番茄抗病品種吉美08 SlDFR基因的克隆與表達(dá)

梁思桃　高雁茹　劉廣清　黃瑞基　劉強(qiáng)　任振新　喬清華

摘要：【目的】克隆番茄（Solanum lycopersicum）抗病品種吉美08二氫黃酮醇4-還原酶（dihydroflavonol 4-reductase，DFR）基因，并分析枯萎病菌尖孢鐮刀菌番茄?；停‵ol4287）誘導(dǎo)下其在番茄不同組織中的表達(dá)模式，為深入研究SlDFR基因在番茄抗病過程中的調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)?！痉椒ā坎捎猛纯寺〖夹g(shù)從番茄中克隆SlDFR基因cDNA全長序列，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測番茄根、莖、葉中SlDFR基因在枯萎病菌誘導(dǎo)下的表達(dá)模式?！窘Y(jié)果】從番茄抗病栽培品種吉美08中克隆得到SlDFR基因，cDNA序列全長1659 bp，包含1個1149 bp的開放閱讀框（ORF），編碼379個氨基酸。SlDFR蛋白的相對分子質(zhì)量為42.43 kD，等電點（pI）為6.08，是一個親水的、穩(wěn)定的酸性蛋白，亞細(xì)胞定位在高爾基體上，無信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，有38個磷酸化位點，其中，絲氨酸18個，蘇氨酸15個，酪氨酸5個。SlDFR蛋白的二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋占37.73%，延伸鏈占13.98%，無規(guī)則卷曲占40.69%。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，SlDFR蛋白序列與同屬茄科馬鈴薯（Solanum pennellii）親緣關(guān)系較近，其次為黑果枸杞（Lycium ruthenicum）。qRT-PCR分析結(jié)果顯示，SlDFR基因在番茄葉中表達(dá)量最高，在根中表達(dá)量最低。SlDFR基因在番茄根、莖、葉中表達(dá)量受番茄枯萎病菌誘導(dǎo)，均呈現(xiàn)不同程度上調(diào)，其中，在根中表達(dá)量變化最大，在葉中表達(dá)量變化較小，推測SlDFR基因的表達(dá)量與番茄枯萎病菌脅迫響應(yīng)有關(guān)，且番茄根部類黃酮的合成為重要脅迫響應(yīng)途徑。【結(jié)論】SlDFR基因表達(dá)量受Fol4287的誘導(dǎo)，可能參與番茄枯萎病脅迫響應(yīng)過程，且對番茄枯萎病菌的響應(yīng)在番茄根部更強(qiáng)烈，并通過調(diào)控番茄根部黃酮類物質(zhì)的合成提高根系分泌物的抑菌活性從而增強(qiáng)番茄對枯萎病的抗性。

關(guān)鍵詞： 番茄;二氫黃酮醇4-還原酶（DFR）;基因克隆;表達(dá)分析

中圖分類號： S641.2? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2022）03-0813-08

Cloning and expression analysis of SlDFR gene in disease-resistant tomato varieties Jimei 08

LIANG Si-tao， GAO Yan-ru， LIU Guang-qing， HUANG Rui-ji， LIU Qiang，

REN Zhen-xin， QIAO Qing-hua

（College of Biology and Pharmacy， Yulin Normal University， Yulin， Guangxi? 537000， China）

Abstract：【Objective】To clone the tomato dihydroflavonol 4-reductase（DFR） gene of the resistant varieties Jimei 08 and to analyze its expression in different tissues of tomato induced by Fusarium wilt， so as to provide theoretical reference for exploration of the regulation mechanism of SlDFR gene in the process of tomato disease resistance. 【Method】The full-length cDNA sequence of SlDFR gene from tomato was cloned through homologous cloning technology， and bioinformatics analysis was conducted， and real-time fluorescent quantitative PCR was used to detect the expression pattern of SlDFR gene in tomato roots， stems and leaves induced by Fusarium wilt. 【Result】The full-length cDNA of SlDFR was 1659 bp and cDNA contained an open reading frame （ORF） of 1149 bp that encoded 379 amino acids. SIDFR protein had a molecular weight of 42.43 kD and its theoretical isoelectric point（pI） was 6.08， indicating that it was a stable hydrophilic one. And its subcellular localization was on Golgi apparatus without signal peptide and transmembrane domain， with 38 phosphorylation sites， including 18 serine （Ser） phosphate sites， 15 threonine （Thr） phosphate sites and 5 tyrosine （Tyr） phosphate sites. In the secondary structure of SlDFR protein， α-helix accounted for 37.73%， extended chain accounted for 13.98%， and random coil accounted for 40.69%. Phylogenetic analysis showed that tomato DFR was closely related to Solanum pennelli followed by Lycium ruthenicum. The results of real-time fluorescence quantitative PCR showed that the expression of SlDFR gene was the highest in leaves， and lowest in roots. After SlDFR gene expression being induced by Fusarium wilt， the expression of SlDFR gene was up-regulated in varying degrees. The change of expression was the largest in roots and the smallest in leaves， indicating that SlDFR gene was related to the stress response of tomato Fusarium wilt， and the synthesis of flavonoids in roots was an important stress response pathway. 【Conclusion】After SlDFR gene expression being induced by Fol4287， SlDFR gene could participate in the stress response of tomato Fusarium wilt， and the response to Fusarium wilt is stronger in the root， and probably the gene regulates flavonoid synthesis in the root to enhance antibacterial activity of root exudates， thus increasing the resistance of tomato to Fusarium wilt.

Key words： tomato; dihydroflavonol 4-reductase （DFR）; gene cloning; expression analysis

Foundation items： Guangxi Natural Science Foundation（2020GXNSFBA297036）; Start Up Foundation for Scien-tific Research of High-level Talents of Yulin Normal University（G2020ZK06）

0 引言

【研究意義】番茄（Solanum lycopersicum）營養(yǎng)豐富，在全國各地均廣泛種植。隨著設(shè)施番茄種植面積逐年擴(kuò)大及復(fù)種指數(shù)連年提高，番茄土傳病害的發(fā)生與危害程度已呈逐年加重趨勢（李煥玲，2014;杜建峰等，2020;祝海燕等，2020），其中，設(shè)施番茄枯萎病的危害尤為嚴(yán)重，一旦發(fā)生常給番茄生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。類黃酮是一種重要的植物保衛(wèi)素，在植物抵御生物脅迫中發(fā)揮著重要作用，如一些黃酮類化合物可較好地抑制炭疽病菌、菜豆殼球孢菌、馬鈴薯壞疽病菌、立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌、疫霉病菌和大豆菌核菌等多種病原菌侵染（楊才瓊等，2018）。二氫黃酮醇-4-還原酶（DFR）是類黃酮合成途徑的一種關(guān)鍵酶，克隆番茄的SlDFR基因并分析其表達(dá)特性，探究其對致病菌的響應(yīng)機(jī)制，對深入研究SlDFR基因在番茄抗病過程中的調(diào)控機(jī)制具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】DFR是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）依賴的氧化還原酶，屬于短鏈脫氫酶/還原酶（SDR）超家族，可選擇性地催化3種二氫黃酮醇（二氫槲皮素、二氫山奈酚和二氫楊梅素）和2種黃烷酮（柚皮素和圣草酚）生成3種不同的無色花青素苷或黃烷-4-醇進(jìn)而合成兒茶素、花青素苷和原花色素等（Li et al.，2012;左濤等，2016）。DFR的底物選擇及催化效率是決定植物體內(nèi)合成類黃酮成分和含量的關(guān)鍵因素。O’Reilly等（1985）采用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)首次從玉米和金魚草中分離DFR基因，其他學(xué)者從擬南芥、油菜、小麥、大豆、番茄和牽牛花等多種植物中也克隆到該基因（Kubasek et al.，1992;Inagaki et al.，1999;Gutierrez-Gonzalez et al.，2010;Cunmin et al.，2016;Zuo et al.，2019）。不同植物的DFR蛋白均存在保守的NADPH結(jié)合域和底物特異性結(jié)合域，但不同物種的DFR對底物結(jié)合的偏好性存在差異（于婷婷等，2018）。已有研究認(rèn)為，DFR對底物結(jié)合的特異性通常是由第134位氨基酸殘基決定（Johnson et al.，2001）。還有學(xué)者認(rèn)為，雖然第134位氨基酸在底物選擇中具有重要作用，但不能單獨決定DFR的底物選擇性，其催化效率還受其他氨基酸位阻效應(yīng)影響（Yan et al.，2014;Chu et al.，2015）。DFR在植物花色形成、紫外線防護(hù)、抵抗病原體、花粉發(fā)育及激素運(yùn)輸?shù)冗^程中發(fā)揮著重要作用（Adriana et al.，2019;Zhao et al.，2021）。DFR基因表達(dá)水平、底物結(jié)合特異性及催化效率是通過調(diào)控類黃酮合成影響植物抗逆性的重要途徑?！颈狙芯壳腥朦c】已有相關(guān)研究證實DFR基因參與植物脅迫響應(yīng)，提高植物抗病性（李玉霞等，2020）。目前雖已克隆得到SlDFR基因，但對其結(jié)構(gòu)和功能的研究，特別是對抗病性方面的相關(guān)研究仍有待補(bǔ)充?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用同源克隆技術(shù)從番茄枯萎病抗性品種吉美08中克隆得到SlDFR基因，對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并研究其在番茄不同組織受番茄枯萎病菌尖孢鐮刀菌番茄專化型（Fol4287）誘導(dǎo)后的表達(dá)模式，旨在為進(jìn)一步研究SlDFR基因在番茄枯萎病抗性中的功能打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

吉美08番茄種子購自山東壽光市洪亮種子有限公司。供試菌株為Fol4287，由福建農(nóng)林大學(xué)閩臺作物有害生物生態(tài)防控國家重點實驗室云英子博士提供。RNA提取試劑盒購自北京華越洋生物科技有限公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Prime ScriptTM Reverse Transcriptase）和pMD19-T Vector載體購自寶生物工程（大連）有限公司。DNA凝膠回收試劑盒為Axygen和AP-GX-250。PCR引物和qPCR引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)數(shù)據(jù)庫中已有的SlDFR基因片段保守區(qū)，使用Primer Premier 5.0設(shè)計該基因全長擴(kuò)增引物（SlDFR-F：5'-GCTGACTCTT TTTTACCTTT-3'，SlDFR-R：5'-ATTATGTATGGTTG GGTTTC-3'）。根據(jù)SlDFR基因序列測序結(jié)果，使用Primer Premier 5.0設(shè)計該基因的熒光定量引物（qSlDFR-F：5'-ACTCTCCTCCGAAGACGACA-3'，qSlDFR-R：5'-TCACCTTCTTCTGGTTCTCA-3'）。以Actin為內(nèi)參基因（Actin-F：5'-CTCAACCCCAAGG CTAACAG-3';Actin-R：5'-ACCTCAGGGCATCGG AAC-3'）。

1. 2. 2 SlDFR基因克隆與測序 以番茄根、莖、葉提取總RNA逆轉(zhuǎn)錄的單鏈cDNA為模板，利用1.2.1中基因全長擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)克隆后送至北京擎科生物科技有限公司測序。

1. 2. 3 生物信息學(xué)分析 通過NCBI的開放閱讀框（ORF）Finder工具和DNAman進(jìn)行序列分析。使用在線軟件Protparam（https：//web.expasy.org/protparam/）進(jìn)行DFR蛋白理化性質(zhì)分析。以Signalp 5.0和TMHMM進(jìn)行信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域分析。使用NCBI的CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）和SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）在線分析軟件進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域分析。以Netphos 3.1 server分析潛在磷酸化位點。利用Cell-PLoc 2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）預(yù)測SlDFR蛋白的亞細(xì)胞定位。分別利用SOPMA和SWISS-MODEL對SlDFR蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。以MEGA 10.0進(jìn)行序列比對和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1. 2. 4 SlDFR基因表達(dá)量測定及分析 以水培14 d的2葉1心期番茄幼苗為試驗材料，以Fol4287進(jìn)行不同時間處理后分別取根、莖和葉，提取總RNA，以反轉(zhuǎn)錄單鏈cDNA為熒光定量PCR（qRT-PCR）模板。以1.2.1中的熒光定量引物為PCR引物，以Actin為內(nèi)參基因，使用Real Time PCR熒光定量儀（Eppendorf）進(jìn)行檢測。

1. 3 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010進(jìn)行統(tǒng)計分析，以2法計算基因相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2. 1 SlDFR基因克隆結(jié)果

分別使用番茄根、莖、葉組織提取總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。cDNA作為模板直接或稀釋后擴(kuò)增基因全長，得到SlDFR基因cDNA序列（圖1）。從圖1可看出，擴(kuò)增條帶約1500 bp，對該cDNA序列測序結(jié)果顯示SlDFR基因為1659 bp，說明電泳結(jié)果與目的片段大小一致。

2. 2 SlDFR蛋白序列及其理化性質(zhì)分析

通過NCBI的ORF Finder對SlDFR基因全長（1659 bp）的ORF即編碼區(qū)進(jìn)行查找，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SlDFR基因包含1個1149 bp的ORF（啟動子為ATG，終止子為TAG），編碼379個氨基酸。此外，在編碼區(qū)的上游和下游分別含有一段93 bp的5'非翻譯區(qū)和417 bp的3'非翻譯區(qū)。

使用在線軟件Protparam分析SlDFR蛋白的理化性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)SlDFR蛋白的分子式為C1914H2976N494O563S16，相對分子質(zhì)量為42.43 kD，等電點（pI）為6.08，不穩(wěn)定參數(shù)為32.84，蛋白性質(zhì)穩(wěn)定（通常認(rèn)為蛋白的不穩(wěn)定參數(shù)在40.00以下為穩(wěn)定蛋白）;SlDFR蛋白中含量相對較多的氨基酸為Lys（8.4%，32個）、Ala（8.2%，31個）和Leu（7.4%，28個）;親水性平均系數(shù)為-0.218，脂肪系數(shù)為82.88。說明該蛋白是親水的、穩(wěn)定的酸性蛋白。Signalp 5.0和TMHMM的分析結(jié)果表明，SlDFR蛋白無信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域。

2. 3 SlDFR蛋白的保守結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點及亞細(xì)胞定位預(yù)測

使用NCBI的CDD和SMART蛋白結(jié)構(gòu)域在線預(yù)測工具分析SlDFR蛋白的結(jié)構(gòu)域，結(jié)果（圖2）表明，SlDFR蛋白存在NADPH結(jié)合位點，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴的脫水酶結(jié)構(gòu)域位于氨基酸序列的20～271位。以Netphos 3.1 server對SlDFR蛋白的潛在磷酸化位點進(jìn)行分析，結(jié)果（圖3）表明，該蛋白共有38個磷酸化位點，其中，絲氨酸18個，蘇氨酸15個，酪氨酸5個。利用Cell-PLoc 2.0預(yù)測SlDFR蛋白的亞細(xì)胞定位，結(jié)果表明SlDFR蛋白可能定位在高爾基體上。

2. 4 SlDFR蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)分析

利用SOPMA預(yù)測SlDFR蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果（圖4）表明，該蛋白主要由α-螺旋、β-折疊、無規(guī)則卷曲和延伸鏈組成，其中，α-螺旋占37.73%，延伸鏈占13.98%，β-折疊占6.60%，無規(guī)則卷曲占40.69%。

利用SWISS-MODEL在線軟件同源建模得到SlDFR蛋白的三維模型（圖5），其全球模型質(zhì)量估計（GMQE）值為0.80，介于正常值0～1.00，表明該模型在空間結(jié)構(gòu)上合理性較高;SlDFR蛋白主要是由無規(guī)則卷曲和α螺旋組成;SlDFR蛋白存在2個配體結(jié)合區(qū)（NADPH結(jié)合區(qū)和底物結(jié)合區(qū)），其第134位氨基酸為Val，屬于非Asn/Asp型DFR蛋白。

2. 5 DFR蛋白序列系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析結(jié)果

在NCBI中檢索DFR蛋白氨基酸相似序列，篩選出16個物種（表1）的DFR蛋白序列，利用MEGA 10.0對番茄及16個物種的DFR蛋白序列進(jìn)行比對，結(jié)果（圖6）顯示，SlDFR蛋白序列與茄科其他屬物種的親緣關(guān)系較近。其中，馬鈴薯（Solanum pennellii）與番茄的同源性最高，其次為黑果枸杞（Lycium ruthenicum）、Iochroma baumii和辣椒（Capsicum annuum），茄科植物中矮牽牛（Petunia hybrida）與番茄的親緣關(guān)系較遠(yuǎn);在非茄科植物中，旋花科的裂葉牽牛（Ipomoea nil）和三裂葉薯（Ipomoea triloba）與茄科植物的進(jìn)化距離較近。

2. 6 SlDFR啟動子順式作用元件分析結(jié)果

為進(jìn)一步了解SlDFR基因的調(diào)控功能，從NCBI數(shù)據(jù)庫中找到番茄SlDFR基因CDS前2000 bp序列，利用啟動子在線分析工具PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進(jìn)行啟動子順式作用元件分析，推測其可能參與的生理過程。結(jié)果（表2）表明，SlDFR啟動子區(qū)域除含有大量光響應(yīng)元件外還含有大量激素響應(yīng)元件，例如茉莉酸響應(yīng)元件、脫落酸響應(yīng)元件和赤霉素響應(yīng)元件等，此外還有1個脅迫響應(yīng)元件和1個MYB結(jié)合位點。

2. 7 SlDFR基因響應(yīng)Fol4287的表達(dá)情況分析

采用Fol4287處理水培番茄0～14 h，通過qRT-PCR分析不同處理時間下根、莖、葉SlDFR基因的表達(dá)情況。結(jié)果（圖7）顯示，未進(jìn)行Fol4287處理的對照組中，SlDFR基因在葉中的表達(dá)量顯著高于根（P<0.05，下同），為根中表達(dá)量的21.67倍（圖7-A），而在莖中的表達(dá)量與根相比無顯著差異（P>0.05）。Fol4287處理后SlDFR基因在番茄根、莖、葉中的表達(dá)量均表現(xiàn)不同程度上調(diào)，其中，在莖中的表達(dá)量呈先上升后下降變化趨勢，處理10 h時表達(dá)量最高，為處理0 h的1.75倍，且顯著高于除處理8 h外其他處理時間的表達(dá)量（圖7-C）;Fol4287處理后SlDFR基因在葉中的表達(dá)量快速升高，其中在處理6 h時出現(xiàn)最大值，為處理0 h的1.94倍，且顯著高于其他處理時間的表達(dá)量（圖7-D）;而Fol4287處理后SlDFR基因在根的表達(dá)量出現(xiàn)2個峰值，其中，處理6 h時出現(xiàn)第一個峰值，隨后表達(dá)量下降，處理12 h時出現(xiàn)最高值，表達(dá)量為對照組的6.31倍，且顯著高于除處理14 h外其他處理時間的表達(dá)量（圖7-B），與莖和葉的表達(dá)量相比變化最大，在葉中表達(dá)量變化較小。

3 討論

DFR是類黃酮合成途徑中的關(guān)鍵酶。1994年Bongue-Bartelsman等首次從番茄下胚軸中克隆得到SlDFR基因，并對其表達(dá)特性進(jìn)行初步分析。本研究從番茄品種吉美08中克隆得到1個SlDFR基因，氨基酸序列分析結(jié)果表明，該基因編碼379個氨基酸，與滇牡丹、威氏綠絨蒿和日本蛇根草等植物DFR基因編碼的氨基酸數(shù)量相近（李云琴等，2020;馮猜等，2021;嚴(yán)朋飛等，2021）;SlDFR蛋白是親水的、穩(wěn)定的酸性蛋白，且無信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，為非分泌性蛋白，定位在高爾基體上，而植物DFR蛋白多定位于細(xì)胞質(zhì)中（肖向文等，2014;賴呈純等，2016;王疆然等，2021），因此，SlDFR蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果是否準(zhǔn)確有待進(jìn)一步探究;啟動子順式作用元件分析結(jié)果表明，SlDFR啟動子區(qū)域含有激素響應(yīng)元件、脅迫響應(yīng)元件和MYB結(jié)合位點，暗示SlDFR基因參與了番茄多種激素和逆境脅迫響應(yīng)途徑。

DFR底物結(jié)合的特異性控制類黃酮合成途徑中生成的花色素苷、黃烷醇和原花青素支路通量，對植物體內(nèi)具有抑菌活性的黃酮類物質(zhì)合成和積累發(fā)揮著重要作用。左濤等（2016）研究表明，DFR基因通過調(diào)控兒茶素生物合成提高楊樹的抗病性。Zhang等（2019）、Zhuang等（2019）研究指出，DFR基因?qū)χ参锘ㄇ嗨氐暮铣删哂姓{(diào)節(jié)作用?；ㄇ嗨爻俗鳛闆Q定植物花色的主要色素外，在植物抵抗干旱、低溫和鹽脅迫等多種非生物脅迫及對火疫病菌、軟腐病菌和黃萎病菌等多種致病菌的響應(yīng)過程中也具有重要作用（Gould et al.，2018;王鴻雪等，2020）。DFR基因還可作為黃烷酮4-還原酶（FNR）催化柚皮素和圣草酚生成黃烷-4-醇（flavan-4-ols），進(jìn)而在其他酶的作用下形成3-脫氧花青素（3-deoxyantho-cyanidin），3-脫氧花青素及其中間代謝產(chǎn)物五羥基黃酮（luteo-forol）可作為防御物質(zhì)抵御真菌和細(xì)菌侵害（Li et al.，2012）。Johnson等（2001）通過對非洲菊的研究首次提出DFR底物結(jié)合區(qū)，并發(fā)現(xiàn)其中的第134位氨基酸種類是決定所催化底物的關(guān)鍵，其中，第一類的第134位氨基酸是天冬酰胺殘基（Asn），與非洲菊相同，屬于Asn型DFR;第二類的第134位氨基酸為天冬氨酸殘基（Asp），屬于Asp型DFR，可催化二氫櫟皮黃酮（DHQ）和二氫楊梅黃酮（DHM），但不能有效催化二氫堪非醇（DHK）;第三類的第134位氨基酸殘基既不是天冬酰胺也不是天冬氨酸。此外，還有研究指出，雖然第134位氨基酸在底物選擇中具有重要作用，但不能單獨決定DFR底物的選擇性，其催化效率還受其他氨基酸位阻效應(yīng)影響（Yan et al.，2014;Chu et al.，2015）。本研究結(jié)果表明，番茄DFR氨基酸序列第134位氨基酸為纈氨酸（Val），為非Asn/Asp型DFR，但其作用底物的特異性及催化效率有待進(jìn)一步探討。

類黃酮參與植物防御的方式分為通過調(diào)節(jié)植物生理特性提高植物對病原菌的抵抗能力和直接抑制病原菌侵害2種類型。某些黃酮類物質(zhì)不會在植物的根部累積，而是通過根系分泌到土壤中發(fā)揮作用（Akifumi and Yazaki，2014），此類抑菌物質(zhì)可在病原菌與植物根系接觸前分泌到土壤中從而抑制病原菌對根系的侵害。本研究結(jié)果表明，進(jìn)行Fol4287處理后，番茄根、莖、葉中的DFR基因表達(dá)量均顯著增加，說明其受Fol4287誘導(dǎo)參與了脅迫響應(yīng)過程。此外，雖然DFR基因表達(dá)具有明顯的組織特異性，在葉中的表達(dá)量顯著高于根和莖，但在根中DFR基因受Fol4287的誘導(dǎo)表達(dá)量快速、大量升高，其響應(yīng)的劇烈程度高于莖和葉，推測SlDFR基因可通過調(diào)控番茄根系類黃酮合成提高根系黃酮類物質(zhì)的含量，從而調(diào)控番茄對枯萎病的抗性。但根部合成的黃酮類物質(zhì)是作物信號物質(zhì)參與番茄對病原菌的應(yīng)答提高番茄根部對番茄枯萎病菌的抵抗能力，還是通過根系分泌物的形式提高根際環(huán)境中類黃酮的含量，抑制病原菌生長和定殖，抑或是二者兼有，目前還不清楚。因此，DFR基因?qū)χ参锔考案捣置谖镏悬S酮類物質(zhì)的調(diào)控及對其抑菌活性的影響將是下一步的研究方向。

4 結(jié)論

SlDFR基因表達(dá)量受Fol4287的誘導(dǎo)，可能參與番茄枯萎病脅迫響應(yīng)過程，且對番茄枯萎病菌的響應(yīng)在番茄根部更強(qiáng)烈，并通過調(diào)控番茄根部黃酮類物質(zhì)合成提高根部對病原菌的抵抗力或根系分泌物的抑菌活性從而增強(qiáng)番茄對枯萎病的抗性。

參考文獻(xiàn)：

杜建峰，吳偉，張曉英，李洋，丁新華. 2020. 番茄頸腐根腐病的發(fā)生及其防治研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報，36（10）：200-206. [Du J F，Wu W，Zhang X Y，Li Y，Ding X H. 2020. Research progress on the occurrence and control of Fusarium crown and root rot of tomato[J]. Biotechno-logy Bulletin，36（10）：200-206.] doi：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0260.

馮猜，周娜娜，孫世宇，周潔羽，孫威. 2021. 日本蛇根草DFR3基因的克隆分析及其編碼蛋白的分離純化[J]. 西北植物學(xué)報，41（6）：926-932. [Feng C，Zhou N N，Sun S Y，Zhou J Y，Sun W. 2021. Cloning and analysis of DFR3 gene from Ophiorrhiza japonicus（OJDFR3） and isolation and purification of its coding protein[J]. Acta Bota-nica Boreali Occidentalia Sinica，41（6）：926-932.] doi：10.7606/j.issn.1000-4025.2021.06.0926.

賴呈純，黃賢貴，甘煌燦，潘紅，范麗華. 2016. 刺葡萄DFR基因克隆及生物信息學(xué)分析[J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，31（7）：683-689. [Lai C C，Huang X G，Gan H C，Pan H，F(xiàn)an L H. 2016. Cloning and bioinformatics of DFR gene in Vitis davidii foex[J]. Journal of Fujian Agriculture，31（7）：683-689.] doi：10.19303/j.issn.1008-0384.2016.07.003.

李煥玲. 2014. 番茄青枯病的發(fā)生與綜合防治技術(shù)[J]. 北方園藝，（5）：54-56. [Li H L. 2014. Occurrence and integra-ted control techniques of tomato bacterial wilt[J]. Nor-thern Horticulture，（5）：54-56.]

李玉霞，曲延英，艾海提·艾合買提，王慧敏，黃啟秀，陳琴，陳全家. 2020. 通過GbF3'H基因單獨沉默及其與GbCHI和GbDFR基因共沉默研究其在海島棉中抗枯萎病功能[J]. 棉花學(xué)報，32（1）：1-10. [Li Y X，Qu Y Y，Aihaiti A H M T，Wang H M，Huang Q X，Chen Q，Chen Q J. 2020. Through single silencing GbF3'H gene and its co-silencing with GbCHI and GbDFR genes to study their function in resistance to Fusarium wilt in Gossypiu barbadense[J]. Cotton Science，32（1）：1-10.]

李云琴，原曉龍，陳中華，王毅. 2020. 滇牡丹（Paeonia delavayi）二氫黃酮醇4-還原酶基因的鑒定及表達(dá)[J]. 分子植物育種，18（4）：59-63. [Li Y Q，Yuan X L，Chen Z H，Wang Y. 2020. Identification and expression of dihydroflavonol 4-reductase gene in Paeonia delavayi[J]. Mole-cular Plant Breeding，18（4）：59-63.] doi：10.13271/j.mpb. 018.001083.

王鴻雪，劉天宇，莊維兵，王忠，朱林，渠慎春，翟恒華. 2020. 花青素苷在植物逆境響應(yīng)中的功能研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，28（1）：174-183. [Wang H X，Liu T Y，Zhuang W B，Wang Z，Zhu L，Qu S C，Zhai H H. 2020. Research advances in the function of anthocyanin in plant stress response[J]. Journal of Agricultural Biotechnology，28（1）：174-183.] doi：10.3969/j.issn.1674-7968. 2020.01.018.

王疆然，王玉芬，王舒婷，張芳娟，牛顏冰，王德富. 2021. 不同花色黃芩中dfr基因的克隆及時空表達(dá)分析[J]. 生物工程學(xué)報，37（4）：1312-1323. [Wang J R，Wang Y F，Wang S T，Zhang F J，Niu Y B，Wang D F. 2021. Cloning and temporal-spatial expression analysis of dfr gene from Scutellaria baicalensis with different colors[J]. Journal of Bioengineering，37（4）：1312-1323.] doi：10.13345/j.cjb.200 466.

肖向文，朱奇朗，劉海峰，王俊鐸，羅城，曾聞，梁亞軍，龔兆龍，李曉波. 2014. 棕色棉D(zhuǎn)FR基因的克隆與生物信息學(xué)分析[J]. 生物技術(shù)通報，30（5）：88-95. [Xiao X W，Zhu Q L，Liu H F，Wang J D，Luo C，Zeng W，Liang Y J，Gong Z L，Li X B. 2014. Cloning and bioinformatics analysis of DFR gene from brown cotton[J]. Biotechno-logy Bulletin，（5）：88-95.] doi：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.05.021.

嚴(yán)朋飛，張瑩欣，賈維嘉，劉建，郭小雪，江元祺，屈燕. 2021. 威氏綠絨蒿二氫黃酮醇4-還原酶DFR基因克隆與表達(dá)分析[J]. 分子植物育種，19（24）：8064-8070. [Yan P F，Zhang Y X，Jia W J，Liu J，Guo X X，Jiang Y Q，Qu Y. 2021. Cloning and expression analysis of dihydroflavonol 4-reductase gene from Meconopsis wilsonii[J]. Molecular Plant Breeding，19（24）：8064-8070] doi：10.13271/ j.mpb.019.008064.

楊才瓊，楊文鈺，劉江. 2018. 植物類黃酮的化學(xué)生態(tài)學(xué)意義[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，30（11）：2009-2016. [Yang C Q，Yang W Y，Liu J. 2018. Advances on chemical ecology of plant flavonoids[J]. Natural Product Research and Development，30（11）：2009-2016.] doi：10.16333/j.1001-6880.2018.11.025.

于婷婷，倪秀珍，高立宏，韓國軍，朱長甫，盛彥敏. 2018. 高等植物二氫黃酮醇4-還原酶基因研究進(jìn)展[J]. 植物研究，38（4）：632-640. [Yu T T，Ni X Z，Gao L H，Han G J，Zhu C F，Sheng Y M. 2018. Advances in study of dihydroflavonol 4-reductase（DFR） genes of higher plants[J]. Bulletin of Botanical Research，38（4）：632-640.] doi：10. 7525/j.issn.1673-5102.2018.04.020.

祝海燕，李婷婷. 2020. 過量施肥對設(shè)施番茄影響的調(diào)查分析[J]. 中國瓜菜，33（1）：55-58. [Zhu H Y，Li T T. 2020. Effect of excessive fertilization on facilities tomato[J]. Chinese Cucurbits and Vegetables，33（1）：55-58.] doi：10.16861/j.cnki.zggc.2020.0011.

左濤，趙樹堂，盧孟柱，孫愛東，王延偉，賀偉. 2016. 楊樹二氫黃酮醇-4-還原酶基因（DFR）的克隆及反義表達(dá)對兒茶素合成的影響[J]. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報，44（10）：49-55. [Zuo T，Zhao S T，Lu M Z，Sun A D，Wang Y W，He W. 2016. Cloning dihydroflavonol-4-reductase gene（DFR） of Poplar and its antisense expression effects on catechin[J]. Journal of Northeast Forestry University，44（10）：49-55.] doi：10.13759/j.cnki.dlxb.2016.10.010.

Adriana G F，Armando V M D，Elvira O R，Luis F J. 2019. Photoprotective and antigenotoxic effects of the flavonoids apigenin，naringenin and pinocembrin[J]. Photochemistry and Photobiology，95（4）：1010-1018. doi：10. 1111/php.13085.

Akifumi S，Yazaki K. 2014. Flavonoids in plant rhizospheres：Secretion，fate and their effects on biological communication[J]. Plant Biotechnology，31（5）：431-443. doi：10.5511/ plantbiotechnology.14.0917a.

Bongue-Bartelsman M，O'Neill S，Tong Y，Yoder J. 1994. Characterization of the gene encoding dihydroflavonol 4-reductase in tomato[J]. Gene，138（1-2）：153-157. doi：10. 1016/0378-1119（94）90799-4.

Chu Y X，Chen H R，Wu A Z，Cai R，Pan J S，Research M. 2015. Expression analysis of dihydroflavonol 4-reductase genes in Petunia hybrida[J]. Genetics and Molecular Research，14（2）：5010-5021. doi：10.4238/2015.May.12.4.

Cunmin Q，Zhao H Y，F(xiàn)u F Y，Wang Z，Zhang K，Zhou Y，Wang X，Wang R，Xu X F，Tang Z L，Lu K，Li J N. 2016. Genome-wide survey of flavonoid biosynthesis genes and gene expression analysis between black- and yellow-seeded Brassica napus[J]. Frontiers in Plant Scien-ce，7：1755. doi：10.3389/fpls.2016.01755.

Gould K S，Jay-Allemand C，Logan B A，Baissac Y，Bide L P R. 2018. When are foliar anthocyanins useful to plants？ Re-evaluation of the photoprotection hypothesis using Arabidopsis thaliana mutants that differ in anthocyanin accumulation[J]. Environmental and Experimental Botany，154：11-22. doi：10.1016/j.envexpbot.2018.02.006.

Gutierrez-Gonzalez J，Guttikonda S，Tran L，Aldrich D，Zhong R，Yu O，Nguyen H，Sleper D. 2010. Differential expression of isoflavone biosynthetic genes in soybean during water deficits[J]. Plant Cell Physiology，51（6）：936-948. doi：10.1093/pcp/pcq065.

Hong M，Kim D，Ahn J，Kang S，Seo Y，Kim J. 2018. Comparison of radiosensitivity response to acute and chronic gamma irradiation in colored wheat[J]. Genetics and Molecular Biology，41（3）：611-623. doi：10.1590/1678-4685-GMB-2017-0189.

Inagaki Y，Johzuka-Hisatomi Y，Mori T，Takahashi S，Hayakawa Y，Peyachoknagul S，Ozeki Y，Iida S. 1999. Genomic organization of the genes encoding dihydroflavonol 4-reductase for flower pigmentation in the Japanese and common morning glories[J]. Gene，226（2）：181-188. doi：10. 1016/s0378-1119（98）00571-x.

Johnson E T，Ryu S，Yi H，Shin B，Cheong H，Choi G. 2001. Alteration of a single amino acid changes the substrate specificity of dihydroflavonol 4-reductase[J]. The Plant Journal，25（3）：325-333. doi：10.1046/j.1365-313x.2001. 00962.x.

Kubasek W，Shirley B，McKillop A，Goodman H，Briggs W，Ausubel F. 1992. Regulation of flavonoid biosynthetic genes in germinating arabidopsis seedlings[J]. Plant Cell，4（10）：1229-1236. doi：10.1105/tpc.4.10.1229.

Li H，Qiu J，Chen F，Lü X，F(xiàn)u C，Zhao D，Hua X，Zhao Q. 2012. Molecular characterization and expression analysis of dihydroflavonol-4-reductase（DFR） gene in Saussurea medusa[J]. Molecular Biology Reports，39（3）：2991-2999. doi：10.1007/s11033-011-1061-2.

O'reilly C，Shepherd N S，Pereira A，Schwarz-Sommer Z，Bertram I，Robertson D S，Peterson P A，Saedler H. 1985. Molecular cloning of the a1 locus of Zea mays using the transposable elements En and Mu1[J]. The EMBO Journal，4（4）：877-882.

Yan F，Di S，Rodas F，Torrico T，Murai Y，Iwashina T，Anai T，Takahashi R. 2014. Allelic variation of soybean flower color gene W4 encoding dihydroflavonol 4-reductase 2[J]. BMC Plant Biology，14（1）：58. doi：10.1186/1471-2229-14-58.

Zhang L，Sun X，Wilson I W，Shao F，Qiu D. 2019. Identification of the genes involved in anthocyanin biosynthesis and accumulation in Taxus chinensis[J]. Genes，10（12）：982. doi：10.3390/genes10120982.

Zhao Y， Zhou W J， Chen Y， Li Z J， Song X Q， Wang J， Tian D K， Niu J. 2021. Metabolite analysis in Nymphaea ‘Blue bird’ petals reveal the roles of flavonoids in color formation，stress amelioration，and bee orientation[J]. Plant Science，312：111025.

Zhuang H，Lou Q，Liu H，Han H，Wang Q，Tang Z，Ma Y，Wang H. 2019. Differential regulation of anthocyanins in green and purple turnips revealed by combined de novo transcriptome and metabolome analysis[J]. International Journal of Molecular Sciences，20（18）：4387. doi：10.3390/ ijms20184387.

Zuo L，Trisha L，Moira G，Shirley J，Tom E，Jeffrey P. 2019. Assessing anthocyanin biosynthesis in Solanaceae as a model pathway for Secondary metabolism[J]. Genes（Basel），10（8）：559. doi：10.3390/genes10080559.

（責(zé)任編輯 思利華）