踝節(jié)菌屬真菌、膠孢炭疽菌化學成分的研究

魏漢楠， 楊中鐸， 張義飛， 茍文博， 呂 敏， 張 干， 王 麗

(蘭州理工大學，甘肅 蘭州 730050)

內(nèi)生真菌廣泛存在于植物中，與宿主形成了和諧的共生關系，為宿主提供保護。踝節(jié)菌屬真菌Talaromyces又稱為籃狀菌，是一種在海洋和陸地中廣泛分布的真菌。研究發(fā)現(xiàn)，踝節(jié)菌屬的內(nèi)生真菌能夠代謝出很多結構新穎的化合物[1]。因此，本研究對踝節(jié)菌屬真菌Talaromycesaurantiacus在燕麥片培養(yǎng)基下發(fā)酵得到的次級代謝產(chǎn)物進行化學成分研究，從中分離到4個化合物，其中化合物10～11為首次從踝節(jié)菌屬真菌T.aurantiacus分離。本課題組之前從植物鉤藤中分離得到了內(nèi)生真菌ColletotrichumgloeosporioidesGT-7(GenBank收錄號KR911618)，經(jīng)過測定發(fā)現(xiàn)其PDB培養(yǎng)基的發(fā)酵產(chǎn)物對單胺氧化酶擁有較高的活性，IC50值為17.79 μmol/L，通過活性跟蹤，發(fā)現(xiàn)了4個結構新穎的酰胺類化合物colletotrilactam A～D[2]。為了能夠得到更多結構新穎的化合物，本研究選用綠豆固體培養(yǎng)基對該真菌進行發(fā)酵，研究其化學成分，從中分離到7個化合物，其中化合物4～7為首次膠孢炭疽菌C.gloeosporioides分離得到。

1 材料

1.1 儀器 YXQ-SG46-280SA型不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌鍋、HPX-9162MBE型數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱(上海博訊實業(yè)有限公司)；JJ-CJ-ID型超凈工作臺(杭州凈化設備廠)；SHZ-82型恒溫震搖箱(常州國華電器有限公司)；RE-5286A型旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；NP7000C型高效液相色譜儀(江蘇漢邦科技有限公司)；YMC-Pack ODS-A色譜柱(10 mm×250 mm，5 μm，日本YMC公司)；0.45 μm微孔過濾器(美國Gibco公司)。

1.2 試劑 乙酸乙酯(工業(yè)純，蘭州西固永達化工廠)；甲醇(色譜純，天津康科德科技有限公司)。

1.3 菌株 鉤藤內(nèi)生真菌ColletotrichumgloeosporioidesGT-7(GenBank收錄號KR911618)由課題組前期從鉤藤中分離得到，保存于蘭州理工大學生命科學與工程學院。踝節(jié)菌屬真菌Talaromycesaurantiacus購自中國微生物菌種查詢網(wǎng)(http://www.biobw.org)，菌株編號bio-81655，保存于蘭州理工大學生命科學與工程學院。

2 提取與分離

2.1 膠孢炭疽菌 將菌種接種至PDA培養(yǎng)基后，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，作為種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)完成后接種至121 ℃高壓滅菌30 min的綠豆培養(yǎng)基中(500 mL錐形瓶中加入80 g綠豆、100 mL蒸餾水)，在28 ℃下培養(yǎng)45 d，其間定期噴灑醫(yī)用酒精進行殺菌。將發(fā)酵完全的綠豆培養(yǎng)基曬干后研磨成粉，以乙酸乙酯浸泡提取，得發(fā)酵物粗浸膏25 g，經(jīng)大孔吸附樹脂柱層析，乙醇-水(1∶9～9∶1)梯度洗脫，得Fr.A～Fr.E。

Fr.A(2.1 g)經(jīng)MCI柱層析，甲醇-水(2∶8～1∶0)梯度洗脫，得Fr.A-1～Fr.A-4，F(xiàn)r.A-2(523 mg)經(jīng)硅膠柱層析，氯仿-甲醇(50∶1～2∶1)梯度洗脫，得化合物1(27 mg)。Fr.B(1.4 g)經(jīng)硅膠柱層析，氯仿-甲醇(100∶1～10∶1)梯度洗脫，得化合物2(15 mg)、Fr.B-2，F(xiàn)r.B-2(350 mg)經(jīng)硅膠柱層析，氯仿-甲醇(150∶1～50∶1)梯度洗脫，得化合物3(3 mg)、4(4.1 mg)。Fr.C(2.2 g)經(jīng)MCI柱層析，甲醇-水(2∶8～1∶0)梯度洗脫，得Fr.C-1～Fr.C-4，F(xiàn)r.C-1(355 mg)經(jīng)硅膠柱層析，石油醚-丙酮(100∶1～5∶1)梯度洗脫，得化合物5(3.2 mg)、6(2.7 mg)；Fr.C-4(120 mg)經(jīng)硅膠柱層析，石油醚-丙酮(150∶1～20∶1)梯度洗脫，得化合物7(2.8 mg)。

2.2 踝節(jié)菌屬真菌 將菌種接種至PDA培養(yǎng)基后，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，作為種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)完成后接種到121 ℃高壓滅菌30 min的燕麥片培養(yǎng)基中(500 mL錐形瓶中加入80 g燕麥片、100 mL蒸餾水)，在28 ℃下培養(yǎng)45 d，其間定期噴灑醫(yī)用酒精進行殺菌，發(fā)酵完成后取出燕麥片培養(yǎng)基，風干后研磨成粉，乙酸乙酯浸泡提取，得粗浸膏21 g，經(jīng)大孔吸附樹脂柱層析，乙醇-水(1∶9～9∶1)梯度洗脫，得Fr.FTy-A～Fr.JTy-E。

Fr.GTy-B(1.2 g)經(jīng)硅膠柱層析，氯仿-甲醇(150∶1～20∶1)梯度洗脫，得Fr.G-1～Fr.G-3，F(xiàn)r.G-1(111 mg)經(jīng)半制備HPLC，58%甲醇洗脫，得化合物11(3.5 mg，tR=31 min)；Fr.G-2(173 mg)經(jīng)硅膠柱層析，石油醚-丙酮(200∶1～20∶1)梯度洗脫，得化合物9(3.1 mg)；Fr.G-3(163 mg)經(jīng)半制備HPLC，43%甲醇洗脫，得化合物10(3.5 mg，tR=27 min)。Fr.H(2.3 g)經(jīng)MCI柱層析，甲醇-水(2∶8～1∶0)梯度洗脫，得Fr.H-1～Fr.H-5，F(xiàn)r.H-3(232 mg)經(jīng)半制備HPLC，65%甲醇洗脫，得化合物8(2.2 mg，tR=33 min)。

3 結構鑒定

化合物1：針狀結晶，ESI-MSm/z：170.1[M+H]+。1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ：6.96(2H，Sh-2/6)，9.18(3H，brs，3，4，5-OH)；13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δ：120.2(C-1)，109.1(C-2)，144.7(C-3)，138.4(C-4)，109.1(C-6)，166.5(C-7)，以上數(shù)據(jù)與文獻[3]基本一致，故鑒定為沒食子酸。

化合物2：白色粉末，ESI-MSm/z：340.6[M+H]+。1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ：2.52(2H，t，J=5.4 Hz，H-2)，2.34(2H，m，H-3)，1.20(3H，t，J=6.9 Hz，H-22)；13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δ：129.9(C-1)，35.9～22.7(多個CH2信號)，14.1(C-22)，以上數(shù)據(jù)與文獻[4]基本一致，故鑒定為behenic acid。

化合物3：白色晶體，ESI-MSm/z：122.1[M+H]+。1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ：9.76(1H，s)，7.79(2H，d，J=8.0 Hz)，6.92(2H，d，J=8.0 Hz)；13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δ：129.2(C-1)，132.1(C-2)，116.7(C-3)，164.1(C-4)，116.7(C-5)，132.1(C-6)，192.5(-CHO)，以上數(shù)據(jù)與文獻[5]基本一致，故鑒定為對羥基苯甲醛。

化合物4：白色無定型粉末，ESI-MSm/z：189.2[M+H]+。1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ：8.75(1H，s)，8.32(1H，d，J=8.2 Hz)，7.28(2H，t，J=8.2 Hz)，7.50(1H，d，J=8.2 Hz)；13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δ：138.1(C-2)，111.7(C-3)，126.5(C-3a)，121.5(C-4)，122.9(C-5)，123.9(C-6)，112.5(C-7)，136.5(C-7a)，181.7(C-8)，166.7(C-9)，以上數(shù)據(jù)與文獻[6-7]基本一致，故鑒定為(1H-indol-3-yl)oxoacetamide。

化合物5：白色粉末，ESI-MSm/z：411.5[M+H]+。1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ：5.87(1H，d，J=9.5 Hz)，4.43(1H，dd，J=6.8，6.9 Hz)，2.49(1H，m)，1.99(1H，m)，1.66(3H，s)；13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δ：130.0(C-2)，50.2(C-3)，166.2(C-5)，58.7(C-6)，29.2(C-7)，22.6(C-8)，45.3(C-9)，171.0(C-11)，83.0(C-12)，68.7(C-13)，105.5(C-14)，120.8(C-15)，121.3(C-16)，109.9(C-17)，156.8(C-18)，95.1(C-19)，137.6(C-20)，124.0(C-21)，134.6(C-22)，25.7(C-23)，18.3(C-24)，55.8(-OCH3)，以上數(shù)據(jù)與文獻[8]基本一致，故鑒定為12，13-dihydroxy fumitremorgin C。

化合物6：無定型淺黃色粉末，ESI-MSm/z：358.4[M+H]+。1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ：6.21(1H，s，-NH)，7.54(1H，d，J=7.9 Hz，H-7)，7.67(1H，t，J=7.9 Hz，H-8)，7.43(1H，t，J=8.0 Hz，H-9)，8.26(1H，d，J=8.0 Hz，H-10)，5.58(1H，dd，J=5.5，3.2 Hz，H-14)，3.55(1H，dd，J=15.0，5.5 Hz，H-15)，3.61(1H，dd，J=15.0，3.2 Hz，H-15)，1.35(3H，s，H-16)，6.71(1H，Hs，H-18)，8.15(1H，brs，H-19)，7.31(1H，brd，J=8.0 Hz，H-21)，7.13(1H，t，J=8.0 Hz，H-22)，6.91(1H，t，J=8.0 Hz，H-23)，7.39(1H，d，J=8.0 Hz，H-24)；13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δ：169.2(C-1)，47.1(C-3)，150.6(C-4)，161.7(C-12)，55.5(C-14)，27.1(C-15)，19.0(C-16)，108.4(C-17)，122.5(C-18)，134.9(C-20)，110.1(C-21)，120.1(C-23)，以上數(shù)據(jù)與文獻[9]基本一致，故鑒定為fumiquinazoline F。

化合物7：ESI-MSm/z：154.1[M+H]+。1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ：3.55(3H，s，H-8)，6.47(1H，d，J=9.4 Hz，H-4)，8.38(1H，s，H-2)，7.92(1H，d，J=9.4 Hz，H-5)；13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δ：145.7(C-2)，112.7(C-3)，141.7(C-4)，119.3(C-5)，176.2(C-6)，176.3(C-7)，38.6(C-8)，以上數(shù)據(jù)與文獻[7]基本一致，故鑒定為1，6-dihydro-1-methyl-6-oxo-3-pyridinecarboxylic acid。

化合物8：淡黃色固體，ESI-MSm/z：564.6[M+H]+。1H-NMR(CDCl3，600 MHz)δ：9.53(1H，s，9′-OH)，9.47(1H，s，9-OH)，6.45(2H，d，J=1.8 Hz，H-7,7′)，6.11(1H，d，J=1.8 Hz，H-5′)，5.98(1H，d，J=1.8 Hz，H-5)，5.16(1H，d，J=15.7 Hz，C-1)，4.72(1H，d，J=15.7 Hz，C-1)，4.75(1H，d，J=15.7 Hz，C-1′)，4.63(1H，d，J=15.7 Hz，C-1′)，4.02(3H，s，8-OCH3)，4.00(3H，s，8′-OCH3)，3.80(1H，s，H-4)，3.77(1H，s，H-4′)，3.46(3H，s，6-OCH3)，1.23(3H，d，J=6.5 Hz，H-11)，1.21(3H，d，J=6.5 Hz，H-11′)；13C-NMR(CDCl3，150 MHz)δ：157.7(C-6)，154.5(C-6′)，157.6(C-8)，157.4(C-8′)，136.1(C-10a)，136.1(C-10a′)，123.9(C-10)，123.1(C-10′)，110.3(C-8a)，109.8(C-8a′)，73.8(C-3)，74.0(C-3′)，66.5(C-4)，65.0(C-1)，64.5(C-1′)，56.3(-OCH3)，56.2(-OCH3)，55.2(-OCH3)，16.9(C-11)，16.8(C-11′)，以上數(shù)據(jù)與文獻[10]基本一致，故鑒定為6′-O-desmethylES-242-4。

化合物9：無色針晶，ESI-MSm/z：428.7[M+H]+。1H-NMR(CDCl3，600 MHz)δ：3.94(1H，m，H-3)，6.50(1H，d，J=8.5 Hz，H-7)，0.88(3H，s，H-18)，1.09(3H，s，H-19)，1.0(3H，d，J=6.5 Hz，H-21)，5.11(1H，dd，J=6.6，15.2 Hz，H-22)，5.19(1H，dd，J=7.6，15.1 Hz，H-23)，0.83(3H，d，J=5.0 Hz，H-26)，0.82(3H，d，J=5.0 Hz，H-27)，0.89(3H，m，H-28)；13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δ：34.7(C-1)，30.1(C-2)，66.4(C-3)，36.9(C-4)，82.1(C-5)，135.4(C-6)，130.7(C-7)，79.4(C-8)，51.1(C-9)，36.9(C-10)，23.4(C-11)，39.3(C-12)，44.5(C-13)，51.7(C-14)，20.6(C-15)，28.6(C-16)，56.2(C-17)，12.9(C-18)，18.1(C-19)，39.7(C-20)，20.9(C-21)，135.2(C-22)，132.3(C-23)，42.8(C-24)，33.0(C-25)，19.6(C-26)，19.9(C-27)，17.5(C-28)，以上數(shù)據(jù)與文獻[11]基本一致，故鑒定為麥角甾醇過氧化物。

化合物10：ESI-MSm/z：484.5[M+H]+。1H-NMR(CDCl3，600 MHz)δ：7.16(1H，d，J=10.3 Hz，H-1)，6.00(1H，d，J=10.3 Hz，H-2)，2.18(1H，dd，J=14.0，4.6 Hz，H-5)，1.85，2.2(2H，dd，J=14.0，2.4 Hz，H-6)，4.18(1H，dd，J=8.2，2.0 Hz，H-7)，2.27(2H，dd，J=14.0，5.0 Hz，H-9)，2.62(2H，dd，J=15.0，5.0 Hz，H-11)，1.27(1H，s，H-12)，1.1(3H，s，H-13)，1.12(3H，s，H-14)，1.36(3H，s，H-15)，6.50(1H，s，H-5′)，6.17(1H，d，J=1.7 Hz，H-7′)，1.49(3H，d，J=6.6 Hz，H-9′)；13C-NMR(CDCl3，150 MHz)δ：156.2(C-1)，127.5(C-2)，203.7(C-3)，44.6(C-4)，42.4(C-5)，26.5(C-6)，71.8(C-7)，79.7(C-8)，41.8(C-9)，38.4(C-10)，21.5(C-11)，21.5(C-12)，21.4(C-13)，27.7(C-14)，27.4(C-15)，102.2(C-1′)，135.8(C-2′)，112.3(C-3′)，162.2(C-4′)，106.3(C-5′)，159.6(C-6′)，64.1(C-7′)，76.0(C-8′)，16.4(C-9′)，168.8(C-10′)，以上數(shù)據(jù)與文獻[12]基本一致，故鑒定為thailandolides B。

化合物11：ESI-MSm/z：372.4[M+H]+。1H-NMR(CDCl3，600 MHz)δ：0.96(3H，d，J=14.5 Hz，5′-CH3)，0.99(3H，d，J=6.1 Hz，4′-CH3)，1.67(1H，dd，J=14.5，8.9 Hz，2′-CH2)，1.79(1H，m，3′-CH)，2.24(3H，s，H-9′)，3.98(3H，s，4-OCH3)，5.07(3H，m，H-1′)，6.37(1H，d，J=1.8 Hz，H-8)，6.85(1H，d，J=1.8 Hz，H-10)，6.87(1H，d，J=8.5 Hz，H-1)，7.56(1H，d，J=8.5 Hz，H-2)；13C-NMR(CDCl3，150 MHz)δ：117.7(C-1)，131.0(C-2)，136.8(C-3)，154.3(C-4)，119.4(C-5)，167.9(C-6)，69.1(C-7)，125.7(C-7a)，120.6(C-8)，134.9(C-9)，117.7(C-10)，147.5(C-11)，141.3(C-11a)，151.3(C-12a)，66.6(C-1′)，47.6(C-2′)，24.9(C-3′)，21.8(C-4′)，23.3(C-5′)，62.6(4-OCH3)，20.8(9-CH3)，以上數(shù)據(jù)與文獻[13]基本一致，故鑒定為penicillide。

4 討論

藥用真菌是天然藥物發(fā)現(xiàn)的重要微生物資源寶庫，我國真菌資源種類豐富，但多種資源尚待發(fā)現(xiàn)，且大多數(shù)真菌主要來源于自然野生資源，其可持續(xù)利用面臨挑戰(zhàn)。本研究從膠孢炭疽菌C.gloeosporioides綠豆培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物中得到7個單體化合物，其中，化合物4～7為首次從該真菌中分離得到。從踝節(jié)菌屬真菌T.aurantiacus的燕麥片培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物得到4個單體化合物，其中化合物10～11均為首次從該菌中發(fā)現(xiàn)。此次分離得到的化合物與同一菌種代謝產(chǎn)物有所不同，可能是由于菌種來源以及培養(yǎng)條件不同對基因表達產(chǎn)生影響，導致其代謝產(chǎn)物的差異，而且植物內(nèi)生菌自身種類的多樣性和代謝途徑的多樣性也決定了其次級代謝產(chǎn)物的豐富多樣，今后可以通過改變培養(yǎng)基以及表觀遺傳修飾等手段進行優(yōu)化。在下一步研究中，本課題組將對本研究分離得到的化合物進行活性篩選。目前，國內(nèi)外對藥用真菌次級代謝產(chǎn)物的研究相對較少，本研究不僅豐富了藥用真菌化學成分的多樣性，也為從藥用真菌中發(fā)現(xiàn)更多具有生物活性的新穎結構化合物提供了科學依據(jù)。