HPLC法同時(shí)測(cè)定小兒七星茶顆粒中9種鉤藤成分

陳素云， 周 恒， 趙曉彤， 曹依敏， 黃曉靜， 季 申*

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海 201203；2.上海市食品藥品檢驗(yàn)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中藥質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203)

小兒七星茶顆粒是常用小兒消食藥，由薏苡仁、山楂、稻芽、淡竹葉、鉤藤、蟬蛻、甘草7味中藥組成，具有開(kāi)胃消滯、清熱定驚的功效，臨床上主要用于小兒積滯化熱、消化不良、夜寐不安等癥狀的治療[1]，收載于2020年版《中國(guó)藥典》一部，但現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)方中甘草、山楂藥味規(guī)定了薄層鑒別、含量測(cè)定等項(xiàng)目[2]。課題組前期發(fā)現(xiàn)，小兒七星茶顆粒中歸屬于鉤藤的主要色譜峰數(shù)量與甘草相當(dāng)，遠(yuǎn)多于其他藥味，但目前缺乏對(duì)其所含成分的專屬質(zhì)量控制方法。因此，本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上結(jié)合文獻(xiàn)[3-5]，建立HPLC法同時(shí)測(cè)定小兒七星茶顆粒中喜果苷、二氫卡丹賓、異去氫鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異鉤藤堿、鉤藤堿、去氫毛鉤藤堿、毛鉤藤堿、縫子嗪甲醚9種鉤藤成分的含量，以期為該制劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；XSE105電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；Elmasonic E100H超聲波清洗儀(德國(guó)Elma公司)；Milli-Q型超純水系統(tǒng)(美國(guó)Milipore公司)。喜果苷對(duì)照品(上海同田生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)20081424，純度99.4%)；二氫卡丹賓(批號(hào)6072，純度98.2%)、異去氫鉤藤堿(批號(hào)2557，純度99.9%)、去氫鉤藤堿(批號(hào)4075，純度98.9%)、去氫毛鉤藤堿(批號(hào)4170，純度98.9%)、毛鉤藤堿(批號(hào)6068，純度98.9%)、縫子嗪甲醚(批號(hào)6069，純度98.1%)對(duì)照品(上海詩(shī)丹德生物技術(shù)有限公司)；異鉤藤堿(批號(hào)111927-201102)、鉤藤堿(批號(hào)112028-201601)對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院)。小兒七星茶顆粒共56批(編號(hào)1～56)，均為市售，具體信息見(jiàn)表1，缺鉤藤陰性樣品由相關(guān)企業(yè)提供。乙腈、甲醇為色譜純(德國(guó)Merck公司)；二乙胺、氨水為分析純(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent Extend C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈(A)-0.015%二乙胺(B)，梯度洗脫，程序見(jiàn)表2；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)246 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取喜果苷、二氫卡丹賓、異去氫鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異鉤藤堿、鉤藤堿、去氫毛鉤藤堿、毛鉤藤堿、縫子嗪甲醚對(duì)照品適量，加乙腈制成每1 mL各含1 mg上述成分的貯備液，精密量取適量，甲醇定容至20 mL，即得(質(zhì)量濃度為50 μg/mL)，并用甲醇逐級(jí)稀釋至1、2、5、10、20 μg/mL，在4 ℃下保存。

2.2.2 供試品溶液 取本品粉末約5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50 mL甲醇，稱定質(zhì)量，超聲(功率300 W、頻率40 kHz)處理30 min，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液20 mL，水浴蒸至近干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜? mL，搖勻，微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按工藝及處方制備缺鉤藤的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性考察 精密吸取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液各10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知，陰性無(wú)干擾，表明該方法專屬性良好。

1.喜果苷 2.二氫卡丹賓 3.異去氫鉤藤堿 4.去氫鉤藤堿 5.異鉤藤堿 6.鉤藤堿 7.去氫毛鉤藤堿 8.毛鉤藤堿 9.縫子嗪甲醚1.vincosamide 2.3α-dihydrocadambine 3.isocorynoxeine4.corynoxeine 5.isorhynchophylline 6.rhynchophylline7.corynantheine 8.hirsutine 9.geissoschizine methyl ether圖1 各成分HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下不同質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液各10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表3，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表3 各成分線性關(guān)系考察

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取10 μg/mL對(duì)照品溶液10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得喜果苷、二氫卡丹賓、異去氫鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異鉤藤堿、鉤藤堿、去氫毛鉤藤堿、毛鉤藤堿、縫子嗪甲醚峰面積RSD分別為0.2%、0.3%、0.4%、0.1%、0.7%、0.4%、0.2%、0.7%、0.2%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.3.4.1 對(duì)照品溶液 精密吸取10 μg/mL對(duì)照品溶液10 μL，于0、1、2、3、4、24 h在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得喜果苷、二氫卡丹賓、異去氫鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異鉤藤堿、鉤藤堿、去氫毛鉤藤堿、毛鉤藤堿、縫子嗪甲醚的峰面積RSD分別為0.4%、0.4%、1.3%、0.8%、2.9%、2.5%、0.3%、0.6%、0.3%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4.2 供試品溶液 取本品粉末(編號(hào)4)適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL，于0、1、3、15、24 h在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，除異去氫鉤藤堿未檢出外，測(cè)得喜果苷、二氫卡丹賓、去氫鉤藤堿、異鉤藤堿、鉤藤堿、去氫毛鉤藤堿、毛鉤藤堿、縫子嗪甲醚峰面積RSD分別為1.2%、1.5%、1.2%、2.1%、0.2%、0.4%、0.8%、0.8%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品粉末(編號(hào)4)適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，除異去氫鉤藤堿未檢出外，測(cè)得喜果苷、二氫卡丹賓、去氫鉤藤堿、異鉤藤堿、鉤藤堿、去氫毛鉤藤堿、毛鉤藤堿、縫子嗪甲醚含量RSD分別為2.1%、2.5%、3.7%、1.3%、1.5%、1.4%、1.3%、1.3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取本品粉末(編號(hào)4)2.5 g，共9份，置于具塞錐形瓶中，以3份為一組，每組分別精密加入50 μg/mL對(duì)照品溶液0.25、0.5、1 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，喜果苷、二氫卡丹賓、異去氫鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異鉤藤堿、鉤藤堿、去氫毛鉤藤堿、毛鉤藤堿、縫子嗪甲醚平均加樣回收率分別為95.3%、92.6%、97.4%、98.6%、91.6%、104.9%、97.3%、94.9%、95.7%，RSD分別為5.2%、4.0%、1.8%、5.5%、2.5%、2.8%、2.7%、4.0%、3.8%。

2.4 樣品含量測(cè)定 取56批樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法各平行制備2份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 各成分含量測(cè)定結(jié)果(μg/g，n=2)

3 討論

3.1 色譜條件選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了Extend C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、XBridge C18(4.6 mm×100 mm，3.5 μm)、XBridge Shield RP 18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、TechMate C18ST(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，發(fā)現(xiàn)Extend C18柱對(duì)9種鉤藤成分的分離效果最優(yōu)。再比較了乙腈-0.015%二乙胺[4]、甲醇-0.1%三乙胺(冰醋酸調(diào)pH值7.5)[6-8]，最終確定前者作為流動(dòng)相。

3.2 對(duì)照品稀釋溶劑選擇 鉤藤中部分生物堿的穩(wěn)定性較差，對(duì)溶劑較敏感，容易發(fā)生互變異構(gòu)[9-12]。本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇、70%甲醇對(duì)9種鉤藤成分穩(wěn)定性的影響，最終確定前者作為對(duì)照品稀釋溶劑。

3.3 供試品提取溶劑選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇、1%氨水甲醇、氨水-二氯甲烷-甲醇(1∶5∶5)[13]、氨試液-三氯甲烷(2∶7)[14]的提取效果，最終確定甲醇作為供試品提取溶劑。

3.4 含量分析 11個(gè)廠家56批樣品中9種鉤藤成分的種類和含量存在較大差異，而且有2批未檢出所有成分，可能與藥材質(zhì)量、生產(chǎn)工藝等因素有關(guān)，值得關(guān)注。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)首次建立HPLC法同時(shí)測(cè)定小兒七星茶顆粒中喜果苷、二氫卡丹賓、異去氫鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異鉤藤堿、鉤藤堿、去氫毛鉤藤堿、毛鉤藤堿、縫子嗪甲醚9種鉤藤成分的含量，該方法操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，可為該制劑的質(zhì)量控制及評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。