草地貪夜蛾腸道細(xì)菌分離鑒定與功能初探

陳亞平　杜鄂巍　李亞紅　魯智慧　李浩　桂富榮

摘要：【目的】明確草地貪夜蛾幼蟲腸道細(xì)菌的種類和功能，以詮釋腸道細(xì)菌對(duì)草地貪夜蛾寄主植物適應(yīng)性的影響，為揭示草地貪夜蛾的寄主適應(yīng)機(jī)制及進(jìn)一步預(yù)測(cè)其寄主譜擴(kuò)張趨勢(shì)提供依據(jù)?！痉椒ā坎捎脗鹘y(tǒng)的微生物分離純化方法對(duì)草地貪夜蛾腸道細(xì)菌進(jìn)行分離純化，對(duì)分離獲得的細(xì)菌菌株進(jìn)行16S rRNA序列同源性分析鑒定;利用篩選培養(yǎng)基對(duì)產(chǎn)生纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶及對(duì)苯酚有代謝能力的菌株進(jìn)行初篩，并進(jìn)一步用DNS法測(cè)定相關(guān)菌株產(chǎn)纖維素酶、木聚糖酶和果膠酶的酶活性，用含苯酚的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株，檢測(cè)菌株的苯酚降解效率?！窘Y(jié)果】共分離獲得45株細(xì)菌菌株，經(jīng)同源序列比對(duì)分析，45株細(xì)菌菌株分屬于3門5屬8種，分別是厚壁菌門（Firmicutes）的葡萄球菌屬（Staphylococcus）和芽孢桿菌屬（Bacillus），變形菌門（Proteobacteria）的克雷伯氏菌屬（Klebsiella）和不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter），放線菌門（Acinobacteria）的短桿菌屬（Curtobacterium），其中克雷伯氏菌屬的豐度最高。45株菌株中有產(chǎn)纖維素酶菌株11株，酶活力最高的是變棲克雷伯氏菌菌株K3，為0.105±0.007 U/mL;產(chǎn)木聚糖酶菌株10株，酶活力最高的是枯草芽孢桿菌菌株B9，為1.090±0.468 U/mL;產(chǎn)果膠酶菌株5株，酶活力最高的是變棲克雷伯氏菌菌株K27，為0.193±0.047 U/mL;降解苯酚的菌株9株，降解速率最高的是沙福芽孢桿菌菌株B8，為（0.347±0.042）%?！窘Y(jié)論】草地貪夜蛾幼蟲腸道細(xì)菌的產(chǎn)酶菌株多樣性較高，推測(cè)這是導(dǎo)致草地貪夜蛾寄主譜廣，對(duì)寄主為害嚴(yán)重的原因之一。

關(guān)鍵詞： 草地貪夜蛾;腸道細(xì)菌;分離鑒定;酶活測(cè)定;苯酚降解

中圖分類號(hào)： S433.4? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2022）03-0821-09

Isolation，identification and functional analysis of intestinal bacteria of Spodoptera frugiperda

CHEN Ya-ping DU E-wei LI Ya-hong LU Zhi-hui LI Hao GUI Fu-rong

（1Plant Protection College，Yunnan Agricultural University/State Key Laboratory for Conservation and Utilization

of Bioresources in Yunnan， Kunming， Yunnan? 650201， China; 2 Yunnan Plant Protection and Plant

Inspection Station， Kunming， Yunnan? 650034， China）

Abstract：【Objective】To clarify the species and functions of intestinal bacteria of Spodoptera frugiperda and explain the effects of intestinal bacteria on the adaptability of S. frugiperda to host plants，so as to provide a theoretical basis for revealing the host adaptation mechanism of S. frugiperda and predict the expansion trend of host spectrum. 【Method】The intestinal bacteria of S. frugiperda were isolated and purified using the microbial isolation and purification methods，and the 16S rRNA gene sequence homology analysis was performed on the isolated bacterial strains. The strains that produced cellulase，xylanase，pectinase and metabolized phenol were preliminarily screened. And the cellulase，xylanase，pectinase production activities and metabolism of phenol were analyzed through DNS method. The strains were cultured in phenol-containing inorganic salt medium to detect their phenol degradation efficiency. 【Result】A total of 45 bacterial strains were isolated by comparative homologous sequence analysis，and they belonged to 5 genera of Firmicutes，Proteobacteria，and Acinobacteria，namely，Staphylococcus，Bacillus，Klebsiella，Acinetobacter and Colletotrichum，among which Klebsiella had the highest abundance. Among the 45 strains，11 strains could produce cellulase and K3 of Klebsiella had the highest enzyme activity of 0.105±0.007 U/mL; 10 strains could produce xylanase and B9 of Bacillus had the highest enzyme activity of 1.090±0.468 U/mL; 5 strains could produce pectinase K27 of Klebsiella had the highest enzyme activity of 0.193±0.047 U/mL; 9 strains could degrade phenol and B8 of Bacillus had the highest degradation rate of （0.347±0.042）%. 【Conclusion】Diversity of enzyme-producing strains of intestinal bacteria in S. frugiperda larvae is speculated to be one of the reasons for the wide host spectrum and serious damage to the host.

Key words： Spodoptera frugiperda; intestinal bacteria; isolation and identification; enzyme activity determination; phenolic degradation

Foundation items： National key Research and Development Program of China （2021YFD1400701）

0 引言

【研究意義】草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）屬鱗翅目（Lepidoptera）夜蛾科（Noctuidae），原產(chǎn)于美洲熱帶和亞熱帶地區(qū)，是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織全球預(yù)警的跨境遷飛性重大害蟲，目前已入侵全球100多個(gè)國(guó)家和地區(qū)（蘇湘寧等，2020;Gui et al.，2020），給各地農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)造成毀滅性打擊。該蟲于2019年1月侵入我國(guó)云南江城，是近年來(lái)入侵我國(guó)的重大農(nóng)業(yè)害蟲之一，位列農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的一類農(nóng)作物十大害蟲之首。2020年草地貪夜蛾在我國(guó)27個(gè)省1423個(gè)縣發(fā)生，發(fā)生面積超過(guò)133萬(wàn)ha，對(duì)我國(guó)糧食作物的安全生產(chǎn)構(gòu)成極大威脅（田良恒等，2021;Wu et al.，2021）。草地貪夜蛾造成嚴(yán)重危害的重要原因之一是其寄主范圍廣，達(dá)76科353種（Montezano et al.，2018），且其寄主譜還在不斷擴(kuò)大，據(jù)報(bào)道，生姜、煙草和茶葉等多種具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的經(jīng)濟(jì)作物均是其潛在寄主（Lü et al.，2021）。草地貪夜蛾能在各種復(fù)雜的棲境中定殖和為害，與其較廣的寄主譜及對(duì)寄主植物的有效利用密切相關(guān)，而腸道細(xì)菌在其對(duì)寄主的適應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。因此，研究草地貪夜蛾腸道可培養(yǎng)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能，有助于進(jìn)一步研究腸道細(xì)菌在昆蟲對(duì)寄主植物適應(yīng)中的作用，為草地貪夜蛾的防控打下基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】昆蟲腸道內(nèi)的大量共生菌與其昆蟲宿主一起作為一個(gè)共生體受到自然選擇作用，在不同的環(huán)境及取食條件中，逐漸塑造出一個(gè)使昆蟲機(jī)體適應(yīng)環(huán)境及食物的腸道微生物群落，并且可能通過(guò)垂直傳遞被保留下來(lái)（Wilson et al.，2010），而腸道微生物也同時(shí)直接影響著昆蟲宿主的生理活動(dòng)，這些微生物與昆蟲一起協(xié)同完成許多重要的功能。如可為昆蟲提供營(yíng)養(yǎng)（李丹紅等，2017），蚜蟲取食植物韌皮汁液，這些汁液缺乏蚜蟲生存所必須的氨基酸，而蚜蟲腸道共生菌則為其合成這些必須的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（Wilson et al.，2010）;在昆蟲生長(zhǎng)過(guò)程中必不可少的維生素，直接來(lái)源于食物的量無(wú)法滿足其正常發(fā)育，不足的部分可由腸道細(xì)菌合成來(lái)進(jìn)行補(bǔ)充（Jing et al.，2020）。對(duì)寄主植物營(yíng)養(yǎng)成分的降解也主要由腸道微生物來(lái)完成，前人采用傳統(tǒng)微生物分離方法從棉鈴蟲、小菜蛾和家蠶腸道中分離得到的可培養(yǎng)細(xì)菌有水解纖維素、木聚糖、果膠、淀粉和脂肪的能力（Anand et al.，2010;Briones-Roblero et al.，2017;Gandotra et al.，2018）。此外，昆蟲對(duì)寄主植物進(jìn)行利用還需應(yīng)對(duì)植物內(nèi)含有的次生代謝物質(zhì)和防御性物質(zhì)（Xu et al.，2016），如玉米根蟲腸道細(xì)菌可保護(hù)其免受大豆葉片中的半胱氨酸蛋白酶抑制劑的毒害，使玉米根蟲能在食源缺乏的情況下取食大豆葉片（Chu et al.，2013）;從舞毒蛾腸道中分離的不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌可降解其主要寄主山楊分泌的有毒性的酚苷類化合物，從而保護(hù)昆蟲在取食后不受毒性影響（Mason et al.，2016）;毛健夜蛾的主要寄主植物是富含生物堿的石蒜科植物，其腸道內(nèi)的克雷伯氏菌能降解生物堿，在其腸道內(nèi)還分離到酪黃腸球菌，能耐受植物分泌的乳膠，可能對(duì)昆蟲的腸道具有保護(hù)作用（Vilanova et al.，2016）?，F(xiàn)已有研究關(guān)注到草地貪夜蛾的腸道微生物，研究?jī)?nèi)容多集中在草地貪夜蛾的分布區(qū)域和入侵階段等因素對(duì)其腸道細(xì)菌群落的影響（唐運(yùn)林等，2019;張凌英等，2020;張?jiān)婈傻龋?020）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，草地貪夜蛾對(duì)寄主植物的適應(yīng)能力與其腸道細(xì)菌功能之間的關(guān)系尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用傳統(tǒng)的微生物分離純化方法對(duì)草地貪夜蛾的腸道細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)及鑒定，并驗(yàn)證其對(duì)自身無(wú)法降解的食物成分（纖維素、木聚糖、果膠及酚類）的降解能力，為草地貪夜蛾腸道細(xì)菌響應(yīng)寄主植物的不同營(yíng)養(yǎng)成分及次生物質(zhì)脅迫研究提供參考，也為揭示其寄主適應(yīng)機(jī)制及進(jìn)一步預(yù)測(cè)寄主譜擴(kuò)張趨勢(shì)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

1. 1. 1 供試蟲源 草地貪夜蛾采自云南省玉溪市（東經(jīng)101°58′，北緯23°35′，海拔421 m），在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用自主栽培的玉米葉片飼養(yǎng)10代以上[飼養(yǎng)溫度（27±0.5）℃，相對(duì)濕度（70±5）%，光周期L∶D=16 h∶8 h]。成蟲羽化后，以1∶1的雌雄比配對(duì)，取同一雌蟲產(chǎn)下的卵粒進(jìn)行試驗(yàn)。

1. 1. 2 主要試劑及培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，瓊脂15 g，水1 L;營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g，水1 L;沙門菌培養(yǎng)基（SS）：牛肉粉5 g，蛋白胨5 g，三號(hào)膽鹽3.5 g，瓊脂15 g，乳糖10 g，檸檬酸鈉8.5 g，硫代硫酸鈉8.5 g，檸檬酸鐵1 g，中性紅0.025 g，煌綠0.00033 g，水1 L;纖維素篩選培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉10 g，蛋白胨1 g，（NH）SO 4 g，NaCl 1 g，KHPO 2 g，MgSO·7HO 0.4 g，瓊脂20 g，水1 L，pH 7.0;木聚糖篩選培養(yǎng)基：木聚糖8 g，酵母粉1 g，（NH）SO 4 g，KHPO 2 g，NaCl 0.5 g，MgSO·7HO 0.5 g，瓊脂20 g，水1 L，pH 7.0;果膠篩選培養(yǎng)基：果膠粉10 g，酵母粉1 g，（NH）SO 4 g，KHPO 1 g，KCl 0.5 g，MgSO·7HO 0.4 g，F(xiàn)eSO 0.01 g，瓊脂20 g，水1 L，pH 7.0;苯酚降解培養(yǎng)基：苯酚0.1 g，KHPO 1 g，KHPO 0.3 g，MgSO·7HO 0.1 g，NaCl 1 g，NHNO 1 g，瓊脂20 g，水1 L，pH 7.0;纖維素酶鑒定培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉5 g，（NH）SO 2 g，NaCl 1 g，KHPO 2 g，MgSO·7HO 0.2 g，CaCl 0.1 g，瓊脂20 g，水1 L，pH 7.0;木聚糖酶鑒定培養(yǎng)基：木聚糖5 g，（NH）SO 2 g，KHPO 2 g，NaCl 1 g，MgSO·7HO 0.2 g，瓊脂20 g，水1 L，pH 7.0;果膠酶鑒定培養(yǎng)基：果膠粉5 g，（NH）SO 2 g，KHPO 1 g，NaNO 3 g，KCl 0.5 g，MgSO·7HO 0.4 g，F(xiàn)eSO 0.01 g，瓊脂20 g，水1 L，pH 7.0;無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基（MSM）：苯酚0.1 g，KHPO 1 g，KHPO 0.3 g，MgSO·7HO 0.1 g，NaCl 1 g，NHNO 1 g，水1 L，pH 7.0。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 草地貪夜蛾中腸細(xì)菌分離 取5頭健康且生長(zhǎng)發(fā)育程度較一致的草地貪夜蛾5齡幼蟲，饑餓處理24 h左右使其排空腸道內(nèi)食物殘?jiān)?。用無(wú)菌水沖洗后浸入75%酒精溶液中1 min，然后用無(wú)菌水清洗蟲體3次，放入滅菌培養(yǎng)皿中，用尖頭鑷輕輕拉拽以取出完整的腸道，去除前腸、后腸及馬氏管，將中腸置于2 mL無(wú)菌凍存管中，加入少量磷酸緩沖液后用鑷子輕輕搗碎，勻漿，補(bǔ)充磷酸緩沖液至1 mL。將含草地貪夜蛾中腸的懸液分別稀釋至10-3、10-4和10-5后備用，并各取100 μL分別涂布于LB、NA和SS固體培養(yǎng)基上（黃秀梨和辛明秀，2008），各設(shè)3次重復(fù)，置于30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h。選取菌落數(shù)量適中的培養(yǎng)皿，用接種環(huán)挑取不同形態(tài)特征的單菌落，經(jīng)5次劃線得到純培養(yǎng)菌株，置于2 mL液體培養(yǎng)基凍存管中，30 ℃下180 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h，添加50%的甘油后置于-80 ℃超低溫冰箱中保存（鄭亞強(qiáng)等，2017）。

1. 2. 2 草地貪夜蛾腸道細(xì)菌DNA提取及PCR擴(kuò)增

按照DNA提取試劑盒[天根生物科技（北京）有限公司]的操作步驟提取腸道細(xì)菌DNA。以提取得到的細(xì)菌基因組DNA為模版，使用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）/1492R（5'-CTA CGGCTACCTTGTTACGA-3'）進(jìn)行16S rRNA PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系25.0 μL：RCR Mix 12.5 μL，DNA模板1.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，ddH2O補(bǔ)足至25.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。反應(yīng)完成后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至上海擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1. 2. 3 草地貪夜蛾腸道細(xì)菌菌株分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析 對(duì)所有樣本的有效標(biāo)簽進(jìn)行聚類，默認(rèn)相似性大于97%即定義為一個(gè)操作分類單元（Operational taxonomic unit，OTU），統(tǒng)計(jì)各分類水平的物種在每個(gè)樣本中的相對(duì)豐度。將可培養(yǎng)分離的菌株獲得的16S rRNA序列與GenBank中已知序列進(jìn)行BLAST同源比對(duì)，下載GenBank中同源性較高序列，利用MEGA X10.0.2，使用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）進(jìn)行1000次補(bǔ)償計(jì)算，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1. 2. 4 草地貪夜蛾腸道細(xì)菌對(duì)纖維素、木聚糖和果膠降解功能分析 將分離純化獲得的菌株分別點(diǎn)接到纖維素篩選培養(yǎng)基、木聚糖篩選培養(yǎng)基和果膠篩選培養(yǎng)基（黃秀梨和辛明秀，2008），每株菌株設(shè)3個(gè)重復(fù)，將各培養(yǎng)基平板倒置于恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)72 h，篩選出能在上述培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌株。將篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株分別點(diǎn)接至纖維素酶鑒定培養(yǎng)基、果膠酶鑒定培養(yǎng)基和木聚糖酶鑒定培養(yǎng)基，并放置于恒溫箱中30 ℃培養(yǎng)7 d后，分別使用剛果紅、溴酚藍(lán)和盧戈式碘液進(jìn)行染色，觀察菌落周圍是否產(chǎn)生透明圈。將有產(chǎn)酶活性的菌株，分別采用DNS法測(cè)定相關(guān)菌株產(chǎn)纖維素酶、木聚糖酶和果膠酶的酶活性。

1. 2. 5 草地貪夜蛾腸道細(xì)菌對(duì)苯酚的降解功能分析 將分離純化獲得的菌株接種到苯酚降解培養(yǎng)基上。將培養(yǎng)基平板倒置于恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)72 h。將能在苯酚降解培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株接種到含苯酚的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中于37 ℃下200 r/min搖床培養(yǎng)，采用分光光度計(jì)比色法檢測(cè)苯酚降解效率。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），采用Duncan’s多重比較分析各菌株間同一種酶活性的差異。

2 結(jié)果與分析

2. 1 草地貪夜蛾腸道細(xì)菌分離結(jié)果

從各類培養(yǎng)基上共獲得菌落形態(tài)相異的45株菌株，將獲得的16S rRNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)表1。45條序列與5個(gè)屬的16S rRNA序列同源性較高，序列相似性在99%以上，菌株分別屬于3門5屬8種，分別為：厚壁菌門（Firmicutes）的葡萄球菌屬（Staphylococcus）和芽孢桿菌屬（Bacillus）;變形菌門（Proteobacteria）的克雷伯氏菌屬（Klebsiella）和不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）;放線菌門（Acinobacteria）的短桿菌屬（Curtobacterium）。

2. 2 草地貪夜蛾腸道細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

對(duì)測(cè)序獲得的草地貪夜蛾腸道細(xì)菌16S rRNA序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果（圖1）表明，其腸道細(xì)菌主要由兩大類群組成，系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹共分為兩大支：菌株S7、S22、S23和S26與其他已知的葡萄球菌屬菌株聚為一小支，B1、B8和B9與其他芽孢桿菌屬的菌株聚為一小支，這2個(gè)分支構(gòu)成厚壁菌門，并與放線菌門短桿菌屬的菌株C11聚為一大支;克雷伯氏菌屬的菌株K20與不動(dòng)桿菌屬的菌株A30聚為變形菌門的一大支。

2. 3 草地貪夜蛾腸道細(xì)菌產(chǎn)纖維素酶、木聚糖酶和果膠酶活性分析結(jié)果

將分離獲得的45株細(xì)菌菌株分別接種到纖維素酶、果膠酶和木聚糖酶篩選培養(yǎng)基上，共篩選出產(chǎn)酶菌株19株（圖2），占總分離菌株數(shù)的42.2%。其中，產(chǎn)纖維素酶菌株11株，分別隸屬于厚壁菌門、變形菌門和放線菌門中葡萄桿菌屬的腐生葡萄球菌和木糖葡萄球菌，芽孢桿菌屬的枯草芽孢桿菌，克雷伯氏菌屬的變棲克雷伯氏菌，短桿菌屬的極小短桿菌;10株產(chǎn)木聚糖酶菌株，分別隸屬于厚壁菌門、變形菌門和放線菌門中芽孢桿菌屬的枯草芽孢桿菌，克雷伯氏菌屬的變棲克雷伯氏菌，不動(dòng)桿菌屬的約氏不動(dòng)桿菌，短桿菌屬的極小短桿菌;5株產(chǎn)果膠酶菌株，分別隸屬于厚壁菌門、變形菌門和放線菌門中葡萄球菌屬的表皮葡萄球菌，芽孢桿菌屬的枯草芽孢桿菌，克雷伯氏菌屬的變棲克雷伯氏菌，不動(dòng)桿菌屬的約氏不動(dòng)桿菌，短桿菌屬的極小短桿菌（表2）。

將產(chǎn)酶菌株分別接種至LB液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30 ℃下250 r/min培養(yǎng)3 d后測(cè)定其發(fā)酵液中相關(guān)酶活性，結(jié)果（表2）顯示，產(chǎn)纖維素酶活性最高的菌株是變棲克雷伯氏菌K3，為0.105±0.007 U/mL，其次為C4、B9和B29，4株菌株間產(chǎn)纖維素酶活性差異不顯著（P>0.05，下同），且均顯著高于其他產(chǎn)纖維素酶菌株的酶活性（P<0.05，下同）;產(chǎn)木聚糖酶活性最高的菌株是枯草芽孢桿菌B9，為1.323±0.635 U/mL，顯著高于K36菌株外的其他產(chǎn)木聚糖酶菌株的酶活性;產(chǎn)果膠酶活性最高的菌株是變棲克雷伯氏菌K27，為0.193±0.047 U/mL，顯著高于其他產(chǎn)果膠酶菌株的酶活性。

2. 4 草地貪夜蛾腸道細(xì)菌對(duì)苯酚降解能力分析結(jié)果

分離獲得的45株細(xì)菌菌株中有9株可降解苯酚（表2），分別隸屬于厚壁菌門、變形菌門和放線菌門中葡萄桿菌屬的表皮葡萄球菌，芽孢桿菌屬的沙福芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌，克雷伯氏菌屬的變棲克雷伯氏菌，不動(dòng)桿菌屬的約氏不動(dòng)桿菌，短桿菌屬的極小短桿菌。其中，沙福芽孢桿菌B8對(duì)苯酚的降解速率最高，為（0.347±0.042）%，顯著高于K20菌株外的其他7株菌株。

3 討論

昆蟲與寄主植物的協(xié)同進(jìn)化機(jī)制較多，其中腸道微生物群落在其協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，如對(duì)植物細(xì)胞壁的降解、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝及植物防御性次生物質(zhì)的耐受等。研究發(fā)現(xiàn)，白蟻的腸道細(xì)菌為白蟻提供了高活性的纖維素酶，催化植物細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化為可利用的發(fā)酵產(chǎn)品，以彌補(bǔ)其自身缺乏木質(zhì)纖維素降解基因的不足（Warnecke et al.，2007），從而使昆蟲能補(bǔ)充其自身生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng);此外，白蟻的腸道細(xì)菌還可將宿主產(chǎn)生的含氮廢棄物或大氣氮合成氨，提供給昆蟲必須的氨基酸和維生素（Calderón-Cortés et al.，2012）。果膠是構(gòu)成植物細(xì)胞壁的重要成分，Jing等（2014）在意大利蜜蜂的腸道中發(fā)現(xiàn)了能降解果膠的共生菌。酚類是植物中最廣泛也是最重要的一種防御性次生物質(zhì)，會(huì)影響昆蟲對(duì)食物的消化吸收并誘導(dǎo)活性氧產(chǎn)生，活性氧對(duì)許多鱗翅目昆蟲有很強(qiáng)的毒性。夏曉峰（2014）發(fā)現(xiàn)小菜蛾在食物消化過(guò)程中，腸桿菌能對(duì)進(jìn)入中腸的有毒酚類進(jìn)行有效降解，而這些腸道細(xì)菌對(duì)特定食物進(jìn)行分解代謝、提高宿主繁殖力及其與昆蟲宿主基因間的交流互補(bǔ)，促使昆蟲隨著寄主植物發(fā)生協(xié)同進(jìn)化（Bevins and Salzman，2011），因此，從昆蟲腸道細(xì)菌的角度來(lái)研究昆蟲的食性具有重要意義。

本研究采用傳統(tǒng)微生物分離純化方法，從草地貪夜蛾5齡幼蟲中腸中分離得到分屬3門5屬8種的45株細(xì)菌菌株，測(cè)序結(jié)果顯示，45株菌株中有25株屬于變形菌門，15株屬于厚壁菌門，5株屬于放線菌門。在門水平上，本研究中變形菌門和厚壁菌門是草地貪夜蛾幼蟲中腸細(xì)菌中的優(yōu)勢(shì)門，與其他昆蟲腸道細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)類群一致，說(shuō)明昆蟲腸道細(xì)菌的結(jié)構(gòu)具有一定的保守性。在屬和種水平上，本研究發(fā)現(xiàn)草地貪夜蛾幼蟲腸道優(yōu)勢(shì)細(xì)菌隸屬克雷伯氏菌屬，與前人對(duì)重慶及云南其他地區(qū)的研究結(jié)果一致。唐運(yùn)林等（2019）從重慶地區(qū)的草地貪夜蛾幼蟲腸道中分離到8個(gè)屬的細(xì)菌，其中克雷伯氏菌屬豐度最高;李青晏等（2020）對(duì)云南蒙自的草地貪夜蛾幼蟲和成蟲中腸細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)幼蟲腸道中克雷伯氏菌屬豐度最高;張志紅等（2020）研究表明，云南芒市草地貪夜蛾幼蟲腸道的優(yōu)勢(shì)種細(xì)菌為變棲克雷伯氏菌。而Acevedo等（2016）采用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法對(duì)美國(guó)草地貪夜蛾種群進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其3齡幼蟲腸道中主要的細(xì)菌種類為菠蘿泛菌、德維希腸桿菌、奎尼沃納沙雷氏菌、解鳥氨酸拉烏爾菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌和分散泛菌;Almeida等（2017）從巴西草地貪夜蛾腸道中發(fā)現(xiàn)7屬10種細(xì)菌，其中鉛黃腸球菌和蒙氏腸球菌為優(yōu)勢(shì)種。國(guó)內(nèi)外草地貪夜蛾種群幼蟲腸道可培養(yǎng)細(xì)菌種類與優(yōu)勢(shì)種類的差異，可能與地理環(huán)境有關(guān)。

此外，入侵云南的草地貪夜蛾種群基因型是C型（玉米型） （張磊等，2019;Gui et al.，2020），在云南主要為害玉米，而克雷伯氏菌普遍存在于玉米的根莖及種植土壤中，與植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成了密切的合作關(guān)系（李夢(mèng)嬌等，2014），提示云南草地貪夜蛾腸道克雷伯氏菌可能來(lái)源于寄主植物或由寄主植物介導(dǎo)的根際土壤。在本研究中，產(chǎn)纖維素酶和果膠酶活性最高的腸道菌株也為克雷伯氏菌，表明草地貪夜蛾取食玉米后克雷伯氏菌可在其腸道中穩(wěn)定定殖并協(xié)助宿主昆蟲提高對(duì)寄主植物的利用效率。已有研究證實(shí)植食性昆蟲的微生物出現(xiàn)在寄主植物上和植物根際土壤中，是由于植物可直接影響其種植土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)，繼而影響昆蟲腸道微生物組成，昆蟲腸道微生物、植物共生微生物及植物根際土壤微生物之間可能發(fā)生傳遞（Chi et al.，2005;Sugio et al.，2015）。Priya等（2012）研究發(fā)現(xiàn)，棉鈴蟲幼蟲腸道細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)與其寄主植物葉際細(xì)菌群落相似，表明寄主植物是昆蟲腸道細(xì)菌的重要來(lái)源。然而，寄主植物及其內(nèi)生菌在進(jìn)入昆蟲腸道后協(xié)助昆蟲適應(yīng)多樣化的寄主植物的生理代謝機(jī)制尚需進(jìn)一步探究。

本研究在分離獲得的45株細(xì)菌中篩選得到20株產(chǎn)酶和苯酚降解菌株，能降解纖維素的有3門4屬5種11株，能降解木聚糖的有3門4屬4種10株，能降解果膠的有3門5屬5種5株，能降解苯酚的有3門5屬6種9株，產(chǎn)酶菌株多樣性較高，并且數(shù)量在分離獲得的腸道細(xì)菌中所占比例較高。同屬鱗翅目的家蠶幼蟲腸道細(xì)菌產(chǎn)纖維素酶菌株分別有葡萄球菌屬、芽孢桿菌屬和不動(dòng)桿菌屬（李冠楠等，2014）;小菜蛾腸道細(xì)菌中則主要由腸桿菌和肉桿菌來(lái)執(zhí)行食物消化及對(duì)植物酚類解毒代謝的功能（夏曉峰，2014）;椰心葉甲腸道菌群只有芽孢桿菌屬能降解纖維素和木聚糖，此外帶化紅球菌能降解木聚糖（章雨璐等，2021）。相比而言，草地貪夜蛾腸道細(xì)菌中可行使?fàn)I養(yǎng)成分降解及植物次生物質(zhì)代謝的細(xì)菌種類更豐富，這可能是導(dǎo)致草地貪夜蛾對(duì)寄主適應(yīng)性強(qiáng)且食性高度多樣化的潛在原因。鄭亞強(qiáng)等（2017）從馬鈴薯塊莖蛾腸道分離出4門8屬的細(xì)菌菌株，對(duì)纖維素、木聚糖和果膠等3種大分子物質(zhì)均無(wú)降解能力，但獲得多株具有較強(qiáng)淀粉酶活性的菌株，這可能是馬鈴薯塊莖蛾為適應(yīng)高淀粉食物而形成的特有菌屬;椰子織蛾多取食棕櫚科植物的老硬葉片，其中纖維素、木聚糖等難降解物質(zhì)占比高于幼嫩葉片，涂艷等（2020）從椰子織蛾腸道中分離培養(yǎng)出多株具有較高纖維素酶及木聚糖酶活性的菌株，表明腸道細(xì)菌功能與其主要取食的寄主植物部位及營(yíng)養(yǎng)成分有直接關(guān)系。

4 結(jié)論

通過(guò)傳統(tǒng)微生物分離純化方法從草地貪夜蛾幼蟲腸道分離獲得3門5屬8種共45株細(xì)菌，其中有20株細(xì)菌可行使?fàn)I養(yǎng)成分降解及植物次生物質(zhì)代謝的功能，產(chǎn)酶菌株的多樣性較高，推測(cè)這是導(dǎo)致草地貪夜蛾寄主譜廣，對(duì)寄主為害嚴(yán)重的原因之一。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）