基于高通量測(cè)序的帶魚(yú)肌肉組織轉(zhuǎn)錄組微衛(wèi)星信息分析

劉玉萍　王棋　黃新芯　徐開(kāi)達(dá)　王忠明　高天翔　楊天燕

摘要：【目的】通過(guò)高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)帶魚(yú)肌肉組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，從海量數(shù)據(jù)中查找微衛(wèi)星（SSR）位點(diǎn)并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為科學(xué)制定帶魚(yú)種質(zhì)資源保護(hù)對(duì)策和管理措施提供參考依據(jù)?！痉椒ā炕贗llumina HiSeqTM 2500高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)采自浙江舟山近海的帶魚(yú)肌肉組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，經(jīng)FastQC和Trimmomatic進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估和過(guò)濾后，使用Trinity組裝、去冗余得到Unigenes，再運(yùn)用Micro-Satellite（MISA）挖掘SSR信息，并以Excel 2010計(jì)算SSR的數(shù)目、發(fā)生頻率、出現(xiàn)頻率、分布距離與密度、重復(fù)基元類別及重復(fù)區(qū)段長(zhǎng)度等信息。【結(jié)果】帶魚(yú)肌肉組織轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共獲得40424018條Raw reads，經(jīng)Trinity從頭組裝獲得70113條Transcripts，去冗余后得到50482條Unigenes，其總長(zhǎng)度為33886190 bp，平均長(zhǎng)度為671.25 bp。使用MISA進(jìn)行篩選，結(jié)果共發(fā)現(xiàn)18873個(gè)SSR位點(diǎn)，且這些SSR位點(diǎn)僅分布在其中的13082條Unigenes上，發(fā)生頻率為25.91%，出現(xiàn)頻率為37.39%。SSR按核苷酸重復(fù)類型進(jìn)行分類，可分為單核苷酸重復(fù)、二核苷酸重復(fù)、三核苷酸重復(fù)、四核苷酸重復(fù)、五核苷酸重復(fù)和六核苷酸重復(fù)6種類型，以單核苷酸重復(fù)SSR數(shù)最多（10763個(gè)），出現(xiàn)頻率高達(dá)21.32%;帶魚(yú)肌肉組織轉(zhuǎn)錄組SSR中共檢測(cè)出173種重復(fù)基元，以四核苷酸重復(fù)基元種類最多（66種）、單核苷酸重復(fù)基元種類最少（4種）。單核苷酸重復(fù)中以A堿基的數(shù)量最多，有5167個(gè)（占48.09%）;二核苷酸重復(fù)基元以TG為主，有692個(gè)（占19.55%）;三核苷酸重復(fù)基元中以GAG為主，有206個(gè)（占10.08%）;四核苷酸重復(fù)基元出現(xiàn)頻率較高的有AAAC、ATGG、ATGT、CTGT、CTTT和TCCA，出現(xiàn)頻率均為3.64%;五核苷酸重復(fù)和六核苷酸重復(fù)的基元類型數(shù)量分布較均勻，無(wú)明顯優(yōu)勢(shì)重復(fù)基元。SSR基元重復(fù)次數(shù)主要分布在5～6次和10～12次，共9864個(gè)，占SSR總數(shù)的52.27%。【結(jié)論】經(jīng)高通量測(cè)序獲得的帶魚(yú)肌肉轉(zhuǎn)錄組SSR可用性高且具有較高的多態(tài)性潛能，在此基礎(chǔ)上可有針對(duì)性進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，為帶魚(yú)遺傳多樣性評(píng)價(jià)、遺傳結(jié)構(gòu)分析及功能基因克隆等研究提供有效的分子標(biāo)記，進(jìn)而為其種質(zhì)資源的保護(hù)與利用提供遺傳學(xué)數(shù)據(jù)資料。

關(guān)鍵詞： 帶魚(yú);肌肉組織;微衛(wèi)星（SSR）;轉(zhuǎn)錄組;高通量測(cè)序

中圖分類號(hào)： S917.4;S965.326? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2022）03-0725-10

Bioinformatic analysis of microsatellite loci in the muscle transcriptome of Trichiurus lepturus based on

high-throughput sequencing

LIU Yu-ping WANG Qi HUANG Xin-xin XU Kai-da WANG Zhong-ming GAO Tian-xiang YANG Tian-yan

（1 Fisheries College， Zhejiang Ocean University， Zhoushan， Zhejiang? 316022， China; 2 Marine Fishery Research

Institute of Zhejiang Province， Zhoushan， Zhejiang? 316021， China）

Abstract：【Objective】Transcriptome sequencing of Trichiurus lepturus muscle tissue was carried out based on high-throughput sequencing platform. Microsatellite （SSR） loci were searched from massive data and bioinformatics analysis was conducted to provide references for germplasm resources protection and management of T. lepturus. 【Method】The Illumina HiSeqTM 2500 high-throughput sequencing platform was used to sequence the muscle transcriptome of T. lepturus collected from the coastal waters of Zhoushan， Zhejiang Province. The quality of high throughput sequencing data was evaluated and filtered by software FastQC and Trimmomatic. Unigenes were obtained through assembly and redundancy removal using software Trinity. Micro-Satellite （MISA） tool was performed to explore the SSR information. Excel 2010 was used to calculate the number， occurring frequency， appearing frequency， distribution distance and density， repeat motif and repeat length of SSR. 【Result】A total of 40424018 raw reads were generated from muscle transcriptome sequencing. About 70113 transcripts were obtained by de novo assembly using Trinity， and 50482 unigenes were retained after deduplication， with a total length of 33886190 bp and an average length of 671.25 bp. A total of 18873 SSR loci distributing among 13082 unigenes were screened by MISA， with the occurrence frequency of 25.91% and the occurrence frequency of 37.39%， respectively. SSR was classified according to the types of nucleotide repeats， which could be divided into six types：Mononucleotide repeat， dinucleotide repeat， trinucleotide repeat， tetranucleotide repeat， pentanucleotide repeat and hexanucleotide repeat. The number of mononucleotide repeat was the largest （10763）， with the occurrence frequency up to 21.32%. A total of 173 repeat motifs were detected， in which the number of tetranucleotide repeat motifs （66） was the largest and the number of mononucleotide repeat motifs （4） was the smallest. Among the mononucleotide repeats， the number of A was the largest （5167， 48.09%）; TG was the main dinucleotide repeat （692， 19.55%）; GAG was the main trinucleotide repeat （206， 10.08%）; AAAC， ATGG， ATGT， CTGT， CTTT and TCCA were the most frequent repeats with the same frequency of 3.64%. Pentanucleotide repeats and hexanucleotide repeats were evenly distributed， and no obvious dominant repeat motifs were observed. The number of repeat motifs （9864） was mainly distributed in 5-6 and 10-12 times， accounting for 52.27% of the total number of SSR. 【Conclusion】The SSRs obtained by high-throughput sequencing have higher availability and polymorphism potential. On this basis， researchers can targetedly design primers and provide effective molecular markers for the studies of genetic diversity evaluation， genetic structure analysis and functional genes cloning of T. lepturus， and then provide genetic data for further protection and utilization of its germplasm resources.FF6A4387-7446-4F61-9047-3F7726652A6C

Key words： Trichiurus lepturus; muscle tissue; microsatellite （SSR）; transcriptome; high-throughput sequencing

Foundation items： Zhejiang Key Research and Development Project（2019C02056）; Zhoushan Science and Technology Project （2022C41022）; Open Foundation for Marine Sciences of Zhejiang Ocean University in the First-Class Subjects of Zhejiang （20180017）

0 引言

【研究意義】帶魚(yú)（Trichiurus lepturus）又稱刀魚(yú)或肥帶等，隸屬于鱸形目（Perciformes）帶魚(yú)科（Tri-chiuridae）帶魚(yú)屬（Trichiurus），生活在溫暖水域，我國(guó)的渤海、黃海、東海及南海海區(qū)均有分布，曾與曼氏無(wú)針烏賊（Sepiella maindroni）、大黃魚(yú)（Larimichthys crocea）和小黃魚(yú)（L. polyactis）并稱為四大海產(chǎn)，是我國(guó)單魚(yú)種產(chǎn)量最高的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類（嚴(yán)利平等，2005;林龍山等，2006;李發(fā)凱等，2016）。但自20世紀(jì)80年代以來(lái)，由于過(guò)度捕撈和產(chǎn)卵場(chǎng)環(huán)境遭到破壞，東海帶魚(yú)種群一度出現(xiàn)小型化、低齡化和低質(zhì)化現(xiàn)象（徐漢祥等，1997;周永東等，2002）。近年來(lái)，隨著東海產(chǎn)卵帶魚(yú)保護(hù)區(qū)、東海帶魚(yú)國(guó)家級(jí)水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)和伏期休漁制度的建立，其資源衰退趨勢(shì)有所減緩，但整體形勢(shì)仍不容樂(lè)觀（杜萍等，2020）。因此，開(kāi)展帶魚(yú)種質(zhì)資源現(xiàn)狀及遺傳背景的調(diào)查研究，對(duì)于帶魚(yú)種群資源的恢復(fù)和開(kāi)發(fā)管理具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】至今，國(guó)內(nèi)外有關(guān)帶魚(yú)的研究主要集中在資源變動(dòng)、漁業(yè)生物學(xué)及種群生態(tài)學(xué)等方面（徐漢祥等，2003;凌建忠等，2004;林龍山等，2006;陳云龍等，2013;金鑫等，2014）。關(guān)于帶魚(yú)遺傳多樣性和種群鑒別的常見(jiàn)技術(shù)手段有同工酶（王可玲等，1994;楊天燕和高天翔，2007）、隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性（蒙子寧等，2003）、線粒體DNA（張繼民等，2009;鄭文娟等，2015;卞光明等，2017;吳仁協(xié)等，2019）及微衛(wèi)星（Yang et al.，2007;An et al.，2010;畢金貞，2010）等。其中，微衛(wèi)星DNA（Microsatellites DNA）又稱為簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple sequence repeat，SSR），是由1～6個(gè)核苷酸組成的串聯(lián)重復(fù)片段所構(gòu)成，每個(gè)單元長(zhǎng)度在1～10 bp，而單個(gè)微衛(wèi)星DNA的總長(zhǎng)度多在200 bp內(nèi)（趙彥花等，2019;周康奇等，2020）。SSR分子標(biāo)記廣泛分布于真核生物和少許原核生物基因組中，具有多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性良好、PCR擴(kuò)增重復(fù)性高、雜合率高且遵循孟德?tīng)栠z傳定律呈共顯性遺傳等優(yōu)點(diǎn)，已成為魚(yú)類種群遺傳多樣性、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、增殖放流效果評(píng)估等研究領(lǐng)域的重要分子標(biāo)記之一（何平，1998;朱濱和常劍波，1999;郭寶英等，2007）。近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，基于轉(zhuǎn)錄組（RNA-Seq）數(shù)據(jù)大規(guī)模開(kāi)發(fā)SSR分子標(biāo)記的研究已十分成熟和便捷（肖韻錚等，2020;楊利艷等，2020）。Mikheyev等（2010）從斑蝶（Euphydryas editha）轉(zhuǎn)錄組中快速挖掘出大量SSR位點(diǎn)，有效解決了鱗翅目（Lepidoptera）昆蟲(chóng)從基因組中開(kāi)發(fā)微衛(wèi)星困難的問(wèn)題。Yuan等（2014）對(duì)列入世界自然保護(hù)聯(lián)盟（IUCN）名錄中的瀕危物種棘腹蛙（Quasipaa boulengeri）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，成功分離獲得32個(gè)SSR位點(diǎn)，與采用傳統(tǒng)的富集文庫(kù)法開(kāi)發(fā)SSR分子標(biāo)記相比更便利。Hu等（2015）利用高通量測(cè)序技術(shù)從中國(guó)特有植物麻核桃（Juglans hopeiensis）的葉片、花蕾和果實(shí)組織轉(zhuǎn)錄組中開(kāi)發(fā)出25對(duì)多態(tài)性SSR引物，并對(duì)2個(gè)地理種群的植株進(jìn)行遺傳差異分析。Zhao等（2019）從我國(guó)北方常見(jiàn)淡水小型蝦類中華小長(zhǎng)臂蝦（Palaemonetes sinensis）轉(zhuǎn)錄組中檢測(cè)出16對(duì)多態(tài)性SSR引物，進(jìn)而對(duì)7個(gè)地理種群的319尾個(gè)體進(jìn)行遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)研究。此外，章霞等（2019）對(duì)日本帶魚(yú)（T. japanicus）肝臟轉(zhuǎn)錄組SSR特征進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并開(kāi)發(fā)出10對(duì)可于今后多態(tài)性分析和驗(yàn)證的SSR引物?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】傳統(tǒng)的SSR分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)多采用生物信息法、鏈霉親和素磁珠富集法、硝酸纖維素膜雜交法等方式，其開(kāi)發(fā)過(guò)程復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且多態(tài)位點(diǎn)數(shù)量不多，能揭示的遺傳信息十分有限，難以滿足精準(zhǔn)的種群遺傳結(jié)構(gòu)分析和種質(zhì)資源評(píng)估（賈小平等，2009）。因此，亟待通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)大量開(kāi)發(fā)帶魚(yú)SSR分子標(biāo)記，為其資源保護(hù)與利用提供遺傳學(xué)數(shù)據(jù)資料?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】基于Illumina HiSeqTM 2500高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)采自浙江舟山近海的帶魚(yú)樣本肌肉組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，從海量數(shù)據(jù)中查找SSR位點(diǎn)并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以期為科學(xué)制定帶魚(yú)種質(zhì)資源保護(hù)對(duì)策和管理措施提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的10尾帶魚(yú)樣品于2020年3月采自浙江近海的東海帶魚(yú)國(guó)家級(jí)水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)（東經(jīng)123°15′，北緯30°10′）。剪取適量背部肌肉裝入含RNAhold保存液（北京全式金生物技術(shù)股份有限公司）的2 mL凍存管（美國(guó)Corning公司）中，置于-80 ℃超低溫冰箱中冷凍保存。

1. 2 RNA提取及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

采用常規(guī)TRIzol法提取總RNA（美國(guó)Invitrogen公司），使用Agilent 2100（美國(guó)Agilent公司）和NanoDrop 2000（美國(guó)Thermo Fisher公司）檢測(cè)RNA濃度和純度。合格的RNA樣品送至生工生物工程（上海）股份有限公司構(gòu)建cDNA混合文庫(kù)，然后基于Illumina HiSeqTM 2500平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。測(cè)序獲得的帶魚(yú)肌肉組織轉(zhuǎn)錄組Raw reads經(jīng)FastQC和Trimmomatic進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估和剪切，去除接頭、樣品標(biāo)識(shí)序列、低質(zhì)量的Reads及帶N堿基較多的Reads，以獲取高質(zhì)量的Clean reads（Bolger et al.，2014）。FF6A4387-7446-4F61-9047-3F7726652A6C

1. 3 數(shù)據(jù)拼接組裝及SSR位點(diǎn)篩選和統(tǒng)計(jì)

使用Trinity對(duì)Clean reads進(jìn)行De nove組裝以獲得轉(zhuǎn)錄本（Transcript），參數(shù)設(shè)為“min_kmer_cov 2”，其余默認(rèn)（Haas et al.，2013），去冗余后取每個(gè)轉(zhuǎn)錄本聚類中最長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本作為Unigenes用于后續(xù)分析。以Micro-Satellite（MISA）對(duì)帶魚(yú)Unigenes中潛在的SSR進(jìn)行搜索（Beier et al.，2017），篩選條件參數(shù)設(shè)為：基元長(zhǎng)度1～6 bp，單核苷酸重復(fù)次數(shù)不小于10次，二核苷酸重復(fù)次數(shù)大于6次，三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重復(fù)次數(shù)至少5次。若2個(gè)SSR間的距離小于100 bp，則記為1個(gè)復(fù)合微衛(wèi)星。使用Excel 2010統(tǒng)計(jì)并計(jì)算SSR的數(shù)目、發(fā)生頻率、出現(xiàn)頻率、分布距離與密度、重復(fù)基元類別及重復(fù)區(qū)段長(zhǎng)度等信息。具體統(tǒng)計(jì)公式如下：

SSR發(fā)生頻率（%）=含SSR的Unigenes總數(shù)/Unigenes總數(shù)×100

SSR相對(duì)豐度（個(gè)/Mb）=篩選獲得的SSR總數(shù)/Unigenes總長(zhǎng)度

SSR平均距離（bp）=Unigenes總長(zhǎng)度/篩選獲得的SSR總數(shù)

SSR出現(xiàn)頻率（%）=檢測(cè)所得SSR總數(shù)/Unigenes總數(shù)×100

2 結(jié)果與分析

2. 1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、拼接及組裝結(jié)果

基于Illumina HiSeqTM 2500平臺(tái)測(cè)序共獲得41886302條Raw reads，經(jīng)質(zhì)控后得到40424018條Raw reads，共計(jì)5643766129個(gè)核苷酸，平均為139.61 bp。GC含量為50.62%，N堿基數(shù)量為888823個(gè)，所占比例僅為0.02%。Q10、Q20和Q30分別為99.60%、98.15%和92.34%（表1），以上數(shù)據(jù)表明獲得的測(cè)序結(jié)果較好。

經(jīng)Trinity從頭組裝獲得70113條Transcripts，去冗余后得到50482條Unigenes，總長(zhǎng)度為33886190 bp，平均長(zhǎng)度為671.25 bp。N50和N90（累加轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度為不小于總長(zhǎng)50%或90%的拼接轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度）分別為1078和268 bp，其中最大長(zhǎng)度為29197 bp、最小長(zhǎng)度為201 bp。長(zhǎng)度大于1000 bp的Unigens有8868條，占總Unigenes的17.57%;長(zhǎng)度在500 bp以上的有18216條，占比36.08%（表2）。

2. 2 轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)類型及其分布情況

使用MISA對(duì)總長(zhǎng)33886190 bp的50482條Unigenes進(jìn)行篩選，結(jié)果共發(fā)現(xiàn)18873個(gè)SSR位點(diǎn)，且這些SSR位點(diǎn)僅分布在其中的13082條Unigenes上，發(fā)生頻率為25.91%，出現(xiàn)頻率為37.39%。將這些SSR位點(diǎn)按核苷酸重復(fù)類型進(jìn)行分類，可分為單核苷酸重復(fù)、二核苷酸重復(fù)、三核苷酸重復(fù)、四核苷酸重復(fù)、五核苷酸重復(fù)和六核苷酸重復(fù)6種類型。其中，以單核苷酸重復(fù)SSR數(shù)最多，有10763個(gè)，存在于8252條Unigenes上，出現(xiàn)頻率最高（21.32%）;然后依次是二核苷酸重復(fù)、三核苷酸重復(fù)、四核苷酸重復(fù)、六核苷酸重復(fù)和五核苷酸重復(fù)SSR，出現(xiàn)頻率分別為7.01%、4.05%、0.22%、0.04%和0.03%。SSR位點(diǎn)相對(duì)豐度排序?yàn)閱魏塑账嶂貜?fù)（317.62個(gè)/Mb）>二核苷酸重復(fù)（104.44個(gè)/Mb）>三核苷酸重復(fù)（60.32個(gè)/Mb）>四堿基重復(fù)（3.25個(gè)/Mb）>六核苷酸重復(fù)（0.59個(gè)/Mb）>五核苷酸重復(fù)（0.38個(gè)/Mb）;SSR平均長(zhǎng)度以六核苷酸重復(fù)最長(zhǎng)，為37.50 bp，然后依次為五核苷酸重復(fù)（34.60 bp）、四核苷酸重復(fù)（24.73 bp）、二核苷酸重復(fù)（20.55 bp）、三核苷酸重復(fù)（18.41 bp）和單核苷酸重復(fù)（13.14 bp）（表3）。此外，以復(fù)合形式存在的SSR位點(diǎn)有2384個(gè)，出現(xiàn)頻率為4.72%。

2. 3 轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)基元類型

帶魚(yú)肌肉組織轉(zhuǎn)錄組SSR中共檢測(cè)出173種重復(fù)基元，其中以四核苷酸重復(fù)基元種類最多，有66種，然后依次為三核苷酸重復(fù)（58種）、六核苷酸重復(fù)（20種）、五核苷酸重復(fù)（13種）和二核苷酸重復(fù)（12種），單核苷酸重復(fù)因?yàn)槭軌A基數(shù)量的限制，重復(fù)基元種類最少（僅4種）。在66種四核苷酸重復(fù)基元類型中，數(shù)量和分布特征變化較小，SSR的優(yōu)勢(shì)重復(fù)基元為AAAC、ATGG、ATGT、CTGT、CTTT和 TCCA等6種。在重復(fù)基元中，單核苷酸重復(fù)依舊在數(shù)量上占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，其中A、T堿基重復(fù)基元占單核苷酸重復(fù)SSR位點(diǎn)數(shù)量的94.50%;相對(duì)而言，五核苷酸重復(fù)和六核苷酸重復(fù)的基元類型與數(shù)量分布均較少。

從不同重復(fù)基元類型的含量（表4）來(lái)看，單核苷酸重復(fù)中以A堿基數(shù)量最多，有5167個(gè)（占48.09%），而C堿基數(shù)量最少，為251個(gè)（僅占2.33%）;二核苷酸重復(fù)基元以TG為主，有692個(gè)（占19.55%），其次是GT（19.02%）、AC（17.77%）和CA（15.91%）等3種重復(fù)基元，而CG和GC的數(shù)量分別只有4和5個(gè);在三核苷酸重復(fù)基元中，所占比例最高的是GAG，有206個(gè)（占10.08%），其次是TCC（5.19%）、CAG（4.55%）、CCT（4.40%）和GGA（4.31%），而CGA的數(shù)量?jī)H有2個(gè)（占0.10%）;四核苷酸重復(fù)基元出現(xiàn)頻率較高的有AAAC（3.63%）、ATGG（3.63%）、ATGT（3.63%）、CTGT（3.63%）和TCCA（3.64%）;五核苷酸重復(fù)和六核苷酸重復(fù)的基元類型數(shù)量分布較均勻，無(wú)明顯的優(yōu)勢(shì)重復(fù)基元（圖1）。

在帶魚(yú)肉組織轉(zhuǎn)錄組SSR中，以10次重復(fù)的SSR數(shù)量最多，達(dá)3659個(gè)，占SSR總數(shù)的19.39%;其次是11、12、6和5次重復(fù)，SSR數(shù)量在1000～2300個(gè)，約占總SSR數(shù)目的52.27%。其中，單核苷酸重復(fù)次數(shù)分布在10～50次，主要集中在10～25次，占單核苷酸重復(fù)總數(shù)的97.71%;二核苷酸重復(fù)次數(shù)分布在6～42次，且主要集中在6～12次，共2887個(gè)，占該類型核苷酸重復(fù)總數(shù)的81.58%;三核苷酸重復(fù)次數(shù)分布在5～22次，其中2～8次重復(fù)占三核苷酸重復(fù)總數(shù)的93.74%;四核苷酸重復(fù)次數(shù)分布在5～24次，其中5～6次重復(fù)占四核苷酸重復(fù)總數(shù)的85.45%;五核苷酸重復(fù)、六核苷酸重復(fù)次數(shù)均在15次以內(nèi)，以5～10次居多（表5）。FF6A4387-7446-4F61-9047-3F7726652A6C

綜上所述，SSR基元重復(fù)次數(shù)主要分布在5～6次和10～12次，共9864個(gè)，占SSR總數(shù)的52.27%;其次是7～9次和13～20次，共5772個(gè)，占SSR總數(shù)30.58%;重復(fù)次數(shù)大于25次的SSR相對(duì)較少，主要由單核苷酸和二核苷酸重復(fù)基元組成，共342個(gè)，占SSR總數(shù)的1.81%，且單核苷酸和二核苷酸基元無(wú)重復(fù)5次的相關(guān)數(shù)據(jù)。此外，SSR基元重復(fù)次數(shù)增至10次后，隨著重復(fù)次數(shù)的增加SSR數(shù)量依次遞減，而單核苷酸重復(fù)所占的比例逐漸增加。

2. 4 轉(zhuǎn)錄組SSR長(zhǎng)度分布及多態(tài)性評(píng)價(jià)結(jié)果

帶魚(yú)肌肉組織SSR序列長(zhǎng)度區(qū)間跨度較大，范圍在10～96 bp。其中，六核苷酸重復(fù)SSR長(zhǎng)度變化最小，在30～60 bp;二核苷酸重復(fù)SSR長(zhǎng)度變化范圍最大，為12～84 bp。單核苷酸重復(fù)、三核苷酸重復(fù)、四核苷酸重復(fù)、五核苷酸重復(fù)的SSR長(zhǎng)度范圍分別為10～51 bp、15～66 bp、20～96 bp和25～65 bp。根據(jù)SSR長(zhǎng)度可為兩大類：第一類是重復(fù)序列長(zhǎng)度在20 bp及其以上的高度多態(tài)性I型，第二類是重復(fù)序列長(zhǎng)度在12～20 bp的中度多態(tài)性II型（Wang et al.，2010）。本研究中，I型SSR僅2558條，約占SSR總數(shù)的18%;II型SSR共8663條，約占SSR總數(shù)的50%（圖2）。

3 討論

充分了解和掌握漁業(yè)對(duì)象的生物學(xué)特征和遺傳學(xué)背景，是開(kāi)展?jié)O業(yè)資源科學(xué)管理及可持續(xù)開(kāi)發(fā)利用的前提（Ward，2020）。帶魚(yú)作為我國(guó)重要的海洋經(jīng)濟(jì)魚(yú)類，線粒體和SSR分子標(biāo)記仍是其種群遺傳學(xué)研究的主要手段。已報(bào)道的帶魚(yú)SSR分子標(biāo)記篩選方法主要有鏈霉素磁珠捕獲法和富集文庫(kù)法，但這2種方法不僅耗時(shí)長(zhǎng)、花費(fèi)高，開(kāi)發(fā)的SSR分子標(biāo)記數(shù)量還十分有限。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和測(cè)序成本的降低，基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)大量開(kāi)發(fā)具有高多態(tài)性的帶魚(yú)SSR位點(diǎn)變得更加高效、便捷。本研究對(duì)采自浙江舟山近海的帶魚(yú)肌肉組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序，使用SSR識(shí)別工具M(jìn)ISA在50482條Unigenes中搜索出18873個(gè)SSR位點(diǎn)，出現(xiàn)頻率為37.39%，與其他海洋魚(yú)類轉(zhuǎn)錄組中SSR的出現(xiàn)頻率相比，高于牙鲆（Paralichthys olivaceus，27.12%）（李超等，2015）、刀鱭（Coilia nasus，8.76%）（Fang et al.，2015）、銀鯧（Pampus argenteus，2.62%）（劉磊等，2016）和龍頭魚(yú)（Harpadon nehereus，18.99%）（黃新芯等，2021），但略低于黃姑魚(yú)（Nibea albiflora，39.30%）（龔詩(shī)琦等，2016），說(shuō)明帶魚(yú)屬于轉(zhuǎn)錄組中SSR數(shù)量較豐富的魚(yú)類，帶魚(yú)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量和SSR含量均處于較高水平，能為后續(xù)群體遺傳學(xué)研究提供充足的序列資源。相對(duì)于帶魚(yú)肝臟轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中的發(fā)生頻率（40.95%）（章霞等，2019），本研究所得的數(shù)據(jù)略低，且與肝臟中單核苷酸重復(fù)～六核苷酸重復(fù)SSR的出現(xiàn)頻率（53.79%、30.63%、14.34%、1.12%、0.08%和0.03%）相比也偏低。此外，帶魚(yú)肝臟轉(zhuǎn)錄組SSR中單核苷酸和二核苷酸在重復(fù)次數(shù)分別達(dá)23和11次時(shí)突然增加，而在肌肉組織中單核苷酸重復(fù)～六核苷酸重復(fù)的出現(xiàn)次數(shù)隨著重復(fù)次數(shù)的增加依次遞減，并無(wú)突增現(xiàn)象，究其原因可能與選擇的組織不同有一定關(guān)系，但不排除測(cè)序平臺(tái)及檢索參數(shù)設(shè)置不同帶來(lái)的影響。

相對(duì)于序列長(zhǎng)度長(zhǎng)且重復(fù)性低的串聯(lián)重復(fù)單元，序列長(zhǎng)度短且重復(fù)性高的串聯(lián)重復(fù)單元?jiǎng)t表現(xiàn)出更高的突變率，其多態(tài)性比例也較高（Kelkar et al.，2008），但重復(fù)序列長(zhǎng)度小于12 bp時(shí)SSR多態(tài)性反而降低，因此，長(zhǎng)度在20 bp及其以上的I型SSR和長(zhǎng)度在12～20 bp的II型SSR是可用性較高的潛在分子標(biāo)記（Temnykh et al.，2001）。從核苷酸重復(fù)次數(shù)來(lái)看，本研究中帶魚(yú)肌肉組織SSR核苷酸重復(fù)次數(shù)在5～50次，剔除易發(fā)生錯(cuò)配的單核苷酸重復(fù)類型，重復(fù)數(shù)最高可達(dá)50次。從SSR長(zhǎng)度來(lái)看，重復(fù)長(zhǎng)度在12～20 bp的SSR為2558個(gè)，重復(fù)長(zhǎng)度大于20 bp的SSR有8663個(gè)，即超過(guò)75%的SSR具有中度及以上水平的多樣性?？梢?jiàn)，帶魚(yú)肌肉轉(zhuǎn)錄組SSR可用性高且具有較高的多態(tài)性潛能，在此基礎(chǔ)上可有針對(duì)性進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，為帶魚(yú)的種質(zhì)鑒定、遺傳差異檢測(cè)及功能基因定位等研究提供理論依據(jù)和實(shí)踐基礎(chǔ)。

二核苷酸重復(fù)是帶魚(yú)基因組SSR的主要類型（張浩冉等，2019），而本研究發(fā)現(xiàn)帶魚(yú)肌肉組織轉(zhuǎn)錄組中的SSR重復(fù)類型以單核苷酸重復(fù)為主。已有研究表明，二核苷酸重復(fù)類型的SSR主要位于非編碼區(qū)（虞杭等，2018）。由于簡(jiǎn)化基因組測(cè)序是采取對(duì)基因組特定區(qū)域進(jìn)行測(cè)序以反映物種全基因組信息的策略，能檢測(cè)到廣泛分布于編碼區(qū)、非編碼區(qū)和調(diào)控區(qū)的SSR位點(diǎn)信息，而真核生物在轉(zhuǎn)錄本RNA加工過(guò)程中會(huì)對(duì)內(nèi)含子進(jìn)行剪切，丟失部分非編碼區(qū)序列信息。因此，在依托轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)的SSR中其主導(dǎo)重復(fù)類型和重復(fù)數(shù)量存在一定差異。考慮到基因組信息有助于轉(zhuǎn)錄組注釋，而轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)也可對(duì)基因組序列進(jìn)行補(bǔ)充和校正，在今后開(kāi)展帶魚(yú)遺傳多樣性分析時(shí)可將這2種技術(shù)手段結(jié)合起來(lái)，為分子標(biāo)記的挖掘和應(yīng)用提供更全面的參考信息。Harr和Schl?tterer（2000）對(duì)黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）基因組SSR結(jié)構(gòu)和組成的研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)雜的多基元重復(fù)SSR出現(xiàn)頻率較高，通常暗示著物種進(jìn)化水平較低或具有較低的變異頻率。在本研究中，帶魚(yú)肌肉組織轉(zhuǎn)錄組中低級(jí)重復(fù)基元（單核苷酸重復(fù)～三核苷酸重復(fù)）約占SSR總數(shù)的86.61%，出現(xiàn)頻率也較高（32.38%），而高級(jí)重復(fù)基元SSR的多態(tài)性相對(duì)較低，表明帶魚(yú)可能具有較長(zhǎng)的進(jìn)化歷史，且積累了較多的遺傳變異。

4 結(jié)論

經(jīng)高通量測(cè)序獲得的帶魚(yú)肌肉轉(zhuǎn)錄組SSR可用性高且具有較高的多態(tài)性潛能，在此基礎(chǔ)上可有針對(duì)性進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，為帶魚(yú)遺傳多樣性評(píng)價(jià)、遺傳結(jié)構(gòu)分析及功能基因克隆等研究提供有效的分子標(biāo)記，進(jìn)而為其種質(zhì)資源的保護(hù)與利用提供遺傳學(xué)數(shù)據(jù)資料。FF6A4387-7446-4F61-9047-3F7726652A6C

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）FF6A4387-7446-4F61-9047-3F7726652A6C