補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對(duì)A375 細(xì)胞黑素合成及ER/MAPK 信號(hào)通路的影響

劉國(guó)良 于英君 姚 遠(yuǎn) 姜 穎 張 寧 張明磊 高海娜 李建民

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150040

黃褐斑俗稱(chēng)蝴蝶斑，是黑素細(xì)胞（melanocytes，MC）合成黑素量過(guò)多蓄積于皮膚而形成的，研究發(fā)現(xiàn)機(jī)體內(nèi)雌激素水平與黃褐斑的發(fā)病關(guān)系密切，雌激素與雌激素受體結(jié)合可影響黑素細(xì)胞增殖、黑素合成關(guān)鍵酶酪氨酸酶（TYR）的活性及數(shù)量，從而影響黑素合成，是導(dǎo)致色素沉著的主要因素[1-4]。在天然植物中發(fā)現(xiàn)許多有弱雌激素樣作用化合物， 可與雌激素受體（ER）相結(jié)合發(fā)揮雌激素樣作用， 用于治療激素相關(guān)疾病。植物雌激素又被稱(chēng)為選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑，其雌激素活性較雌二醇低，表現(xiàn)出具有類(lèi)雌激素或抗雌激素效應(yīng)，故而在體內(nèi)具有較溫和的雙向調(diào)節(jié)作用[5-7]。植物雌激素與ER 結(jié)合后，刺激性激素結(jié)合球蛋白的產(chǎn)生，并抑制TYR 和雌激素合成酶的活性，從而減輕雌激素促細(xì)胞增殖的作用，而植物雌激素在黑素合成過(guò)程中發(fā)揮怎樣的作用，以及其是如何通過(guò)ER 信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)控的還不得而知。本研究選用補(bǔ)骨脂中的植物雌激素成分補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚作用于人黑素瘤細(xì)胞（A375 細(xì)胞），研究其對(duì)ER、MAPK 信號(hào)通路蛋白激酶表達(dá)的影響，闡明植物雌激素成分干預(yù)黑素合成的作用機(jī)制，為合理利用中藥植物雌激素防治黃褐斑等皮膚色素沉著類(lèi)疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚（南京澤朗科技有限公司，批號(hào)：20130821）；HRP 標(biāo)記羊抗小鼠IgG（武漢博士德生物工程有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：BST08k13B）；小鼠抗人JNK 單克隆抗體（生產(chǎn)批號(hào)：#G0913）；ER 阻斷劑（ICI182780）（TOCRIS 公司，批號(hào)：20A/129473）；JNK 抑制劑（SP600125）（美國(guó)Selleck 公司，批號(hào)：S110202）。

1.2 細(xì)胞分組

將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的A375 細(xì)胞，以105每孔接種到6 孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)。 實(shí)驗(yàn)分為空白組（加入2 mL DMEM 完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)72 h）、雌二醇組（A375 細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，加入雌二醇濃度為10-3μmol/L 的2 mL DMEM 完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h）、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組（A375 細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，加入不同濃度的補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚2 mL 的DMEM 完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h）、ICI182780+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組（先加2 mL 的ICI182780培養(yǎng)2 h 后， 再加1 mL 補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚，繼續(xù)培養(yǎng)48 h）、SP600125+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組 （先加2 mL 的SP600125 培養(yǎng)2 h 后，再加1 mL 補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚，繼續(xù)培養(yǎng)48 h）。

1.3 MTT 檢測(cè)

細(xì)胞培養(yǎng)72 h 至結(jié)束前4 h，每孔加入20 μL 濃度為5 g/L 的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，除去上清液，每孔加入150 μL DMSO，將96 孔板置于37℃恒溫震蕩培養(yǎng)器內(nèi)震蕩10 min，使紫色結(jié)晶完全溶解。 酶標(biāo)儀490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.4 黑素含量

將對(duì)數(shù)期A375 細(xì)胞以細(xì)胞濃度105個(gè)/孔接種于6 孔板，各組細(xì)胞均設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，按分組給藥。酶標(biāo)儀490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.5 TYR 活性

將對(duì)數(shù)期A375 細(xì)胞以細(xì)胞濃度5000 個(gè)/孔接種于96 孔板，每孔200 μL DMEM 完全培養(yǎng)液，各組細(xì)胞均設(shè)5 個(gè)復(fù)孔。酶標(biāo)儀490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.6 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

1.6.1 總RNA 提取 細(xì)胞總RNA 的提取按照試劑盒說(shuō)明操作。 引物設(shè)計(jì)：引物的設(shè)計(jì)與合成由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供， 以β-actin 為內(nèi)參照，引物序列見(jiàn)表1。1.6.2 PCR 擴(kuò)增 在冰水浴上的PCR 管中依次加入16.1 μL ddH2O、1.5 μL cDNA、2.5 μL 10×PCR Buffer、2.5 μL dNTP、1.3 μL MgCl2，最后加入0.1 μL Taq 酶，上游引物和下游引物各0.5 μL， 使PCR 管內(nèi)終體積達(dá)到25 μL。將PCR 管放入PCR 擴(kuò)增儀上，PCR 擴(kuò)增程序見(jiàn)表2。

表1 引物序列

1.7 Western blot 實(shí)驗(yàn)

蛋白樣品制備： 當(dāng)細(xì)胞呈80%以上融合時(shí)，WIP組織細(xì)胞裂解液裂解提取總蛋白。 SDS-PAGE 電泳：按照BIO-RAD 公司說(shuō)明書(shū)安裝SDS 聚丙烯酰胺凝膠玻璃板，分別灌制分離膠和濃縮膠。加樣：各40 μL 蛋白樣品。電泳：起始電壓為100 V，電泳10～20 min 后，藍(lán)色染料進(jìn)入分離膠，則電壓升高到120 V，電泳至指示染料到距分離膠底部緣時(shí)1.0～0.5 cm 處時(shí)，停止電泳。 轉(zhuǎn)膜：濕轉(zhuǎn)，150 V 轉(zhuǎn)移130 min。 封閉：將轉(zhuǎn)膜后的PVDF 膜浸入盛有封閉液密閉小盒中，室溫封閉1 h。 一抗孵育稀釋比例均為1∶300，4℃過(guò)夜。 二抗孵育：二抗（二抗稀釋比例為1∶3500），室溫1 h。 顯影：ECL 顯影液顯影。

表2 擴(kuò)增程序

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），用Tamhane 法進(jìn)行方差齊檢驗(yàn)，LSD 法和SNK 法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩比較，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對(duì)A375 細(xì)胞活性的影響

與空白組比較，10-3μmol/L 的雌二醇組對(duì)細(xì)胞活性的作用無(wú)顯著性差異（P ＞0.05）；10、100 μmol/L 補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組對(duì)細(xì)胞的活性有顯著的抑制作用（P ＜0.01），1、10-1、10-2、10-3μmol/L 的補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組對(duì)A375 細(xì)胞活性均無(wú)顯著作用（P ＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3 補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對(duì)A375 細(xì)胞活性的影響（±s，n = 6）

表3 補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對(duì)A375 細(xì)胞活性的影響（±s，n = 6）

注：與空白組比較，**P ＜0.01；“-”表示無(wú)數(shù)據(jù)

組別 濃度（μmol/L） 吸光度空白組雌二醇組補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組-10-3 10-3 10-2 10-1 1 10 100 0.368±0.021 0.366±0.023 0.368±0.026 0.365±0.025 0.363±0.024 0.356±0.024 0.314±0.020**0.108±0.028**

2.2 ICI182780/SP600125 +補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對(duì)A375 細(xì)胞黑素合成的影響

與空白組比較，雌二醇組對(duì)黑素合成有顯著的促進(jìn)作用，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）；補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組、ICI182780+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組和SP600125+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組對(duì)黑素合成有顯著的抑制作用，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。與補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組比較，ICI182780+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組和SP600125+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組對(duì)黑素合成有上調(diào)作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 ICI182780/SP600125+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對(duì)A375 細(xì)胞黑素合成的影響（±s，n = 5）

表4 ICI182780/SP600125+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對(duì)A375 細(xì)胞黑素合成的影響（±s，n = 5）

注：與空白組比較，**P ＜0.01；與補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組比較，#P ＜0.05；“-”表示無(wú)數(shù)據(jù)

組別 濃度（mol/L） 吸光度空白組雌二醇組補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組ICI182780 +補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組SP600125 +補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組-10-3 10-6 10-6 10-6 0.079±0.004 0.108±0.014**0.039±0.002**0.051±0.001**#0.048±0.006**#

2.3 ICI182780/SP600125+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對(duì)A375 細(xì)胞TYR 活性的影響

與空白組比較，雌二醇組能顯著提高TYR 活性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組、ICI182780+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組、SP600125+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組對(duì)TYR 活性有顯著的抑制作用（P ＜0.01）。 與 補(bǔ) 骨 脂 二 氫 黃 酮 甲 醚 組 比 較，ICI182780+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組、SP600125+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組均能顯著提高TYR 活性， 差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。 見(jiàn)表5。

表5 ICI182780/SP600125+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對(duì)A375 細(xì)胞TYR 活性的影響（±s，n = 5）

表5 ICI182780/SP600125+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對(duì)A375 細(xì)胞TYR 活性的影響（±s，n = 5）

注：與空白組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組比較，##P ＜0.01；“-”表示無(wú)數(shù)據(jù)；TYR：酪氨酸酶

組別 濃度（mol/L） 吸光度空白組雌二醇組補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組ICI182780+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組SP600125+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組-10-3 10-6 10-6 10-6 0.078±0.003 0.112±0.014*0.041±0.002**0.059±0.004**##0.056±0.004**##

2.4 ICI182780+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對(duì)A375 細(xì)胞mRNA 的影響

與空白組比較， 雌二醇組各指標(biāo)mRNA 表達(dá)增強(qiáng)，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）；補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組下調(diào)TYR、TRP-1/2、ERK1/2、JNK2 mRNA 表達(dá)，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。 與補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組比較，ICI182780+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組減弱了補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚下調(diào)mRNA 表達(dá)的作用，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見(jiàn)表6。

2.5 SP600125+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對(duì)A375 細(xì)胞mRNA 表達(dá)的影響

與空白組比較，雌二醇組各指標(biāo)mRNA 表達(dá)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）；補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組能明顯降低TYR、TRP-1/2、ERK1/2、JNK2 mRNA 的表達(dá)， 差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜0.01）； 與補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組比較，SP600125+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組下調(diào)TYR、TRP-1、TRP-2 mRNA 表達(dá)的作用均被減弱，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。 見(jiàn)表7。

表6 ICI182780+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對(duì)A375 細(xì)胞mRNA 的影響（±s，n = 4）

表6 ICI182780+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對(duì)A375 細(xì)胞mRNA 的影響（±s，n = 4）

注：與空白組比較，**P ＜0.01；與補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01；“-”表示無(wú)數(shù)據(jù)

組別 濃度（mol/L） TYR/β-actin TRP-1/β-actin TRP-2/β-actin ERK1/β-actin ERK2/β-actin JNK2/β-actin空白組雌二醇組補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組ICI182780+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組-10-3 10-6 10-6 0.490±0.026 0.546±0.022**0.254±0.023**0.282±0.002##0.405±0.018 0.485±0.017**0.069±0.005**0.187±0.018##0.453±0.027 0.544±0.023**0.207±0.028**0.374±0.002##0.496±0.017 0.674±0.021**0.312±0.029**0.534±0.024##0.564±0.033 0.770±0.022**0.344±0.028**0.397±0.018#0.444±0.013 0.565±0.025**0.228±0.023**0.034±0.019##

表7 SP600125+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對(duì)A375 細(xì)胞mRNA 表達(dá)的影響（±s，n = 4）

表7 SP600125+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對(duì)A375 細(xì)胞mRNA 表達(dá)的影響（±s，n = 4）

注：與空白組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01；“-”表示無(wú)數(shù)據(jù)

組別 濃度（mol/L） TYR/β-actin TRP-1/β-actin TRP-2/β-actin ERK1/β-actin ERK2/β-actin JNK2/β-actin空白組雌二醇組補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組SP600125+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組-10-3 10-6 10-6 0.436±0.016 0.529±0.021**0.189±0.020**0.224±0.023#0.477±0.018 0.502±0.022*0.234±0.028**0.289±0.018#0.455±0.018 0.563±0.022**0.337±0.018**0.404±0.028#0.584±0.022 0.663±0.026**0.454±0.028**0.497±0.017#0.414±0.018 0.495±0.023**0.288±0.019**0.366±0.018##0.468±0.022 0.782±0.012**0.255±0.032**0.356±0.015##

2.6 ICI182780+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、 補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對(duì)TYR、JNK 蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較， 雌二醇組能顯著增強(qiáng)TYR、JNK蛋白的表達(dá) （P ＜0.01）； 補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組、ICI182780+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組極顯著下調(diào)TYR、JNK 蛋白表達(dá)（P ＜0.01）。 與補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組比較，ICI182780+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組減弱了補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚下調(diào)TYR、JNK 蛋白表達(dá)的作用（P ＜0.01）。 見(jiàn)表8、圖1。

2.7 SP600125+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對(duì)TYR、JNK 蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，雌二醇組TYR、JNK 蛋白表達(dá)增強(qiáng)（P ＜0.01）；補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組、SP600125+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組極顯著下調(diào)TYR、JNK 蛋白表達(dá)（P ＜0.01）。 與補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組比較，SP600125+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組減弱補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚下調(diào)TYR、JNK2 蛋白表達(dá)作用（P ＜0.01）。 見(jiàn)表9、圖2。

3 討論

在人皮膚黑素合成過(guò)程中不僅受TYR 及其相關(guān)蛋白調(diào)控，還受ER 信號(hào)通路以及細(xì)胞應(yīng)激和損傷反應(yīng)的主要信號(hào)通路ER-MAPKs 的調(diào)控[8-10]。 在黃褐斑患者的皮膚中發(fā)現(xiàn)，ER 的表達(dá)與色斑的嚴(yán)重程度有著密切的關(guān)系[11-13]。

表8 ICI182780+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對(duì)TYR、JNK 蛋白表達(dá)的影響（±s，n = 4）

表8 ICI182780+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對(duì)TYR、JNK 蛋白表達(dá)的影響（±s，n = 4）

注：與空白組比較，**P ＜0.01；與補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組比較，##P ＜0.01；“-”表示無(wú)數(shù)據(jù)；TYR：酪氨酸酶

組別 濃度（mol/L） TYR/β-actin JNK/β-actin空白組雌二醇組補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組ICI182780+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組-10-3 10-6 10-6 0.105±0.002 0.140±0.002**0.064±0.004**0.091±0.003**##0.099±0.002 0.129±0.011**0.061±0.019**0.075±0.002**##

圖1 ICI182780+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對(duì)TYR、JNK 蛋白表達(dá)的影響

ER 是存在于靶器官細(xì)胞內(nèi)的一種蛋白質(zhì)分子，可與雌激素發(fā)生特異性結(jié)合而形成雌激素-受體復(fù)合物，使雌激素發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路在炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、腫瘤細(xì)胞增殖以及參與調(diào)控體內(nèi)多種物質(zhì)代謝過(guò)程中起重要作用。目前已確定在真核細(xì)胞中有4 條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路：ERK 通 路、JNK 通 路、p38 通 路 和ERK5 通 路。ERK、JNK、P38MAPK 均由相鄰的蘇氨酸 （THR）和TYR 殘基雙磷酸化而激活，介導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化及死亡全過(guò)程。激活細(xì)胞增殖及分化的信號(hào)調(diào)控因子ERK，可引起MITF 磷酸化降解，TYR 活性降低，導(dǎo)致黑素合成減少。JNK 通路可以通過(guò)降低cAMP 應(yīng)答原件結(jié)合蛋白 （CREB） 的磷酸化水平， 抑制MITF 和TYR 的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)抑制黑素生成的作用。p38MAPK 信號(hào)通路參與了黑素的合成過(guò)程，它通過(guò)上調(diào)酪氨酸酶基因的表達(dá)來(lái)發(fā)揮促進(jìn)黑素合成的作用[14-16]。 骨脂素可增加T47D 細(xì)胞雌激素效應(yīng)基因PR mRNA 的表達(dá)，且促增殖和誘導(dǎo)PR 表達(dá)增強(qiáng)的效應(yīng)均可被雌激素受體拮抗劑ICI182780 所拮抗[17-20]。

表9 SP600125+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對(duì)TYR、JNK 蛋白表達(dá)的影響（±s，n = 4）

表9 SP600125+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對(duì)TYR、JNK 蛋白表達(dá)的影響（±s，n = 4）

注：與空白組比較，**P ＜0.01；與補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚組比較，##P ＜0.01；“-”表示無(wú)數(shù)據(jù)

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圖2 SP600125+補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對(duì)TYR、JNK 蛋白表達(dá)的影響

本研究結(jié)果顯示，補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚均能顯著抑制黑素合成和TYR 活性，而這種抑制作用可被經(jīng)典ER 受體阻斷劑及JNK 受體阻斷劑所逆轉(zhuǎn)。 補(bǔ)骨脂二氫 黃 酮 甲 醚 能 顯 著 下 調(diào)TYR、TRP-1、TRP-2 及ERK1/2、JNK2 mRNA 的表達(dá)；TYR、JNK 的蛋白表達(dá)也明顯下降；基因表達(dá)和蛋白表達(dá)的下調(diào)同樣被經(jīng)典ER 受體阻斷劑和JNK 受體阻斷劑所削弱。

綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可推測(cè)植物雌激素補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚下調(diào)黑素合成的機(jī)制，可能是植物雌激素與雌激素膜受體結(jié)合啟動(dòng)第二信使系統(tǒng)， 激活了ERMAPK 關(guān)鍵蛋白激酶ERK、JNK 信號(hào)通路而發(fā)揮了間接的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，使TYR 活性、TYR 及相關(guān)蛋白酶表達(dá)降低來(lái)達(dá)到抑制黑素合成的作用。 因此，本實(shí)驗(yàn)表明植物雌激素補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚具有抑制黑素合成的作用，為黃褐斑的治療提供了一種新的藥物開(kāi)發(fā)可能性， 而其治療黃褐斑的藥物機(jī)制可能是通過(guò)ER-MAPK 信號(hào)通路起作用，也為植物雌激素藥物的開(kāi)發(fā)奠定了一定的基礎(chǔ)。

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