老年慢性心力衰竭患者血清人類(lèi)母系表達(dá)基因3的水平與預(yù)后的相關(guān)性研究

陳 偉，侯湘嶺（保定市第二醫(yī)院心血管內(nèi)科，河北保定 071000）

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）為常見(jiàn)心血管疾病之一，多發(fā)于老年人，發(fā)病與神經(jīng)內(nèi)分泌、激素代謝、炎性因子等多種因素有關(guān)，可引起臟器血流量灌注不足，造成休克、心臟驟停甚至死亡等嚴(yán)重后果[1]。積極進(jìn)行病情和預(yù)后評(píng)估是改善CHF預(yù)后的關(guān)鍵。近年來(lái)，非編碼RNA在各種疾病發(fā)病中的作用及其表達(dá)受到臨床關(guān)注，既往研究發(fā)現(xiàn)[2]，非編碼RNA參與心血管疾病的發(fā)病。劉崇韜等[3]的研究證實(shí)，急性心肌梗死患者的血清人類(lèi)母系表達(dá)基因3（maternally expressed gene 3，MEG3）顯著升高，可作為急性心肌梗死診斷和病情評(píng)估的標(biāo)志物，但有關(guān)其在CHF患者中表達(dá)的相關(guān)研究仍較為缺乏。此次研究通過(guò)分析老年CHF患者血清MEG3表達(dá)水平，探討其水平表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 回顧性分析保定市第二醫(yī)院2019年1月～12月收治的118例CHF患者的臨床資料，其中男性62例，女性56例；年齡60～80（66.83±5.59）歲；發(fā)病至入院時(shí)間1～4 h，平均2.95±0.61h。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《中國(guó)心力衰竭診斷和治療指南2014》[4]中診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡60～75歲；③美國(guó)紐約心臟病學(xué)會(huì)（New York heart assocication，NYHA）分級(jí)為Ⅱ～Ⅲ級(jí)；④左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fractions，LVEF）＜50%；⑤入組前3個(gè)月內(nèi)無(wú)相關(guān)藥物治療史或臨床新診斷為CHF未治療患者；⑥完成隨訪；⑦臨床資料完善。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴心肌梗死、心肌炎等其他心臟疾病者；②有先天性心臟病史者；③伴感染、惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病者；④伴嚴(yán)重肝、腎功能障礙者；⑤臨床資料不全。

所有患者住院期間均接受規(guī)范藥物治療，收集相關(guān)資料，根據(jù)心功能NYHA分級(jí)[5]，將研究對(duì)象分為心功能Ⅱ級(jí)組和心功能Ⅲ級(jí)組，2組性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、吸煙史、飲酒史、心血管病家族史等基線資料的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。另根據(jù)隨訪結(jié)果將患者分為預(yù)后不良組（隨訪出現(xiàn)心臟事件者）和預(yù)后良好組（隨訪未出現(xiàn)心臟事件者），比較兩組一般資料、血細(xì)胞檢測(cè)（血紅蛋白、白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)）、血糖和血脂、血清學(xué)指標(biāo)、心臟彩超等結(jié)果。本研究方案得到醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后執(zhí)行。

1.2 儀器與試劑 彩色超聲診斷儀（飛利浦公司）；肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme-MB，CK-MB），心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）的酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒（上海華壹生物）；聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀（蘇州阿爾法生物實(shí)驗(yàn)器材有限公司）；Trizol（上海索寶生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 心臟彩超檢查：使用彩色超聲診斷儀沿左室長(zhǎng)軸測(cè)定左室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular endsystolic dimension，LVESD）、左室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD），取心尖四腔切面測(cè)左室射血分?jǐn)?shù)（left wentricular ejection fractions, LVEF）。共測(cè)3個(gè)不同心動(dòng)周期，檢查由5年以上臨床經(jīng)驗(yàn)的專(zhuān)科醫(yī)生進(jìn)行。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)：患者均于心功能檢查當(dāng)天采集肘正中靜脈血6 ml，分為2管，其中1管于3 000 r/min速度下離心15 min，留取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定CK-MB，cTnI。熒光免疫法測(cè)定B型尿鈉肽（B-type natriuretic peptide，BNP）水平。另外1管取250 μl血清樣品，加入750 μl的Trizol，采用Real-time PCR檢測(cè)血清MEG3表達(dá)，根據(jù)目標(biāo)基因設(shè)計(jì)合成上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，內(nèi)參物為GAPDH。PCR反應(yīng)在定量PCR反應(yīng)儀上進(jìn)行，所得結(jié)果用2-△△Ct表示[6]。

1.3.3 隨訪結(jié)果：所有患者出院后均通過(guò)電話+門(mén)診復(fù)查的形式進(jìn)行了至少12個(gè)月的隨訪，每個(gè)月電話隨訪1次，間隔3個(gè)月回院復(fù)查1次心功能，記錄根據(jù)隨訪12個(gè)月期間心臟事件，包括心力衰竭加重再入院、心源性死亡、全因死亡等，出現(xiàn)心臟事件者參照《中國(guó)心力衰竭診斷和治療指南2014》[4]進(jìn)行治療。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采取t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例（%）表示，比較采取χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析，采用多因素Logistic回歸分析明確老年CHF預(yù)后的影響因素，繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic curve，ROC）曲線分析血清MEG3表達(dá)預(yù)測(cè)患者預(yù)后的價(jià)值。

2 結(jié)果

2.1 不同心功能分級(jí)患者的血清學(xué)指標(biāo)及心臟彩超參數(shù)比較 見(jiàn)表1。心功能Ⅲ級(jí)患者的血清CKMB，cTnI，BNP，MEG3表達(dá)和LVESD，LVEDD高于Ⅱ級(jí)患者，LVEF低于Ⅱ級(jí)患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

表1 不同心功能分級(jí)患者血清學(xué)指標(biāo)及心臟彩超參數(shù)比較（±s）

表1 不同心功能分級(jí)患者血清學(xué)指標(biāo)及心臟彩超參數(shù)比較（±s）

項(xiàng) 目 心功能Ⅱ級(jí)（n=32）心功能Ⅲ級(jí)（n=86） t值 P值CK-MB（IU/L） 57.70±5.46 68.19±6.53 8.090 0.000 cTnI （ng/L） 1.95±0.47 2.37±0.63 3.429 0.001 BNP（pg/ml） 336.43±67.38 581.21±98.73 12.932 0.000 MEG3（2-△△Ct） 7.32±2.25 11.65±3.09 7.237 0.000 LVESD（mm） 39.63±7.28 44.18±8.47 2.690 0.008 LVEDD（mm） 53.05±8.78 58.73±9.02 2.956 0.004 LVEF（%） 43.19±5.66 37.55±5.94 4.643 0.000

2.2 心功能分級(jí)與血清CK-MB，cTnI，MEG3表達(dá)及LVESD，LVEDD，LVEF的相關(guān)性 經(jīng)Spearman相關(guān)分析，心功能分級(jí)與CK-MB（r=0.358），cTnI（r= 0.339），BNP（r= 0.406），MEG3表達(dá)（r= 0.472）和LVESD（r= 0.378），LVEDD（r= 0.394）均呈顯著正相關(guān)，與LVEF（r= -0.443）呈顯著負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.3 不同預(yù)后患者的臨床資料比較 見(jiàn)表2。隨訪結(jié)果顯示，118例患者中預(yù)后不良36例，預(yù)后良好82例。預(yù)后不良組患者年齡71～80歲和NYHA分級(jí)Ⅲ級(jí)的占比，血清CK-MB，cTnI，BNP，MEG3表達(dá)和LVESD，LVEDD顯著高于預(yù)后良好組，LVEF顯著低于預(yù)后良好組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

表2 預(yù)后良好組與預(yù)后不良組的單因素比較[n（%），±s]

表2 預(yù)后良好組與預(yù)后不良組的單因素比較[n（%），±s]

類(lèi) 別 預(yù)后良好組（n=82） 預(yù)后不良組（n=36） t/χ2 P值性別 男 43（52.44） 19（52.78） 0.001 0.973女39（47.56） 17（47.22）年齡（歲） 60～70 55（67.07） 16（44.44） 5.345 0.021 71～80 27（32.93） 20（55.56）體質(zhì)量指數(shù)（kg/m2） ≤26 47（57.32） 22（61.11） 0.148 0.700＞26 35（42.68） 14（38.89）吸煙史 有 20（24.39） 11（30.56） 0.491 0.483無(wú)62（75.61） 25（69.44）飲酒史 有 23（28.05） 12（33.33） 0.335 0.563無(wú)59（71.95） 24（66.67）心血管病家族史 有 7（8.54） 2（5.56） 0.299 0.585無(wú)75（91.46） 34（94.44）NYHA分級(jí) Ⅱ級(jí) 28（34.15） 4（11.11） 6.716 0.009Ⅲ級(jí) 54（65.85） 32（88.89）糖尿病 有 24（29.27） 11（30.56） 0.020 0.888無(wú)58（70.73） 25（69.44）高血壓 有 31（37.80） 16（44.44） 0.460b 0.498無(wú)51（62.20） 20（55.56）血紅蛋白 （g/L） 107.62±38.43 114.71±32.75 0.996 0.321白細(xì)胞 （×109/L） 8.19±2.44 7.45±2.01 1.675 0.097淋巴細(xì)胞 （×109/L） 1.50±0.47 1.36±0.39 1.637 0.104三酰甘油 （mmol/L） 1.17±0.41 1.09±0.37 1.014 0.313低密度脂蛋白 （mmol/L） 2.21±0.66 1.99±0.58 1.764 0.080 CK-MB（IU/L） 56.91±6.76 84.84±9.79 14.855 0.000 cTnI（ng/L） 1.87±0.44 3.14±0.87 7.876 0.000 BNP（pg/ml） 320.91±74.13 956.53±121.72 27.650 0.000 MEG3表達(dá)（2-△△Ct） 7.19±2.04 17.96±4.81 12.237 0.000 LVESD（mm） 36.75±7.79 57.06±10.05 10.326 0.000 LVEDD（mm） 52.59±7.11 67.67±9.46 8.189 0.000 LVEF（%） 42.38±5.93 31.56±4.43 10.716 0.000

2.4 老年CHF患者預(yù)后的多因素分析 見(jiàn)表3。以患者預(yù)后作為因變量（預(yù)后不良=1，預(yù)后良好=0），將單因素分析中P＜0.05的變量納入多因素Logistic回歸分析，自變量處理：年齡賦值：60～70歲=0，71～80歲=1；NYHA分級(jí)：Ⅱ級(jí)=0，Ⅲ級(jí)=1；CK-MB，cTnI，BNP，MEG3表達(dá)，LVESD，LVEDD，LVEF均以原始數(shù)據(jù)錄入。結(jié)果顯示，年齡（OR=3.615，95%CI：1.189～10.991），NYHA分級(jí)（OR=3.911，95%CI：1.324～11.553），血清CK-MB（OR=3.554，95%CI：1.397～9.041），cTnI（OR=4.193，95%CI：1.583～11.106），BNP（OR=2.842，95%CI：1.319～6.124），MEG3表達(dá)（OR=5.003，95%CI：1.297～19.298），LVEF（OR=0.396，95%CI：0.184～0.876）是預(yù)后影響因素（均P＜0.05）。

表3 老年CHF患者預(yù)后的多因素Logistic回歸分析

2.5 血清MEG3表達(dá)預(yù)測(cè)老年CHF患者預(yù)后的ROC曲線 見(jiàn)圖1。以患者隨訪12個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)心臟不良事件為終點(diǎn)，血清MEG3表達(dá)為自變量，繪制血清MEG3表達(dá)預(yù)測(cè)老年CHF患者預(yù)后的ROC曲線下面積0.874（95%CI：0.778～0.948），截?cái)嘀禐?2.52×2-△△Ct時(shí)，敏感度與特異度分別為0.869，0.724。

圖1 血清MEG3表達(dá)預(yù)測(cè)老年CHF患者預(yù)后的ROC曲線

3 討論

慢性心力衰竭（CHF）是一種復(fù)雜的病理狀態(tài)，一旦發(fā)生即便處于臨床穩(wěn)定階段，病情仍會(huì)不斷發(fā)

展。證據(jù)表明[7]，CHF患者出現(xiàn)明顯癥狀后的5年和10年存活率分別在40%和20%左右。早期診斷并積極進(jìn)行預(yù)后評(píng)估對(duì)提高CHF患者治療效果、預(yù)防并發(fā)癥、提高生存率具有重要意義。CHF發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，加之個(gè)人體質(zhì)的不同，給患者的預(yù)后評(píng)估帶來(lái)困難。

研究發(fā)現(xiàn)[8]，CHF患者的多種生物標(biāo)志物濃度升高，其在患者預(yù)后評(píng)估中的作用也受到認(rèn)可，是疾病預(yù)后預(yù)測(cè)的簡(jiǎn)便方法。如何在眾多生物標(biāo)志物中尋找到敏感度和特異度高、檢測(cè)快速準(zhǔn)確的理想生物標(biāo)志物引起關(guān)注。以往臨床多采用血清BNP對(duì)CHF患者預(yù)后進(jìn)行評(píng)估和預(yù)測(cè)，BNP水平的變化與心室容積、壓力負(fù)荷等有關(guān)，CHF患者心臟容量負(fù)荷增大，心室壁壓力增大，使心肌細(xì)胞分泌更多的BNP，因此CHF患者的血清BNP水平異常升高，且與心功能分級(jí)呈正相關(guān)[9]。CK-MB，cTnI均是反映心肌細(xì)胞損傷程度的標(biāo)志物，也常被臨床用于CHF患者的預(yù)后評(píng)估中。CHF患者隨著病情的加重，心肌損傷程度加重，心功能分級(jí)也因此升高[10]。本研究結(jié)果也證實(shí)，心功能Ⅲ級(jí)患者的血清CK-MB，cTnI，BNP均顯著高于Ⅱ級(jí)患者，且與心功能分級(jí)呈正相關(guān)，是CHF患者預(yù)后的影響因素（P＜0.05），與以往研究結(jié)論相符[11]。另外，LVEF也是CHF預(yù)后的影響因素，這可能與CHF患者交感神經(jīng)系統(tǒng)、腎素-血管緊張素系統(tǒng)被激活，水鈉潴留，損傷心肌并引起結(jié)構(gòu)重塑，造成心肌收縮性和順應(yīng)性下降，LVEF減小[12]。而心肌收縮性和順應(yīng)性下降是CHF患者心臟不良事件的重要病理過(guò)程，這是LVEF成為預(yù)后影響因素的主要原因之一。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNAs，lnc RNAs）是無(wú)蛋白質(zhì)編碼功能的RNA，占人類(lèi)基因組基因98%左右，廣泛參與機(jī)體生物學(xué)功能[13]。研究發(fā)現(xiàn)[14]，lncRNAs在心臟發(fā)育、心血管疾病也有一定調(diào)控作用，可為心血管疾病提供治療靶點(diǎn)。有專(zhuān)家[15]對(duì)心肌成纖維細(xì)胞的全lncRNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)，lncRNA MEG3在心肌成纖維細(xì)胞中高表達(dá)且呈現(xiàn)差異。進(jìn)一步體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)[16]，沉默MEG3基因可啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，預(yù)防心肌纖維化和心臟收縮與舒張功能失調(diào)。在心臟方面對(duì)lncRNAs的研究仍處于起步階段，有關(guān)lncRNA MEG3與CHF疾病的研究仍鮮有報(bào)道。外周血中含穩(wěn)定表達(dá)的lncRNAs，其在心肌組織中的表達(dá)具有組織特異度，對(duì)心肌重塑、心肌再生等有獨(dú)特功能特性，這是其作為心血管疾病靶向分子和生物標(biāo)志物的理論基礎(chǔ)[17]。本研究檢測(cè)了CHF患者的血清MEG3表達(dá)，結(jié)果顯示，心功能Ⅲ級(jí)患者的血清MEG3表達(dá)顯著高于Ⅱ級(jí)患者，且與心功能分級(jí)有顯著相關(guān)性。這一結(jié)果考慮與MEG3可調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)，CHF患者早期，心臟壓力增大、細(xì)胞凋亡，觸發(fā)心肌細(xì)胞發(fā)生代償性增生。隨著病情進(jìn)展，心肌負(fù)荷進(jìn)一步增加，心肌細(xì)胞的增生/凋亡平衡再次被打破，導(dǎo)致心功能進(jìn)行性下降。MEG3可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，加速心肌細(xì)胞增生/凋亡平衡的破壞，因此MEG3高表達(dá)患者的心功能分級(jí)往往更高。VIERECK等[18]的研究也發(fā)現(xiàn)，正常狀態(tài)下人血清lncRNA MEG3表達(dá)極低，心肌梗死的發(fā)生會(huì)造成血清lncRNA MEG3大幅上調(diào)，其對(duì)于心肌損傷的評(píng)估有一定價(jià)值，與本研究結(jié)論一致。血管內(nèi)皮細(xì)胞位于血管最里層，內(nèi)皮細(xì)胞障礙會(huì)引發(fā)高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等。再內(nèi)皮化是血管損傷修復(fù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，依賴(lài)于內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，MEG3表達(dá)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖既有促進(jìn)作用也有抑制作用，與所處的細(xì)胞周期和條件以及MEG3表達(dá)水平的不同有關(guān)，因此MEG3表達(dá)對(duì)血管形成、心臟重構(gòu)等過(guò)程具有調(diào)控作用[19]。已有證據(jù)表明[20]，冠狀動(dòng)脈疾病大鼠的血清MEG3表達(dá)較正常動(dòng)脈組織的大鼠出現(xiàn)明顯變化。動(dòng)物實(shí)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)[21]，微小RNA-21可調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成，拮抗心肌細(xì)胞損傷。而MEG3可通過(guò)對(duì)微小RNA-21表達(dá)的調(diào)控影響心肌細(xì)胞的增殖和血管內(nèi)皮功能，從而保護(hù)心肌細(xì)胞，改善心功能。也有專(zhuān)家發(fā)現(xiàn)[22]，心臟重構(gòu)早期抑制MEG3表達(dá)可降低基質(zhì)金屬蛋白酶2活性從而減輕心肌纖維化和肥大，保護(hù)心臟。本研究多因素Logistic回歸分析顯示，血清MEG3表達(dá)是預(yù)后影響因素，對(duì)預(yù)后有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值，加之MEG3表達(dá)情況可通過(guò)血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，可重復(fù)性高，對(duì)患者損傷小。夏芳等[23]分析了5種生物標(biāo)志物診斷心力衰竭的價(jià)值，但其對(duì)預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值有限。黃暉等[24]的研究顯示，強(qiáng)離子隙對(duì)急性心力衰竭也有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值，但對(duì)檢測(cè)設(shè)備的要求較高，且需要?jiǎng)討B(tài)監(jiān)測(cè)陰離子隙、血液鉀離子、pH值等多項(xiàng)指標(biāo)來(lái)計(jì)算強(qiáng)離子隙，過(guò)程較為復(fù)雜與繁瑣。因此與上述研究相比，本研究結(jié)果表明血清MEG3表達(dá)是具有較高推廣價(jià)值的心力衰竭預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

綜上所述，老年CHF患者血清MEG3表達(dá)與心功能分級(jí)呈顯著正相關(guān)，是患者預(yù)后影響因素，且操作簡(jiǎn)便，可通過(guò)積極檢測(cè)患者血清MEG3表達(dá)水平預(yù)測(cè)患者預(yù)后。本研究局限之處在于隨訪時(shí)間尚短，且為單中心研究，另外本研究為回顧性分析，患者檢測(cè)的生物學(xué)標(biāo)志物可能不全面，有待后續(xù)完善。