氨肽酶P2在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)及臨床意義

蘇引利，李琳琳，莫佳婭，段浩然，張嘉琳，王秋杰，秦利影，吳 晗，謝 婭

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,河南 鄭州 450052；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，河南 鄭州 450052；3.鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)院,河南 鄭州 450052)

卵巢癌是常見的女性惡性生殖系統(tǒng)腫瘤，其死亡率位于婦科惡性腫瘤之首[1]，全球年齡標(biāo)準(zhǔn)化的5 a凈生存率大多在30%～50%之間[2]。目前卵巢癌的主要治療方法為手術(shù)和化療，由于其早期臨床癥狀無特異性，80%的患者就診時已達(dá)中晚期，但即便是中晚期患者，有效的腫瘤減滅術(shù)仍可延長患者的生存時間[3-4]，而首次手術(shù)后癌殘存灶大小是影響預(yù)后的關(guān)鍵因素之一。因此，無論是早診斷還是手術(shù)完全切除原發(fā)癌灶和轉(zhuǎn)移灶對中晚期卵巢癌患者的治療都有著重要的作用。

氨基肽酶P2(XPNPEP2)編碼673個氨基酸的膜結(jié)合蛋白，定位于染色體Xq25-26.1上，是以Xaa-Pro作為識別位點(diǎn)廣泛存在于生物體的一種N-末端亞胺鍵的水解酶[5]。體內(nèi)存在廣泛含有Xaa-Pro位點(diǎn)的活性肽為其底物，如激素、生長因子、神經(jīng)遞質(zhì)等[6]。但既往對于XPNPEP2的研究多集中于XPNPEP2參與緩激肽代謝[7]，與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑誘導(dǎo)的血管性水腫有關(guān)，繼而引發(fā)咳嗽[8]、低血壓[9]等癥狀。近年來，XPNPEP2在腫瘤中的調(diào)控作用受到重視。XPNPEP2在宮頸癌、胃癌、結(jié)直腸癌和乳腺癌組織中表達(dá)較正常組織上調(diào)，并且在結(jié)直腸癌和乳腺癌與疾病進(jìn)展和患者的不良預(yù)后有關(guān)[10-14]。Cheng等[14]的研究表明，XPNPEP2通過誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變促進(jìn)宮頸癌發(fā)展。最近，有文獻(xiàn)報道XPNPEP2是組織金屬蛋白酶抑制劑1(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1,TMTP1)的靶蛋白之一[15]，TMTP1是一種新型腫瘤歸巢肽[16-17]，能識別并結(jié)合原位腫瘤和血管源性或轉(zhuǎn)移性腫瘤組織表面的特異性受體[18]，被用作抗腫瘤藥物的輸送載體，如聯(lián)合抗菌肽D2[19]、白喉毒素[20]、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體[21]以及順鉑和紫杉醇前體藥物[22]等。TMTP1不僅準(zhǔn)確靶向腫瘤組織提高抗腫瘤療效，還能減輕脫靶導(dǎo)致的藥物毒性。但是，XPNPEP2/TMTP1能否作為用藥載體靶向識別卵巢癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶尚無明確定論。

目前，上皮性卵巢癌作為一種高度侵襲性腫瘤，XPNPEP2在其中的表達(dá)情況尚未有詳細(xì)報道。本文中我們運(yùn)用免疫組化和蛋白印跡的方法檢測XPNPEP2蛋白在正常卵巢組織、上皮性卵巢癌原發(fā)灶及與之配對的轉(zhuǎn)移癌灶和癌旁組織中的表達(dá)情況，并分析其與上皮性卵巢癌臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2019年1月至2021年9月于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院確診為上皮性卵巢癌并經(jīng)過手術(shù)治療的患者40例，所取腫瘤原發(fā)灶標(biāo)本均經(jīng)病理確診為上皮性卵巢癌，其臨床分期采用國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)制定的卵巢癌手術(shù)-病理分期(FIGO，2014年)標(biāo)準(zhǔn)。并同時取患者轉(zhuǎn)移至大網(wǎng)膜的轉(zhuǎn)移癌灶和癌旁組織35例。收集非癌患者經(jīng)手術(shù)所取的正常卵巢組織標(biāo)本15例作為對照。本次標(biāo)本使用已經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)。本組病例收集情況見表1。

表1 XPNPEP2表達(dá)與上皮性卵巢癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系 n(%)

1.2 主要試劑免疫組化一抗XPNPEP2(25945-1-AP)、二抗HRP標(biāo)記的山羊抗兔(GB23303)、DAB顯色試劑盒(G1211)、蘇木素染色劑購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.3 蛋白印跡將綠豆粒大小組織放入1.5 mL離心管中，加適量組織裂解液(每mL RIPA裂解液內(nèi)含100 mmol/L的苯甲基磺酰氟10 μL)并放入2～3顆研磨珠；震蕩研磨儀研磨；超聲裂解組織細(xì)胞；4 ℃、12 000 r/min離心15 min取上清；用二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒配平各樣品蛋白濃度后，加入1/4體積蛋白上樣緩沖液；100 ℃金屬浴10 min變性；質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠80 V電泳90 min分離蛋白，300 mA電流2 h將蛋白全部轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜；質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂牛奶封閉2 h；兔抗人XPNPEP2多克隆抗體(11 000)一抗4 ℃孵育過夜；二抗(14 000)室溫孵育2 h；漂洗后ECL發(fā)光試劑盒顯色。使用Image J軟件測定蛋白相對表達(dá)量。以β-actin(14 000)作為蛋白表達(dá)的內(nèi)參。

1.4 免疫組化將直徑1 cm左右的標(biāo)本組織浸泡于組織固定液中，將組織經(jīng)過脫水、滲透及石蠟包埋，將蠟塊以4 μm做連續(xù)切片，篩選出完整的樣本切片首先做HE染色，以確定所取組織為目標(biāo)組織。然后將與之對應(yīng)的樣本切片進(jìn)行免疫組化染色。首先將切片置于恒溫箱中烘烤脫蠟；再經(jīng)過二甲苯、梯度酒精脫蠟脫水；組織切片依次進(jìn)行抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、血清封閉、XPNPEP2一抗孵育過夜、HRP標(biāo)記二抗孵育50 min、DAB顯色、蘇木精復(fù)染細(xì)胞核、自來水分化、最后脫水及中性樹脂封片。切片于正置顯微鏡觀察、圖像采集分析。

1.5 結(jié)果判斷免疫組化結(jié)果由2名有經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)員進(jìn)行雙盲法閱片，并進(jìn)行評分。切片中符合病理類型的細(xì)胞中出現(xiàn)棕色或褐色為XPNPEP2結(jié)果陽性細(xì)胞，按照組織染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞面積進(jìn)行綜合評分。先將染色深淺與背景著色對比，再進(jìn)行染色強(qiáng)度打分：無色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。陽性細(xì)胞所占的百分比打分：陰性為0分，陽性細(xì)胞≤10%為1分，>10%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分。評分標(biāo)準(zhǔn)為兩項(xiàng)評分相乘，得分為0～3分評估為XPNPEP2低表達(dá)，4～12分評估為XPNPEP2高表達(dá)。

1.6 數(shù)據(jù)庫使用基因表達(dá)譜動態(tài)分析數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn/)繪制分析XPNPEP2高表達(dá)與低表達(dá)患者的疾病無進(jìn)展生存期和總生存期的關(guān)系[23]。

2 結(jié)果

2.1 XPNPEP2在不同卵巢組織中的表達(dá)XPNPEP2主要定位在上皮性卵巢癌原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移癌灶腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕褐色顆粒。XPNPEP2蛋白在上皮性卵巢癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移癌灶呈高表達(dá)(4～12分)。而在正常卵巢組織及癌旁組織呈低表達(dá)(0～3分)，表現(xiàn)為正常細(xì)胞質(zhì)內(nèi)及細(xì)胞膜無染色或部分細(xì)胞略呈淡黃色。

2.1.1 XPNPEP2在正常卵巢組織和上皮性卵巢癌原發(fā)灶中的表達(dá) 免疫組化染色結(jié)果顯示，XPNPEP2在正常卵巢組織中多為低表達(dá)，高表達(dá)率13.33%(2/15)，而在上皮性卵巢癌原發(fā)灶中多為高表達(dá)，高表達(dá)率為82.50%(33/40)(χ2=22.553，P<0.001)。蛋白印跡結(jié)果顯示，上皮性卵巢癌原發(fā)灶中XPNPEP2蛋白相對表達(dá)量為0.893±0.214，明顯高于正常卵巢組織的0.269±0.155(t=4.843,P= 0.001)。見圖1、2。

圖1 免疫組化染色檢測XPNPEP2在正常卵巢組織和上皮性卵巢癌原發(fā)灶組織中的表達(dá)

圖2 蛋白印跡檢測XPNPEP2在正常卵巢組織和上皮性卵巢癌原發(fā)灶組織中的表達(dá)

2.1.2 XPNPEP2在癌旁和轉(zhuǎn)移癌灶組織中的表達(dá) 免疫組化染色結(jié)果顯示，XPNPEP2在癌旁組織中多為低表達(dá)，高表達(dá)率為14.29%(5/35)，而在轉(zhuǎn)移癌灶組織中多為高表達(dá)，高表達(dá)率為91.43%(32/35)(χ2=41.794，P<0.001)。蛋白印跡結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)移癌灶組織中XPNPEP2蛋白的相對表達(dá)量為1.032±0.202，明顯高于癌旁組織的0.276±0.176(t=6.237，P<0.001)。見圖3、4。

圖3 免疫組化染色檢測XPNPEP2在癌旁組織和轉(zhuǎn)移癌灶組織中的表達(dá)

2.1.3 XPNPEP2在上皮性卵巢癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移癌灶組織中的表達(dá) 免疫組化染色結(jié)果顯示，XPNPEP2在上皮性卵巢癌原發(fā)灶[82.50%(33/40)]和轉(zhuǎn)移癌灶[91.43%(32/35)]中均多為高表達(dá)，比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.631，P=0.427)。蛋白印跡結(jié)果顯示，上皮性卵巢癌原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移癌灶中XPNPEP2蛋白的表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.624，P=0.549)。見圖5、6。

圖4 蛋白印跡檢測XPNPEP2在癌旁組織和轉(zhuǎn)移癌灶組織中的表達(dá)

圖5 XPNPEP2在上皮性卵巢癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移癌灶組織中的表達(dá)

2.2 卵巢癌患者XPNPEP2蛋白的表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系上皮性卵巢癌患者XPNPEP2表達(dá)水平與患者年齡、病理類型、分化程度、腫瘤大小、腹水以及FIGO分期均無相關(guān)性(χ2=0.519，P=0.471；P=0.204；χ2=0.275，P=0.600；χ2=0.132，P=0.716；χ2=0.519，P=0.471；χ2=3.680，P=0.055)。見表2。

2.3 XPNPEP2蛋白表達(dá)與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系為了解XPNPEP2在卵巢癌中高表達(dá)是否與患者的預(yù)后有關(guān)系，我們從GEPIA在線分析數(shù)據(jù)庫提取398例卵巢癌患者信息發(fā)現(xiàn)，XPNPEP2高表達(dá)組與低表達(dá)組的疾病無進(jìn)展生存、總生存比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.900、0.099)。見圖7。

圖6 蛋白印跡檢測XPNPEP2在上皮性卵巢癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移癌灶組織中的表達(dá)

圖7 不同XPNPEP2表達(dá)卵巢癌患者疾病無進(jìn)展生存曲線(左)與總生存曲線(右)比較

3 討論

上皮性卵巢癌是最常見的卵巢癌類型，常見于50歲以上患者。目前，上皮性卵巢癌治療重難點(diǎn)在于早診斷、早治療，亟需發(fā)現(xiàn)新的治療方法、改善藥物輸送等來提高患者的生存率并改善其預(yù)后[24]。

XPNPEP2主要在腎臟、前列腺、結(jié)腸、肝臟及胰腺組織中表達(dá)，在卵巢組織中幾乎不表達(dá)。也有證據(jù)表明其在宮頸癌、胃癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌和乳腺癌中表達(dá)高于正常組織，但在卵巢癌中表達(dá)情況尚不明確。羅丹楓[15]等通過檢測5例卵巢癌原發(fā)灶、正常卵巢組織和2例遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移癌灶標(biāo)本中XPNPEP2的RNA發(fā)現(xiàn)，XPNPEP2在原發(fā)灶中的表達(dá)要遠(yuǎn)高于正常組織，且在2例轉(zhuǎn)移灶中XPNPEP2的表達(dá)和正常組織差別不顯著，但由于標(biāo)本量過少限制其可靠性。本研究通過收集40例上皮性卵巢癌原發(fā)灶和配對的35例轉(zhuǎn)移灶、癌旁組織及15例正常卵巢組織發(fā)現(xiàn)，XPNPEP2在上皮性卵巢癌原發(fā)灶中的表達(dá)顯著高于正常卵巢組織，在轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，而在上皮性卵巢癌原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移癌灶中表達(dá)無明顯差異。

為進(jìn)一步探討XPNPEP2高表達(dá)在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，我們分析XPNPEP2與上皮性卵巢癌患者的臨床病理特征相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，XPNPEP2在卵巢癌組織中的表達(dá)高低與患者年齡、病理類型、分化程度、腫瘤大小、有無腹水以及FIGO分期均無關(guān)。通過GEPIA數(shù)據(jù)庫對398例卵巢癌患者進(jìn)行生存分析發(fā)現(xiàn)，盡管卵巢癌患者XPNPEP2低表達(dá)組與高表達(dá)組的生存率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但XPNPEP2低表達(dá)組5 a生存曲線始終在高表達(dá)組之上，提示其可能與不良預(yù)后相關(guān)。本研究所收集標(biāo)本主要為Ⅲ～Ⅳ期，Ⅰ～Ⅱ期上皮性卵巢癌數(shù)據(jù)較少，后續(xù)需擴(kuò)大樣本量分析XPNPEP2對卵巢癌患者預(yù)后的影響。

2009年XPNPEP2被證實(shí)為腫瘤歸巢肽TMTP1的受體[15]。Yang等[16]經(jīng)過體外體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TMTP1可特異性結(jié)合到一系列中高度轉(zhuǎn)移潛能腫瘤細(xì)胞，但不與低度轉(zhuǎn)移潛能或非轉(zhuǎn)移性細(xì)胞結(jié)合。靜脈注射結(jié)合熒光素的TMTP1經(jīng)24 h即可強(qiáng)烈并特異性靶向小鼠的轉(zhuǎn)移灶，甚至是隱匿性轉(zhuǎn)移灶。與之一致，雖然XPNPEP2在前列腺癌組織中的表達(dá)低于正常前列腺組織，但在有局部侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的前列腺癌組織中表達(dá)高于局限性前列腺癌組織[25]。但我們的結(jié)果顯示XPNPEP2在卵巢癌原發(fā)灶和與轉(zhuǎn)移癌灶中表達(dá)無明顯差異，提示XPNPEP2在不同類型腫瘤原發(fā)癌灶的表達(dá)有差異。因此，TMTP1、XPNPEP2不僅可以作為臨床工作中區(qū)分原發(fā)性惡性腫瘤和轉(zhuǎn)移性腫瘤的標(biāo)志物，也可利用熒光顯影術(shù)標(biāo)記XPNPEP2實(shí)時準(zhǔn)確定位轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行手術(shù)切除。此外，作為廣泛用于抗腫瘤藥物的輸送載體，TMTP1可能通過特異性識別轉(zhuǎn)移性腫瘤組織表面的XPNPEP2受體，用于準(zhǔn)確定位腫瘤轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行腫瘤的靶向治療。本研究發(fā)現(xiàn)XPNPEP2在上皮性卵巢癌及其轉(zhuǎn)移癌灶中均高表達(dá)，為后期開發(fā)XPNPEP2、TMTP1示蹤劑進(jìn)行手術(shù)準(zhǔn)確定位上皮性卵巢癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶、優(yōu)化藥物載體進(jìn)行腫瘤精準(zhǔn)治療提供理論依據(jù)。