子，PCT具有較高的特異度和敏感度，在敗血癥及感染性休克等細(xì)菌感染疾病的早期診斷中具有重大意義。PCT蛋白純品不僅可用作臨床檢測的參考品，還可用于PCT的實(shí)驗(yàn)室相關(guān)研究[5]。雖然真核表達(dá)系統(tǒng)具有翻譯后加工修飾能力，其表達(dá)蛋白更接近天然構(gòu)象，但是成本高和產(chǎn)量低的不足大大限制了該系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用。相對而言，本研究采用的原核表達(dá)系統(tǒng)成本低廉、操作流程簡便快捷，是目前最為廣泛應(yīng)用的蛋白表達(dá)體系。

付濤等[6]人研究未考慮不同生物對同義密碼子的偏好性，稀有密碼子的存在嚴(yán)重影響外源蛋白的表達(dá)量[7]。我們利用密碼子優(yōu)化技術(shù)，合成PCT蛋白全長密碼子優(yōu)化基因，構(gòu)建了PCT蛋白高效表達(dá)體系。莊錫偉等[8]人研究采用熱誘導(dǎo)PCT蛋白的表達(dá)，產(chǎn)生了大量包涵體。本研究采用PCT蛋白和MBP助溶蛋白共表達(dá)聯(lián)合低溫誘導(dǎo)的方式，克服了常見的包涵體問題，獲得了高溶解度的PCT蛋白，MBP融合蛋白的切除可借助位點(diǎn)特異性蛋白酶[9-10]。

本體系大大提升了可溶性PCT蛋白的表達(dá)效率和產(chǎn)量，所獲得PCT蛋白純品能夠在低溫長時間穩(wěn)定儲存且均勻性良好，為臨床實(shí)驗(yàn)室PCT參考品的研發(fā)及PCT蛋白的功能研究奠定了良好基礎(chǔ)。