火神山醫(yī)院新冠肺炎預(yù)防經(jīng)典方中12 種主成分的含量測(cè)定

宋新華，梁鳳英，許封菁，劉艷平，王志鵬，陳萬生

新型冠狀病毒肺炎（新冠肺炎，COVID-19）是一種急性感染性肺炎，其病原體是一種先前未在人類中發(fā)現(xiàn)的新型冠狀病毒，簡稱“新冠肺炎”?；颊咭园l(fā)熱、干咳、乏力為主要表現(xiàn)的急性傳染病，人群普遍易傳染［1］。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“正氣存內(nèi)，邪不可干”，在常規(guī)預(yù)防的同時(shí)，早期進(jìn)行中醫(yī)藥干預(yù)可避免疫癘之邪的侵入和傳變，從而達(dá)到“未病先防，既病防變”的作用。疫情期間全國多個(gè)城市紛紛采用中藥對(duì)患者進(jìn)行治療，并且效果顯著［2］。在火神山醫(yī)院病區(qū)中醫(yī)中藥治療率達(dá)100%，純中醫(yī)治療率達(dá)75%［3］。中醫(yī)治療采用辛溫解表之法溫散、透寒邪，通過芳香避穢化濁治療濕邪，同時(shí)調(diào)理脾胃來針對(duì)寒濕疫。根據(jù)患者的體質(zhì)、病情、當(dāng)?shù)貧夂蛱攸c(diǎn)等，辨證施治［4］。新冠肺炎預(yù)防經(jīng)典方為武漢火神山醫(yī)院依據(jù)國家衛(wèi)健委印發(fā)的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》所引進(jìn)的4 種肺炎診療中藥湯劑處方之一，用于新型冠狀病毒預(yù)防治療。使用液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）技術(shù)進(jìn)行分析，因其具有分離效果好、靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)［5］。

火神山醫(yī)院新冠肺炎預(yù)防經(jīng)典方由黃芪、麩炒白術(shù)、防風(fēng)、貫眾、金銀花、陳皮、佩蘭等7 味藥材的主成分為指標(biāo)，對(duì)其中12 種主成分（黃芪甲苷、升麻苷、木犀草苷、金絲桃苷、毛蕊異黃酮苷、亥茅酚苷、刺芒柄花苷、川陳皮素、桔皮素、升麻素、毛蕊異黃酮、白術(shù)內(nèi)酯-Ⅲ）進(jìn)行含量測(cè)定，建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UHPLC-MS/MS）法進(jìn)行含量測(cè)定，為火神山醫(yī)院新冠肺炎預(yù)防經(jīng)典方的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

安捷倫1200 系列高效液相色譜儀（HPLC）由美國安捷倫科技公司制造（Agilent Technologies，美國），由G1311A 型四元泵、G1322A 型真空脫氣機(jī)、G1329A 型自動(dòng)進(jìn)樣器和G1316A 型柱溫箱等組成。安捷倫6410A三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀由美國安捷倫科技公司制造（Agilent Technologies，美國），離子源為ESI 型，數(shù)據(jù)采集及處理系統(tǒng)采用MassHunter 軟件。定時(shí)可調(diào)速旋渦混合器（美國labnet 公司），Eppendorf 5418R 型臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)（德國Eppendorf 公司），百萬分之一電子天平，MES3.6P-0CE0DM 型（賽多利斯，哥廷根，德國，最大稱重3.1 g，分辨率0.001 mg）；單通道移液槍，Reaserch plus 型，量程10、20、100、200、1 000 μl（艾本德，漢堡，德國）。超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司，SK7200H 型）。旋渦混勻器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，Vortex QL-901 型），煎藥壺（蘇泊爾液體加熱器，SW-30Y06），灌裝針頭式濾器（上海泰坦科技股份有限公司，聚醚砜PES，0.22 μm，13 mm）。

新冠肺炎預(yù)防經(jīng)典方3 批（黃芪15 g、麩炒白術(shù)9 g、防風(fēng)9 g、貫眾6 g、金銀花9 g、陳皮6 g、佩蘭9 g，上海長征醫(yī)院中藥房提供）。黃芪甲苷（Astragaloside Ⅳ，批號(hào)：J25F10T81373）、毛蕊異黃酮苷（Calycosin7-O-glucoside，批號(hào)：Y13F11H108672）、毛蕊異黃酮（Calycosin，批號(hào)：Y24N9Y75652）、刺芒柄花苷（Ononin，批號(hào)：P03A10F84910）、白術(shù)內(nèi)酯-Ⅲ（Atractylenolide Ⅲ，批號(hào)：M13D10S105676）、升麻苷（Prim-O-glucosylcimifugin，批號(hào)：Y31M9H62747）、亥茅酚苷（Sec-O-glucosylhamaudol，批號(hào)：Y02A7H1887 4）、升麻素（Cimifugin，批號(hào)：Y11O9H72162）、桔皮素（Tangeretin，批 號(hào)：H24F11K108893），川 陳 皮 素（Nobiletin，批號(hào)：N10J10R90249）、木犀草苷（Cynaroside，批號(hào)：Y13J10H93050），金絲桃苷（Hyperoside，批號(hào)：Y08N9X74602）、利血平（Reserpine，批號(hào)：Y02M11Y17235）對(duì)照品，均由上海源葉有限公司提供。質(zhì)譜純甲醇（Merck 公司，德國），質(zhì)譜純乙腈（Merck 公司，德國），色譜純甲酸（天地公司，美國），蒸餾水（屈臣氏，中國）。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB-C18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm，Agilent，USA）。流動(dòng)相：A 相0.1%甲酸乙腈溶液：B 相0.1%甲酸和10 mmol/L 醋酸銨水溶液。流速：0.3 ml/min。進(jìn)樣量：5 μl，柱溫：40°C。運(yùn)行時(shí)間：7.2 min。梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件

1.2.2 質(zhì)譜檢測(cè)條件 選用電噴霧（ESI）離子源，監(jiān)測(cè)模式選擇正離子模式分析，質(zhì)譜噴霧針電壓（Capillary）設(shè)置為4 000 V，離子源溫度設(shè)置為350 ℃。霧化氣及干燥氣選用氮?dú)猓∟2），碰撞池所用氣體為高純氮?dú)猓∟2），設(shè)置壓力為0.1 MPa；其他質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化結(jié)果如下：霧化氣壓力設(shè)置為40 psi；MS1和MS2的加熱溫度均為105 ℃；氣體流速設(shè)置為10 ml/min，掃描方式為多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）。將一定濃度的對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液進(jìn)樣，ESI 電離方式下，進(jìn)行產(chǎn)物離子全掃描分析，隨后對(duì)單個(gè)分析物的F值和CE 值進(jìn)行優(yōu)化，選擇最優(yōu)的F值和CE 值后，確定其子離子。用于定量分析的參數(shù)見表2。

表2 新冠肺炎預(yù)防經(jīng)典方12 種主成分及內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜條件

分別對(duì)黃芪甲苷、升麻苷、金絲桃苷、木犀草苷、毛蕊異黃酮苷、亥茅酚苷、刺芒柄花苷、川陳皮素、桔皮素、升麻素、毛蕊異黃酮、白術(shù)內(nèi)酯-Ⅲ和內(nèi)標(biāo)利血平母離子進(jìn)行產(chǎn)物離子全掃描分析，并將以上碎片離子作為定量分析時(shí)監(jiān)測(cè)的產(chǎn)物離子。見圖1。

圖1 新冠肺炎預(yù)防經(jīng)典方中12 個(gè)主成分及內(nèi)標(biāo)的二級(jí)產(chǎn)物離子圖

1.2.3 對(duì)照品溶液的制備 依次精密稱取黃芪甲苷、升麻苷、毛蕊異黃酮苷、亥茅酚苷、刺芒柄花苷、川陳皮素、桔皮素、升麻素、毛蕊異黃酮、白術(shù)內(nèi)酯-Ⅲ、利血平（內(nèi)標(biāo)）標(biāo)準(zhǔn)品2.02 mg、2.02 mg、2.02 mg、2.02 mg、2.06 mg、2.04 mg、2.01 mg、2.03 mg、2.02 mg、2.03 mg、2.06 mg，分別置于2 ml容量瓶中，以純甲醇定容至刻度，搖勻，得儲(chǔ)備液，分裝后儲(chǔ)存于-20 ℃的冰箱中。精密稱取2.01 mg木犀草苷，置于2 ml 容量瓶中，加入少量二氯甲烷溶解，然后用純甲醇稀釋至刻度，搖勻，得到對(duì)照品的儲(chǔ)備液，分裝后置于-20 ℃冰箱保存。精密稱取2.03 mg 金絲桃苷，置于2 ml 容量瓶中，加入少量二甲基亞砜DMSO 溶解，然后用純甲醇稀釋至刻度，搖勻，得到對(duì)照品的儲(chǔ)備液，分裝后置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.4 供試品溶液的制備 取預(yù)防經(jīng)典方中黃芪15 g、麩炒白術(shù)9 g、防風(fēng)9 g、貫眾6 g、金銀花9 g、陳皮6 g、佩蘭9 g，置于容器中加入800 ml 水浸泡30 min，再用煎藥壺（蘇泊爾液體加熱器，SW.30Y06）煎煮100 min，冷卻后倒出濾液混勻約300 ml，取1 ml 濾液，加入10 μg/ml 的利血平10 μl，渦旋混勻3 min，室溫，13 500 r/min 條件下離心10 min 后取上清液，過0.22 μm 微孔濾膜后，取續(xù)濾液進(jìn)樣分析。

1.3 方法學(xué)考察

1.3.1 專屬性 專屬性（specificity）指所建立的方法能從樣本中準(zhǔn)確選擇待測(cè)化合物并同其余雜質(zhì)區(qū)分的能力。取12 種化合物適量，隨后再用純甲醇稀釋，制得黃芪甲苷濃度為0.2 μg/ml、升麻苷濃度為2.0 μg/ml、木犀草苷濃度為0.2 μg/ml、金絲桃苷濃度為2.0 μg/ml、毛蕊異黃酮苷濃度為0.1 μg/ml、亥茅酚苷濃度為0.2 μg/ml、刺芒柄花苷濃度為0.1 μg/ml 苷、川陳皮素濃度為0.2 μg/ml、桔皮素濃度為0.1 μg/ml、升麻素濃度為0.2 μg/ml、毛蕊異黃酮濃度為0.1 μg/ml、白術(shù)內(nèi)酯-Ⅲ濃度為0.1 μg/ml的定量下限（LLOQ）濃度。同上制作利血平（內(nèi)標(biāo)）的標(biāo)準(zhǔn)品樣本。取來自3 份不同試劑瓶的甲醇和供試品樣本，按照“1.2.4 供試品溶液的制備”所述方法進(jìn)行處理后進(jìn)樣分析。待測(cè)化合物及內(nèi)標(biāo)的響應(yīng)不超過LLOQ 樣本響應(yīng)的20% 及內(nèi)標(biāo)響應(yīng)的5%時(shí)即為合格。

1.3.2 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一對(duì)照品溶液，根據(jù)“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣6 次，并記錄峰面積。相對(duì)峰面積的RSD%在15%以內(nèi)，表明進(jìn)樣儀器的精密度良好。

1.3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取預(yù)防經(jīng)典方一批，按照“1.2.4”項(xiàng)平行制備6 份供試品溶液，測(cè)定在“1.2.1”項(xiàng)色譜條件下的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。相對(duì)保留面積RSD%在15% 以內(nèi)。表明該實(shí)驗(yàn)方法的重復(fù)性良好。

1.3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取預(yù)防經(jīng)典方一批，并根據(jù)“1.2.4”項(xiàng)下平行制備6 份供試品溶液，在“1.2.1”項(xiàng)色譜條件下，分別記錄0、2、4、8、24 h 的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。相對(duì)保留面積RSD%在15%以內(nèi)。表明供試樣品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性好。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察結(jié)果

2.1.1 專屬性考察結(jié)果 取12 種化合物適量，隨后再用純甲醇稀釋，制得最低定量下限濃度樣本，見圖2。同上制作利血平（內(nèi)標(biāo)）的標(biāo)準(zhǔn)品樣本，見圖3。取來自3 份不同試劑瓶的甲醇和供試品樣本，按照“1.2.4 供試品溶液的制備”所述方法進(jìn)行處理后進(jìn)樣分析，見圖4。待測(cè)化合物及內(nèi)標(biāo)的響應(yīng)均不超過LLOQ 樣本響應(yīng)的20% 及內(nèi)標(biāo)響應(yīng)的5%，專屬性考察合格。

圖2 空白色譜圖

圖3 內(nèi)標(biāo)色譜圖

圖4 最低定量限色譜圖

2.1.2 線性考察結(jié)果 按照“1.2.3”項(xiàng)下制備標(biāo)準(zhǔn)品溶液，得到混合對(duì)照品色譜圖。將標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液用純甲醇稀釋，黃芪甲苷、升麻素、木犀草苷、亥茅酚苷、川陳皮素濃度梯度為：0.2、0.5、1、2、5、8、10 μg/ml；毛蕊異黃酮苷、刺芒柄花苷、桔皮素、毛蕊異黃酮、白術(shù)內(nèi)酯-Ⅲ濃度梯度為：0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 μg/ml；升麻苷、金絲桃苷濃度梯度為：2、4、6、8、10、20、50 μg/ml；在“1.2.1”項(xiàng)色譜條件下，分別記錄12 種有效成分的峰面積，以峰面積（Y）對(duì)濃度（X）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表3。

表3 線性考察結(jié)果

2.1.3 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果 取同一對(duì)照品溶液，根據(jù)“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣6 次，并記錄峰面積。黃芪甲苷、升麻苷、金絲桃苷、木犀草苷、毛蕊異黃酮苷、亥茅酚苷、刺芒柄花苷、川陳皮素、桔皮素、升麻素、毛蕊異黃酮、白術(shù)內(nèi)酯-Ⅲ的峰面積RSD%分別為3.72%、0.85%、2.16%、2.11%、1.62%、0.94%、1.11%、0.72%、0.89%、1.35%、1.13%、0.48%，均小于15%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 取同一供試品溶液，并根據(jù)“1.2.1”項(xiàng)色譜條件在0、2、4、8、24 h 測(cè)定。黃芪甲苷、升麻苷、金絲桃苷、木犀草苷、毛蕊異黃酮苷、亥茅酚苷、刺芒柄花苷、川陳皮素、桔皮素、升麻素、毛蕊異黃酮、白術(shù)內(nèi)酯-Ⅲ的峰面積RSD%分別為5.73%、1.24%、5.72%、8.43%、2.84%、1.37%、3.03%、5.67%、6.91%、2.64%、5.33%、3.11%，均小于15%，表明供試品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 取同一供試品溶液，按照“1.2.4 供試品溶液的制備”項(xiàng)下條件，平行制備6 份樣品，并根據(jù)“1.2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，黃芪甲苷、升麻苷、金絲桃苷、木犀草苷、毛蕊異黃酮苷、亥茅酚苷、刺芒柄花苷、川陳皮素、桔皮素、升麻素、毛蕊異黃酮、白術(shù)內(nèi)酯-Ⅲ的峰面積RSD 分別為3.53%、7.53%、5.97%、8.43%、4.73%、4.15%、3.75%、5.37%、3.85%、4.02%、8.17%、1.53%，均小于15%，表明系統(tǒng)重復(fù)性良好。

2.1.6 加樣回收率 精密量取預(yù)防經(jīng)典方溶液0.5 ml，加入各對(duì)照品適量，平行制備6 份，按“1.2.4”項(xiàng)方法制備供試品溶液，并根據(jù)“1.2.1”項(xiàng)的色譜條件進(jìn)行分析，計(jì)算各待測(cè)物的平均回收率，按照“回收率=（實(shí)測(cè)量－樣品含量）/加入量×100%”公式計(jì)算加樣回收率，黃芪甲苷、升麻苷、金絲桃苷、木犀草苷、毛蕊異黃酮苷、亥茅酚苷、刺芒柄花苷、川陳皮素、桔皮素、升麻素、毛蕊異黃酮、白術(shù)內(nèi)酯-Ⅲ的平均加樣回收率分別為107.57%、106.55%、100.59%、110.61%、106.68%、92.68%、112.46%、85.39%、109.46%、99.08%、101.47%、96.61%。

2.2 樣品含量測(cè)定

取3 批預(yù)防經(jīng)典方藥方，按“1.2.4 供試品溶液的制備”項(xiàng)制備樣本，按“1.2.1 色譜條件”項(xiàng)色譜條件測(cè)定黃芪甲苷、升麻苷、金絲桃苷、木犀草苷、毛蕊異黃酮苷、亥茅酚苷、刺芒柄花苷、川陳皮素、桔皮素、升麻素、毛蕊異黃酮、白術(shù)內(nèi)酯-Ⅲ的含量，測(cè)定結(jié)果見表4。

表4 3 批新冠肺炎火神山預(yù)防經(jīng)典方樣品中12 種有效成分的測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 供試品溶液的制備

火神山醫(yī)院新冠肺炎預(yù)防經(jīng)典方由黃芪、麩炒白術(shù)、防風(fēng)、貫眾、金銀花、陳皮、佩蘭等7 味中藥組方而成，黃芪具有補(bǔ)氣固表、利尿托毒、排膿、斂瘡生肌之功效，近年研究表明，黃芪主要含黃芪多糖、黃芪皂苷和黃酮類成分，具有增強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能、抗心肌缺血、雙向調(diào)節(jié)血壓、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、保肝、抗腫瘤、清除自由基和抗衰老等作用［6］。白術(shù)的干燥根莖，具有健脾益氣、燥濕利水、止汗安胎之效［7］。主治脾虛食少、腹脹泄瀉、痰飲眩悸、水腫、自汗、胎動(dòng)不安等癥［8］。近年來的研究表明白術(shù)具有利尿、抗菌、抗衰老、抗腫瘤等作用，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、子宮平滑肌、腸胃運(yùn)動(dòng)也有一定作用，還能調(diào)節(jié)免疫功能［9］。防風(fēng)主要具有解熱、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗炎、抗菌、抗腫瘤、提高機(jī)體免疫功能、抗過敏、抗凝血等藥理作用［10］。貫眾具有清熱解毒、驅(qū)蟲、涼血、止血等作用。臨床上用于治療風(fēng)熱感冒，濕熱癍疹、吐血、便血及崩漏等疾病［11］。金銀花具有抗炎、解熱、抗菌、抗病毒、保肝利膽、抗氧化、抗血小板聚集、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力等作用，臨床應(yīng)用時(shí)應(yīng)結(jié)合具體病情，選用適宜的配伍方案，以取得最佳的治療效果［12］。陳皮味苦、辛，性溫，歸肺、脾經(jīng)。具理氣健脾、燥濕化痰之功［13］。佩蘭用于濕濁中阻，脘痞嘔惡，口中甜膩，口臭，多涎，暑濕表證，濕溫初起，發(fā)熱倦怠，胸悶不舒［14］。中藥中主成分對(duì)治療新冠肺炎起著重要的作用，中藥的煎煮對(duì)實(shí)驗(yàn)的成功起著重要的作用。將中藥置于容器中加入800 ml 水浸泡30 min，再用冷卻的煎藥壺煎煮100 min，待藥液冷卻后倒出濾液混勻約300 ml，煎藥過程中嚴(yán)格把控加入水量、浸泡時(shí)間、煎煮時(shí)間。

3.2 內(nèi)標(biāo)的選擇

在預(yù)實(shí)驗(yàn)中分別考察了苯甲酸、卡馬西平、利血平3 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品作為內(nèi)標(biāo)，根據(jù)3 個(gè)內(nèi)標(biāo)的響應(yīng)和出峰時(shí)間，最終選用了出峰時(shí)間居中、響應(yīng)好、穩(wěn)定性高的利血平作為內(nèi)標(biāo)。

3.3 色譜柱的選擇

使用乙腈-0.1% 甲酸水溶液（60∶40）作為流動(dòng)相，分別選用ZORBAX SB-C18（2.1 mm×50 mm，3.5 μm，Agilent，USA），顯示化合物出峰過早，該柱對(duì)化合物的保留效果較差。Xbridge?HILIC（2.1 mm×100 mm 3.5 μm，Waters，USA），顯示化合物出峰較晚，該柱對(duì)化合物的保留時(shí)常較長，不宜選用。ZORBAX SB-C18（2.1 mm×150 mm 3.5 μm，Agilent，USA），顯示化合物出峰較晚，該柱對(duì)化合物的保留較長，不宜選用。ZORBAX SB-C18（2.1 mm×100 mm 3.5 μm，Agilent，USA），顯示化合物出峰時(shí)間適宜，符合選用標(biāo)準(zhǔn)。

3.4 流動(dòng)相的選擇

實(shí)驗(yàn)考察了乙腈-0.1% 甲酸水溶液作為流動(dòng)相，結(jié)果顯示峰形有拖尾現(xiàn)象，增加水相中的甲酸濃度至0.2% 的流動(dòng)相，酸性的增強(qiáng)抑制了酸性化合物的電離，保留時(shí)間增加，酸性化合物出現(xiàn)拖尾，而堿性化合物拖尾改善，但有峰裂分現(xiàn)象，隨后選用0.1%甲酸-10 mmol/L 醋酸銨水溶液-乙腈，所有化合物的峰形均有改善，堿性化合物略有拖尾現(xiàn)象，峰形無裂分，進(jìn)一步優(yōu)化流動(dòng)相為0.1% 甲酸-10 mmol/L 醋酸銨水溶液-0.1%甲酸乙腈，結(jié)果顯示所有化合物峰形較好，無拖尾、峰裂分現(xiàn)象。

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)建立了一種快速、靈敏、穩(wěn)定的UHPLCMS/MS 方法，方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明專屬性、線性、重復(fù)性、穩(wěn)定性、精密度、加樣回收率結(jié)果均符合要求。本法操作簡單、可靠，適用于測(cè)定新冠肺炎預(yù)防藥方寒濕郁肺湯中12 種主成分的含量測(cè)定，為火神山醫(yī)院新冠肺炎預(yù)防經(jīng)典方的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。