水稻幼苗響應(yīng)褐飛虱和稻癭蚊的轉(zhuǎn)錄組分析

盧柏亦　蔣哲　鄢柳慧　鐘小惠　李晶瑩　黃福鋼　李發(fā)活　莫德原　邱永福

摘要：【目的】篩選出同時(shí)響應(yīng)褐飛虱和稻癭蚊取食的基因，揭示水稻幼苗應(yīng)對(duì)2種害蟲時(shí)基因表達(dá)層面的差異，為后續(xù)挖掘廣譜抗蟲基因和解析水稻抗蟲機(jī)制打下理論基礎(chǔ)?！痉椒ā恳运酒贩N9311為供試植物，分別對(duì)15日齡的水稻幼苗進(jìn)行褐飛虱和稻癭蚊接蟲處理，觀測(cè)幼苗表型，并通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分別對(duì)褐飛虱接入后24 h和稻癭蚊接入后7 d的水稻幼苗進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。以水稻日本晴基因組作為參考基因組進(jìn)行對(duì)比，利用FPKM法計(jì)算基因表達(dá)量，設(shè)定參數(shù)（|log₂FC|>1且P<0.05）篩選差異表達(dá)基因。結(jié)合基因差異表達(dá)分析和功能富集分析，研究水稻響應(yīng)2種害蟲的機(jī)制異同點(diǎn)。【結(jié)果】鑒定出響應(yīng)褐飛虱取食的差異表達(dá)基因3963個(gè)，響應(yīng)稻癭蚊取食的差異表達(dá)基因1206個(gè)，有251個(gè)差異表達(dá)基因同時(shí)響應(yīng)2種害蟲，其中108個(gè)具有相同表達(dá)模式，143個(gè)具有相反表達(dá)模式。GO功能注釋分析表明，褐飛虱取食顯著影響植物體內(nèi)細(xì)胞壁合成和缺水響應(yīng)，而稻癭蚊取食則對(duì)植物光合作用的影響更顯著，具有相同表達(dá)模式的差異表達(dá)基因主要富集在光合作用、水楊酸合成、茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和傷害響應(yīng)等生物學(xué)功能，而具有相反表達(dá)模式的差異表達(dá)基因僅富集在乙醛酸循環(huán)。KEGG信號(hào)通路富集分析表明，褐飛虱和稻癭蚊取食均顯著影響植物體內(nèi)次生代謝物的合成，相同表達(dá)模式的差異表達(dá)基因富集到MAPK信號(hào)通路、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及光合作用等6個(gè)通路，而相反表達(dá)模式的差異表達(dá)基因沒有富集的通路?！窘Y(jié)論】水稻應(yīng)對(duì)褐飛虱和稻癭蚊的基因表達(dá)調(diào)控存在相同點(diǎn)和不同之處，共響應(yīng)2種害蟲的調(diào)控通路可能在水稻抗蟲過程中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞： 水稻;褐飛虱;稻癭蚊;轉(zhuǎn)錄組

中圖分類號(hào)： S435.112? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2022）03-0628-13

Transcriptome analysis of rice seedlings responding to brown planthopper infestation and to gall midge infestation

LU Bai-yi， JIANG Zhe， YAN Liu-hui， ZHONG Xiao-hui， LI Jing-ying，

HUANG Fu-gang， LI Fa-huo， MO De-yuan， QIU Yong-fu

（College of Agriculture， Guangxi University/State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical

Agro-bioresources， Nanning， Guangxi? 530004， China）

Abstract：【Objective】To screen out the functional genes that respond to both brown planthopper （BPH） infestation and rice gall midge （GM） infestation and reveal the difference of gene expression level in rice seedlings responding to the two pests， so as to provide theoretical basis for new broad-spectrum resistance and rice anti-insect mechanism. 【Method】Rice 9311 was the tested rice variety. Fifteen-day-old seedlings were treated with BPH and GM respectively to observe seedling phenotypes and to sample for transcriptome which sequence was performed on rice seedlings that were collected 24 hours after BPH infestation and 7 days after GM infestation， respectively. Taking the genome of Nipponbare （MSU7） as a reference to align the sequences， the differentially expressed genes （DEGs） were screened by calculating the gene expression level in Fragments Per Kilobase per Million （FPKM）， with （|log₂FC|≥1 and P≤0.05） as the parameter. Through gene differential expression analysis and functional enrichment analysis， the similarities and differences of rice response mechanisms to the two pests were identified. 【Result】The results showed that 3963 genes were differentially expressed in BPH infestation and 1206 genes were differentially expressed in GM infestation. And 251 genes were found responsive to both pests， of which 108 genes with the same expression pattern and 143 genes with opposite expression patterns. GO enrichment analysis showed that：BPH infestation significantly influenced the cell wall biogenesis and the response to water deprivation in rice seedlings; seedlings of GM infestation enriched GO terms were mostly chloroplast or photosynthesis-related; the DEGs with the same expression patterns of two pest stresses were enriched to some biological processes such as photosynthesis， salicylic acid biosynthetic process， regulation of jasmonic acid mediated signaling pathway and response to wounding; whereas the DEGs with the opposite expression patterns of two pest stresses were enriched to glyoxy-late cycle only. KEGG enrichment analysis indicated that：Both BPH infestation and GM infestationsignificantly affected the biosynthesis of secondary metabolites in seedlings; the DEGs with the same expression patterns in both treatments were enriched into six pathways mainly involved in MAPK signaling pathway， plant hormone signal transduction pathway， photosynthesis pathway; while no significant KEGG pathway was enriched in the DEGs with opposite expression patterns. 【Conclusion】These results suggest that the common pathways in two pest infestations probably play an important role in rice resistance while similarities and differences exist in the regulations of gene expression between BPH infestation and GM infestation.C3EF4567-7C12-48BB-84A9-C29F2CF52217

Key words： rice; brown planthopper; gall midge; transcriptome

Foundation items： Guangxi Natural Science Foundation （2020GXNSFDA297008）

0 引言

【研究意義】水稻是我國(guó)主要糧食作物，在第一次綠色革命后，水稻由高稈向矮稈轉(zhuǎn)變，對(duì)水稻危害嚴(yán)重的害蟲種類也發(fā)生了明顯變化，且害蟲種類不斷增多，蟲災(zāi)日益頻繁（嚴(yán)火其，2021）。褐飛虱（Brown planthopper，BPH）和稻癭蚊（Gall midge，GM）是我國(guó)南方災(zāi)害性害蟲，因危害方式（褐飛虱通過刺吸，稻癭蚊通過咀嚼）和危害部位的差異（Li et al.，2020;Shi et al.，2021），水稻對(duì)這2種害蟲的防御機(jī)制也有所不同，只有極少數(shù)水稻品種可兼顧對(duì)2種害蟲的抗性。因此，做好有效的防治，實(shí)現(xiàn)對(duì)褐飛虱和稻癭蚊災(zāi)害發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的有力控制具有重要意義，而防治2種害蟲最科學(xué)、安全的手段是挖掘和利用內(nèi)源性廣譜抗蟲基因（楊利艷等，2020;嚴(yán)火其，2021），并以此培育抗蟲品種，從而減少災(zāi)害損失和農(nóng)藥的施用。【前人研究進(jìn)展】在褐飛虱和稻癭蚊雙抗材料研究方面，已報(bào)道并進(jìn)行遺傳分析的雙抗水稻品種有：江潮、RP^{1976-18-6-4-2}和ARC5833（黃鳳寬等，2006;吳碧球等，2014;秦學(xué)毅等，2016;鄢柳慧等，2020）。RP^{1976-18-6-4-2}對(duì)褐飛虱和稻癭蚊的抗性評(píng)價(jià)為抗，由1對(duì)顯性基因和1對(duì)隱性基因控制對(duì)褐飛虱的抗性，由1對(duì)顯性基因控制對(duì)稻癭蚊的抗性（黃鳳寬等，2006）。江潮對(duì)2種害蟲均表現(xiàn)為高抗，是由1對(duì)顯性基因控制對(duì)稻癭蚊的抗性、1對(duì)隱性基因控制對(duì)褐飛虱的抗性，2個(gè)基因間獨(dú)立遺傳（秦學(xué)毅等，2016）。ARC5833與江潮的抗性表現(xiàn)一致，對(duì)2種害蟲表現(xiàn)為高抗，但在抗性基因的遺傳上比江潮復(fù)雜。ARC5833對(duì)褐飛虱的抗性由單一顯性基因控制，對(duì)稻癭蚊中國(guó)II型由1對(duì)顯性基因和1對(duì)隱性基因控制，而對(duì)稻癭蚊中國(guó)IV型則由1對(duì)顯性基因控制（吳碧球等，2014;鄢柳慧等，2020）。已發(fā)現(xiàn)的3個(gè)雙抗褐飛虱和稻癭蚊水稻品種對(duì)2種害蟲的控制基因?yàn)榉珠_獨(dú)立遺傳，增加了后期基因鑒定、抗蟲機(jī)制解析及利用的復(fù)雜程度。在水稻抗蟲機(jī)制研究方面，組學(xué)研究（主要包括轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和代謝組等）作為了解植物對(duì)昆蟲取食反應(yīng)的重要技術(shù)途徑之一，已有大量的組學(xué)研究揭示水稻幼苗響應(yīng)褐飛虱取食的機(jī)制，卻很少研究水稻對(duì)稻癭蚊的響應(yīng)機(jī)制。代謝組學(xué)相關(guān)的抗蟲研究表明，GABA支路和莽草酸介導(dǎo)的次生代謝途徑對(duì)水稻抗褐飛虱具有重要作用（Liu et al.，2010），而脂肪酸及其衍生物、氨基酸及次生代謝物則在水稻抗稻癭蚊中發(fā)揮重要作用（陳燦等，2021）。利用抗蟲激素組學(xué)對(duì)Bph6和Bph9的9311背景的近等基因系（NIL-Bph6和NIL-Bph9，以9311為背景材料）以及對(duì)照9311為材料進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在褐飛虱取食過程中2個(gè)近等基因系的SA、JA和JA-Ile上調(diào)顯著且響應(yīng)速度快，而感性品種9311則激素水平變化小且反應(yīng)時(shí)間滯后（Zhao et al.，2016;杜波等，2018;Guo et al.，2018）。通過轉(zhuǎn)錄組技術(shù)測(cè)定褐飛虱取食48 h后的水稻幼苗基因表達(dá)變化，揭示了褐飛虱取食能激發(fā)水稻的應(yīng)激反應(yīng)和保護(hù)機(jī)制，同時(shí)降低營(yíng)養(yǎng)合成的過程，解釋了褐飛虱為害造成水稻減產(chǎn)的原因（曹征鴻等，2020）。在水稻抗蟲基因挖掘方面，已有研究利用抑制消減雜交技術(shù)（SSH）通過篩選差異表達(dá)基因，鑒定出OsERF3、OsWRKY70和OsHI-LOX等對(duì)水稻褐飛虱和二化螟抗性均具有顯著影響的基因，這3個(gè)基因均能增強(qiáng)水稻對(duì)二化螟的抗性，而降低水稻對(duì)褐飛虱的抗性，在植株內(nèi)表現(xiàn)出相反的調(diào)節(jié)模式（Zhou et al.，2009;Lu et al.，2011;Li et al.，2015）。OsERF3、OsWRKY70和OsHI-LOX等基因的研究結(jié)果說明，通過組學(xué)研究可篩選出具有調(diào)控水稻對(duì)刺吸式昆蟲和咀嚼式昆蟲抗性的基因，實(shí)現(xiàn)單一基因調(diào)控水稻對(duì)不同種類昆蟲的抗性具有可行性?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，關(guān)于單一基因控制水稻共調(diào)控褐飛虱和稻癭蚊的抗性機(jī)理研究尚無文獻(xiàn)報(bào)道，系統(tǒng)揭示水稻響應(yīng)刺吸式昆蟲和咀嚼式昆蟲取食間的組學(xué)差異研究也鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過研究水稻在褐飛虱和稻癭蚊脅迫下的轉(zhuǎn)錄水平變化，比較2種脅迫下差異表達(dá)基因的功能異同，獲得水稻對(duì)2種害蟲取食共響應(yīng)的基因，明確篩選出雙抗基因的可行性，為后續(xù)挖掘廣譜抗蟲基因和解析水稻抗蟲機(jī)制打下理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

1. 1. 1 供試植物 供試水稻品種為9311，于溫室培育。溫室條件：溫度（26±2）℃，光周期 L∶D=16 h∶8 h，相對(duì)濕度（75±5）%。

1. 1. 2 供試害蟲 供試褐飛虱采自廣西南寧市廣西大學(xué)，供試稻癭蚊收集自廣西崇左市大新縣，2種害蟲均在溫室的9311植株上繁殖多代。

1. 2 樣品處理

在褐飛虱取食處理中，每杯（口徑10 cm，深度16 cm）種植10株水稻幼苗，15日苗齡接入褐飛虱2～3齡若蟲，每株苗8頭蟲，即每杯接入80頭蟲。在稻癭蚊取食處理中，每杯種植8株稻苗，15日苗齡接入稻癭蚊成蟲，每杯苗接入4頭蟲。

1. 3 表型獲取

加入褐飛虱若蟲后第3 d，用佳能70D相機(jī)拍攝褐飛虱為害后的水稻植株表型;加入稻癭蚊成蟲后第16 d，拍攝稻癭蚊為害后的植株表型。用小米11微距相機(jī)拍攝取食中的褐飛虱表型，用體式顯微鏡拍攝取食中的稻癭蚊表型。

1. 4 測(cè)序樣品采集

接入褐飛虱2～3齡若蟲后昆蟲立即取食，24 h可觀測(cè)到苗尖輕微萎蔫癥狀，72 h可觀測(cè)到稻苗完全干枯，因此選取24 h作為褐飛虱處理的取樣時(shí)間點(diǎn)。接入稻癭蚊成蟲后前3 d為產(chǎn)卵孵化期，7 d為蟲體快速增長(zhǎng)期，因此選擇7 d作為稻癭蚊處理的取樣時(shí)間點(diǎn)。褐飛虱取食24 h后，取出水稻，剪取莖稈組織即褐飛虱取食部位作為轉(zhuǎn)錄組測(cè)序樣品存于液氮中。接入稻癭蚊后第7 d，取出水稻，剪取靠近根部的莖稈組織即稻癭蚊取食部位存于液氮中。褐飛虱和稻癭蚊處理各設(shè)1個(gè)對(duì)照組，對(duì)照組不做任何處理，各處理設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，總計(jì)12個(gè)。C3EF4567-7C12-48BB-84A9-C29F2CF52217

1. 5 RNA處理與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

采用TRIzol法提取水稻樣品總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和微量分光光度計(jì)（NanoDrop 2000）檢測(cè)樣品合格后用于cDNA文庫構(gòu)建。利用PicoGreen和熒光分光光度計(jì)方法定量文庫[雙鏈DNA（dsDNA）定量檢測(cè)試劑盒Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit購自Invitrogen公司;熒光分光光度計(jì)Quantifluor-ST fluorometer購自Promega公司]。使用Agilent 2100生物分析儀（購自Agilent公司，并搭配使用與其配套的DNA試劑盒Agilent High Sensitivity DNA Kit運(yùn)行DNA樣品分析）對(duì)PCR富集片段進(jìn)行質(zhì)量控制，驗(yàn)證DNA文庫的片段大小及分布。將合格樣品分別稀釋至10 nmol/L后，逐步稀釋定量至4～5 nmol/L進(jìn)行上機(jī)測(cè)序，采用Illumina HiSeqTM 2000平臺(tái)完成轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。建庫和測(cè)序均由上海派森諾生物科技有限公司完成。

1. 6 差異基因表達(dá)分析

測(cè)序原始數(shù)據(jù)序列經(jīng)質(zhì)量分析去除低質(zhì)量序列和接頭序列后，得到可供進(jìn)行后續(xù)分析的序列。因9311基因組序列組裝質(zhì)量不如日本晴，因此選用水稻基因組注釋數(shù)據(jù)庫（http：//rice.uga.edu/，日本晴基因組）作為參照基因組，使用HTSeq統(tǒng)計(jì)比對(duì)到每個(gè)基因上的Read count值，作為基因原始表達(dá)量，然后采用FPKM對(duì)表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。采用DESeq對(duì)基因表達(dá)量進(jìn)行差異分析，差異表達(dá)基因（Differentially expressed genes，DEGs）篩選條件為：|log2 FC|>1且P<0.05。

1. 7 GO功能注釋和KEGG信號(hào)通路富集分析

使用基迪奧云平臺(tái)對(duì)差異基因進(jìn)行數(shù)據(jù)分析（https：//www.omicshare.com/）。差異表達(dá)基因的GO功能注釋分析和KEGG信號(hào)通路富集分析分別通過云平臺(tái)的動(dòng)態(tài)GO功能注釋分析云工具和動(dòng)態(tài)KEGG信號(hào)通路富集分析云工具完成。

1. 8 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可視化

使用基迪奧云平臺(tái)對(duì)差異基因進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化（https：//www.omicshare.com/）：差異表達(dá)基因數(shù)量的可視化由柱狀圖和維恩圖云工具完成;GO功能注釋分析和KEGG信號(hào)通路富集分析可視化由動(dòng)態(tài)富集差異氣泡圖和動(dòng)態(tài)富集條形圖云工具完成;差異表達(dá)基因表達(dá)量可視化由動(dòng)態(tài)熱圖云工具完成。

2 結(jié)果與分析

2. 1 褐飛虱和稻癭蚊取食對(duì)9311幼苗的影響

2種害蟲取食對(duì)9311水稻品種幼苗產(chǎn)生的影響不同。接入褐飛虱3 d后，幼苗表現(xiàn)枯死癥狀（圖1-A）;圖1-B和圖1-C展示在水稻莖稈外部吸食汁液的褐飛虱若蟲。稻癭蚊對(duì)稻苗的為害特點(diǎn)為生長(zhǎng)點(diǎn)基部膨大，15 d左右可明顯觀察到稻癭蚊取食后水稻頂葉轉(zhuǎn)變?yōu)槭[管（圖1-D）;圖1-E和圖1-F分別展示接入稻癭蚊成蟲16和7 d后正在水稻蔥管內(nèi)取食的稻癭蚊若蟲。

2. 2 差異表達(dá)基因分析結(jié)果

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共設(shè)12個(gè)樣本，包括褐飛虱處理組、褐飛虱處理的對(duì)照組、稻癭蚊處理組和稻癭蚊處理的對(duì)照組，各3個(gè)樣本。從整體上看，每個(gè)樣本最后得到4000萬～4700萬條Reads，Q30為93%～96%。過濾后得到的高質(zhì)量數(shù)據(jù)比對(duì)參考基因組，樣本中有83%～87%的測(cè)序序列可定位到參考序列上。表明整體測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量良好，數(shù)據(jù)可用于進(jìn)一步的轉(zhuǎn)錄組分析。

經(jīng)過褐飛虱處理，共有3963個(gè)基因表達(dá)發(fā)生明顯變化，其中有1518個(gè)基因上調(diào)，2445個(gè)基因下調(diào)。而稻癭蚊處理下僅發(fā)現(xiàn)1206個(gè)差異表達(dá)基因，其中461個(gè)基因上調(diào)，745個(gè)基因下調(diào)（圖2-A）。共有251個(gè)差異表達(dá)基因在2種害蟲取食后表達(dá)量均發(fā)生明顯變化，在251個(gè)基因中有55個(gè)基因在2種處理中表達(dá)量均上調(diào);53個(gè)基因在2種處理中均下調(diào);91個(gè)基因在褐飛虱處理中表達(dá)上調(diào)、在稻癭蚊處理中表達(dá)下調(diào);52個(gè)基因在褐飛虱處理中表達(dá)下調(diào)、在稻癭蚊處理中表達(dá)上調(diào)（圖2-B）。即本研究中對(duì)褐飛虱和稻癭蚊具有相同的響應(yīng)模式基因108個(gè)，具有相反響應(yīng)模式基因143個(gè)。

2. 3 差異表達(dá)基因GO功能注釋分析結(jié)果

將差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋分析，發(fā)現(xiàn)響應(yīng)褐飛虱脅迫的基因和響應(yīng)稻癭蚊脅迫的基因在GO功能條目上具有較大差異。響應(yīng)褐飛虱脅迫的基因參與的生物學(xué)過程主要注釋在細(xì)胞壁合成、缺水響應(yīng)、碳水化合物代謝、脂肪酸代謝、酸性化學(xué)物質(zhì)響應(yīng)和激素響應(yīng)，基因的表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞中的定位注釋在細(xì)胞外周和細(xì)胞膜，基因的分子功能注釋于水解酶活性和催化活性（圖3-A）。響應(yīng)稻癭蚊脅迫的差異表達(dá)基因在光合作用和氧化還原等生物過程富集，在類囊體相關(guān)、光合膜、光合系統(tǒng)、葉綠體、質(zhì)體和DNA聚合酶等細(xì)胞組分上富集，在氧化還原活性相關(guān)、四吡咯結(jié)合和輔因子結(jié)合等分子功能富集（圖3-B）。

將2種害蟲的251個(gè)共響應(yīng)差異表達(dá)基因分為2類進(jìn)行GO功能注釋分析，一類是在共響應(yīng)中具有相同響應(yīng)模式的108個(gè)差異表達(dá)基因，另一類是在共響應(yīng)中具有相反響應(yīng)模式的143個(gè)差異表達(dá)基因。具有相同響應(yīng)模式的差異表達(dá)基因在功能條目上主要包括：光合作用、水楊酸合成與代謝、茉莉酸介導(dǎo)的信號(hào)通路、細(xì)胞過程調(diào)節(jié)和傷害響應(yīng)等生物過程;光合系統(tǒng)、光合膜、類囊體、葉綠體和質(zhì)體等細(xì)胞組分（圖4-A）。這些功能條目在整體上與響應(yīng)稻癭蚊脅迫的基因較相似，但在富集程度上也存在一定差異，如響應(yīng)植物激素的基因在相同響應(yīng)模式的基因中比在響應(yīng)稻癭蚊脅迫的基因中更富集（圖4-A）。而在2種害蟲脅迫過程中具有相反響應(yīng)模式的差異表達(dá)基因最主要集中在乙醛酸循環(huán)相關(guān)的生物過程，只有乙醛酸循環(huán)、乙醛酸代謝過程和乙醛酸循環(huán)體3個(gè)生物過程的GO富集P<0.05（圖4-B）。說明較多的生物學(xué)功能在水稻應(yīng)對(duì)2種害蟲時(shí)響應(yīng)模式相似，而響應(yīng)模式相反的生物學(xué)功能較少。C3EF4567-7C12-48BB-84A9-C29F2CF52217

2. 4 差異表達(dá)基因的KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果

對(duì)差異表達(dá)基因前20個(gè)KEGG信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)，在褐飛虱和稻癭蚊脅迫富集基因最多的前3個(gè)通路均為次生代謝物的生物合成、代謝途徑和苯丙素的生物合成。除該3條代謝通路外，在褐飛虱脅迫下基因在以下通路中富集：代謝通路中的脂肪酸合成與代謝、黃酮與類黃酮的生物合成、糖分代謝、酸類代謝及角質(zhì)、木栓質(zhì)和蠟質(zhì)的生物合成等;環(huán)境信息處理通路中的植物激素信號(hào)傳導(dǎo);有機(jī)系統(tǒng)通路上的植物與病原菌互作（圖5-A）。與褐飛虱的響應(yīng)機(jī)制不同，稻癭蚊處理后基因主要參與以下途徑：代謝通路中的光合作用、玉米素合成、氨基酸代謝、亞油酸代謝、各種次生代謝物的生物合成;遺傳信息處理通路中的DNA復(fù)制（圖5-B）。此外，卟啉和葉綠素代謝通路及甘油磷脂代謝通路在2種害蟲取食中的KEGG信號(hào)通路富集均為前20，但這2個(gè)通路的響應(yīng)程度在褐飛虱與稻癭蚊間存在明顯差異，卟啉和葉綠素代謝通路對(duì)稻癭蚊的響應(yīng)程度高于褐飛虱，而甘油磷脂通路對(duì)褐飛虱的響應(yīng)程度高于稻癭蚊，且甘油磷脂通路在稻癭蚊響應(yīng)中不屬于顯著富集，富集程度位于閾值P=0.05之下（圖5-A和圖5-B）。

對(duì)共響應(yīng)基因進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析，發(fā)現(xiàn)在相同響應(yīng)模式的基因中僅有6個(gè)通路表現(xiàn)為富集：MAPK信號(hào)通路、光合作用—天線蛋白、甜菜紅堿生物合成、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、氨基糖和核苷酸糖的代謝及光合作用（圖6-A）。分析發(fā)現(xiàn)在相反響應(yīng)模式的基因中沒有可以被顯著富集到的KEGG通路（圖6-B）。綜上分析表明，在統(tǒng)計(jì)學(xué)角度水稻內(nèi)存在6個(gè)對(duì)2種害蟲均具有一致響應(yīng)模式的通路，無響應(yīng)模式相反的通路。

2. 5 對(duì)2種害蟲具有相同響應(yīng)模式的基因分析結(jié)果

篩選出轉(zhuǎn)錄組中對(duì)2種害蟲有相同響應(yīng)模式的基因，分為共上調(diào)基因和共下調(diào)基因進(jìn)行表達(dá)量可視化及功能注釋。基因的功能注釋由水稻基因組數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站（http：//rice.uga.edu/）獲得。利用log2 FC的值來表示表達(dá)量變化倍數(shù)的高低，上調(diào)為正值，下調(diào)為負(fù)值。由圖5可明顯看出，在共上調(diào)基因中，LOC_Os03g64260和LOC_Os11g47600表達(dá)量增加倍數(shù)顯著高于其他基因，前者被注釋為含AP2結(jié)構(gòu)域的蛋白（AP2 domain containing protein），對(duì)褐飛虱的響應(yīng)程度更高，而后者被注釋為糖苷水解酶（Glycoside hydrolase），對(duì)稻癭蚊的響應(yīng)程度更高。共下調(diào)基因中的LOC_Os10g40520.1被注釋為脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)家族蛋白前體145（LTPL145），在稻癭蚊取食后表達(dá)量顯著下調(diào)，下調(diào)倍數(shù)明顯高于其他共下調(diào)基因。被注釋為表達(dá)蛋白（Expressed protein）的基因無論是在共上調(diào)還是共下調(diào)基因中均數(shù)量最多。除了表達(dá)蛋白，在共上調(diào)基因中數(shù)量較多的還有被注釋為以下蛋白質(zhì)的基因：含有AP2結(jié)構(gòu)域的蛋白（AP2 domain containing protein）、鈣調(diào)素結(jié)合蛋白（Calmodulin binding protein）、糖苷水解酶（Glycoside hydrolase）和含有ZIM結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)（ZIM domain containing protein）（圖7-A）;在下調(diào)基因中注釋為植物脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)家族蛋白前體的基因數(shù)量最多（LTPL145、LTPL20、LTPL52和LTPL66）（圖7-B）。

3 討論

通過分析褐飛虱和稻癭蚊取食后苗期水稻的轉(zhuǎn)錄組情況，篩選得到3963個(gè)褐飛虱取食誘導(dǎo)的差異表達(dá)基因和1206個(gè)稻癭蚊取食誘導(dǎo)的差異表達(dá)基因。響應(yīng)褐飛虱的差異表達(dá)基因數(shù)較稻癭蚊的多1倍以上，可能與稻苗的處理時(shí)長(zhǎng)和傷害水平有關(guān)。褐飛虱處理的幼苗取樣時(shí)間短，僅24 h，而稻癭蚊處理為7 d后取樣，植物擁有更長(zhǎng)的緩沖平衡時(shí)間。不同的取樣時(shí)間點(diǎn)，對(duì)差異基因數(shù)量的獲得具有較大影響，如水稻品種Taichuang Native 1在褐飛虱取食6 h后引起1104個(gè)基因表達(dá)差異，取食48 h后則有2523個(gè)差異表達(dá)基因（曹征鴻等，2020;Liu et al.，2021）。除此之外，褐飛虱對(duì)水稻的傷害比稻癭蚊嚴(yán)重，同時(shí)接入大量的褐飛虱若蟲致使幼苗3 d內(nèi)完全枯死，而稻癭蚊若蟲僅啃食咬小部分組織。因此，褐飛虱取食于水稻而言是突發(fā)的致死性傷害，導(dǎo)致應(yīng)激的基因多于稻癭蚊處理。

GO功能注釋分析表明響應(yīng)褐飛虱取食后差異基因的生物學(xué)功能最顯著富集在細(xì)胞壁合成和缺水響應(yīng)，而稻癭蚊取食后差異基因的生物學(xué)功能最顯著富集在光合作用上。差異基因富集的細(xì)胞定位與生物學(xué)功能具有密切聯(lián)系，如褐飛虱的差異基因富集于細(xì)胞壁和細(xì)胞外周，而響應(yīng)稻癭蚊的差異基因富集在光合作用相關(guān)的細(xì)胞器，如類囊體、葉綠體和質(zhì)體等。究其原因與水稻應(yīng)對(duì)這2種脅迫的特征有關(guān)，褐飛虱是刺吸式昆蟲，吸食水稻汁液導(dǎo)致稻苗缺水枯死，因此引起大量細(xì)胞壁合成相關(guān)基因響應(yīng)和稻苗的缺水反應(yīng)（Zhang et al.，2004）;稻癭蚊的取食則促使水稻發(fā)育形成標(biāo)蔥，影響植株形態(tài)發(fā)育，進(jìn)而影響光合作用。已知的抗褐飛虱基因bph6和bph30被證實(shí)為通過增加細(xì)胞壁硬度和厚壁組織的厚度阻礙褐飛虱取食，前者通過胞泌蛋白調(diào)控細(xì)胞壁的形成，后者則通過上調(diào)薄壁組織纖維素與半纖維素相關(guān)基因增加厚壁組織細(xì)胞壁中纖維素和半纖維素的積累（Guo et al.，2018;Shi et al.，2021）。而水稻對(duì)咀嚼式昆蟲一直缺乏有效的抗性資源，因此涉及的抗蟲機(jī)理存在大量空白。但已有大量研究表明致癭昆蟲普遍削減寄主植物的光合作用，Huang等（2011，2015）通過測(cè)量葉綠素?zé)晒獍l(fā)現(xiàn)紅楠和長(zhǎng)葉木姜子癭蚊誘導(dǎo)的蟲癭部位光合效率顯著低于健康部位。然而也有部分致癭昆蟲對(duì)植物沒有顯著影響或增強(qiáng)光合作用，如橄欖星室木虱和癭蜂（Fay et al.，1993;Malenovsky et al.，2015）。此外，致癭昆蟲在蟲癭內(nèi)完成整個(gè)生活史，對(duì)植物產(chǎn)生的影響豐富多樣，研究表明致癭昆蟲還具有使植物細(xì)胞壁變薄、胞間連絲增大、細(xì)胞器變多等植物細(xì)胞重編程的功能（Florentine et al.，2005;Giron et al.，2016;楊孟可等，2021）。本研究中的GO富集分析結(jié)果與前人研究結(jié)論一致，在感性品種9311中，與細(xì)胞壁合成和光合作用相關(guān)的基因更多地呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，因此研究細(xì)胞壁的形成與水稻抗褐飛虱取食之間的關(guān)系有利于揭示水稻抗褐飛虱機(jī)理，而稻癭蚊還需進(jìn)一步研究探索增強(qiáng)植物光合作用以及增強(qiáng)植物細(xì)胞壁強(qiáng)度是否有助于抗蟲功能。稻癭蚊引起的水稻標(biāo)蔥是蟲癭的一種（Agarrwal et al.，2014），大部分關(guān)于致癭昆蟲與植物間互作關(guān)系的研究集中于林木，稻癭蚊引起的水稻蟲癭未有深入研究，利用水稻作為模式植物進(jìn)一步探明水稻標(biāo)蔥的形成與稻癭蚊取食之間的關(guān)系是未來的研究方向，研究結(jié)果可為植物響應(yīng)生物脅迫和致癭昆蟲與植物協(xié)同進(jìn)化提供理論支撐。C3EF4567-7C12-48BB-84A9-C29F2CF52217

KEGG信號(hào)通路富集分析表明2種害蟲取食均引起有關(guān)代謝通路、次生代謝物生物合成和苯丙素生物合成的顯著變化。次生代謝物是植物長(zhǎng)期進(jìn)化中應(yīng)對(duì)環(huán)境和脅迫所產(chǎn)生的結(jié)果，在植物對(duì)昆蟲防御方面發(fā)揮著重要作用（張文輝和劉光杰，2003）。其中揮發(fā)性的次生代謝物可誘集植食性昆蟲的寄生蜂和天敵，間接地進(jìn)行植物防御（Howe and Jander，2008）。水稻氫過氧化物裂解酶OsHPL3通過調(diào)節(jié)羥磷脂途徑，吸引稻虱纓小蜂寄生從而提高水稻對(duì)褐飛虱的抗性（Tong et al.，2012）。但最新研究表明植物次生代謝物不僅能被植物用于間接防御蟲害，反之亦可被昆蟲用于抵御天敵，如褐飛虱偏愛與二化螟共享寄主是因?yàn)楹诛w虱可借助二化螟誘導(dǎo)水稻揮發(fā)物而規(guī)避稻虱纓小蜂對(duì)其卵的寄生（Hu et al.，2020）;該團(tuán)隊(duì)隨后又發(fā)現(xiàn)褐飛虱也能幫助二化螟實(shí)現(xiàn)對(duì)水稻的反防御，褐飛虱取食不僅可下調(diào)二化螟單獨(dú)取食誘導(dǎo)的防御基因，而且能降低水稻利用信息揮發(fā)物吸引稻螟赤眼蜂，甚至做到排斥，極大降低二化螟卵的寄生率（Liu et al.，2021）。褐飛虱與二化螟作為水稻最主要的兩大害蟲，二者間可形成種間互利關(guān)系，攜手對(duì)抗水稻。由此可見，植物的次生代謝物合成與昆蟲間的關(guān)系非常復(fù)雜，褐飛虱與稻癭蚊之間是否也具有互利的關(guān)系值得深入研究，為將來制定害蟲生態(tài)防控打下理論基礎(chǔ)。

對(duì)差異基因進(jìn)行維恩分析，發(fā)現(xiàn)水稻對(duì)褐飛虱和稻癭蚊的共響應(yīng)基因有251個(gè)，其中108個(gè)基因表達(dá)模式相似，143個(gè)表達(dá)模式相反。對(duì)共響應(yīng)基因進(jìn)行富集分析，發(fā)現(xiàn)具有相同響應(yīng)模式的差異表達(dá)基因具有多個(gè)顯著富集的GO功能條目和6個(gè)KEGG信號(hào)通路，具有相反模式的差異表達(dá)基因僅有3個(gè)顯著富集的GO功能條目。因此，水稻內(nèi)存在較多的對(duì)2種害蟲共響應(yīng)的生物學(xué)功能和信號(hào)通路，尋找到一個(gè)能共同調(diào)控褐飛虱和稻癭蚊抗性的通路具有可行性。具有相同表達(dá)模式的差異表達(dá)基因在生物學(xué)功能上主要與光合作用、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和MAPK信號(hào)通路有關(guān)，其中激素調(diào)節(jié)主要涉及水楊酸的生物合成和茉莉酸信號(hào)途徑。已有大量研究表明茉莉酸和水楊酸參與植物響應(yīng)生物脅迫，調(diào)控褐飛虱的抗性（李毅等，2018;Xu et al.，2021）。如褐飛虱取食激活了水楊酸依賴的激素信號(hào)通路，并通過水楊酸信號(hào)通路抑制胼胝質(zhì)降解，從而增強(qiáng)對(duì)褐飛虱的抗性（Ling and Weilin，2016）。另外，研究表明，MAPK參與調(diào)控植株體內(nèi)的水楊酸與茉莉酸信號(hào)，在水稻信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用（Yuan et al.，2005;Wang et al.，2008;Hu et al.，2011）。Li等（2019）研究表明，OsMAPK20-5基因負(fù)調(diào)控水稻對(duì)褐飛虱的抗性，該基因的表達(dá)量在褐飛虱懷孕的雌蟲和成蟲取食過程中上調(diào)迅速，將該基因沉默后顯著提高植株乙烯和一氧化氮的積累，從而提高植株對(duì)褐飛虱成蟲的抗性并降低褐飛虱的產(chǎn)卵水平。關(guān)于激素信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路在褐飛虱抗性研究中較為廣泛，因這2個(gè)通路在2種害蟲中具有相同的響應(yīng)模式，因此后續(xù)在稻癭蚊的抗蟲機(jī)理解析中可借鑒褐飛虱的研究進(jìn)展進(jìn)行綜合考量。具有相反表達(dá)模式的基因的GO功能注釋，3個(gè)條目均與乙醛酸循環(huán)相關(guān)，乙醛酸循環(huán)可實(shí)現(xiàn)脂肪到糖的轉(zhuǎn)變，褐飛虱取食增強(qiáng)感性材料的乙醛酸循環(huán)（Peng et al.，2016），而稻癭蚊取食則降低乙醛酸循環(huán)相關(guān)基因的表達(dá)。此外，代謝組檢測(cè)稻癭蚊取食48 h后糖類的含量，其中果糖、葡萄糖和半乳糖均顯著降低，抗性材料的下降程度比感性材料更劇烈（陳燦等，2021）。推測(cè)出現(xiàn)這種情形的原因與2種害蟲對(duì)植物的傷害相關(guān)，褐飛虱取食后改變了植物體的滲透壓，需要更多的糖分來維持平衡，而稻癭蚊取食后，植物快速生長(zhǎng)形成蟲癭，消耗大量糖分。因此，探清乙醛酸循環(huán)在植物抗性機(jī)制內(nèi)的功能尚需更深入的研究。

4 結(jié)論

通過水稻幼苗的轉(zhuǎn)錄組分析，篩選出3963個(gè)響應(yīng)褐飛虱取食的差異表達(dá)基因，1206個(gè)響應(yīng)稻癭蚊取食的差異表達(dá)基因，其中有251個(gè)基因?qū)?種害蟲的取食共響應(yīng)，這些共響應(yīng)基因主要富集在光合作用、激素信號(hào)傳導(dǎo)、次生代謝物合成和乙醛酸循環(huán)等通路上。表明水稻幼苗響應(yīng)這2種害蟲具有相同點(diǎn)和不同之處，推測(cè)這些共響應(yīng)通路在水稻廣譜抗蟲上可能發(fā)揮著重要作用。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）C3EF4567-7C12-48BB-84A9-C29F2CF52217