L-天冬氨酸-α-脫羧酶的重組表達(dá)、定點(diǎn)突變及高通量檢測(cè)方法的建立

朱秋雨 段緒果

（南京林業(yè)大學(xué)輕工與食品學(xué)院，南京 210037）

L-天冬氨酸-α-脫羧酶（L-aspartate-α-decarboxylase，EC 4.1.1.11，panD）屬于氨基酸脫羧酶的一種，能夠催化L-天冬氨酸脫去α位的羧基生成β-丙氨酸。該酶最早是由Williamson等［1］從大腸桿菌（Escherichia coli）中分離得到，驗(yàn)證了大腸桿菌中L-天冬氨酸到β-丙氨酸的代謝途徑。目前已有多種不同來(lái)源的panD的研究報(bào)道，主要集中在大腸桿菌［2］、谷氨酸棒狀桿菌［3］（Corynebacterium glutamicum）、枯草芽孢桿菌［4］（Bacillus subtilis）、結(jié)核分枝桿菌［5］（Mycobacterium tuberculosis）、幽門(mén)螺旋桿菌［6］（Helicobacter pylori）等。研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌L-天冬氨酸-α-脫羧酶首先轉(zhuǎn)錄翻譯形成1個(gè)無(wú)活性的前體蛋白（π-蛋白，約14 kD），隨后π-蛋白發(fā)生分子內(nèi)重排，從而導(dǎo)致肽鏈斷裂，自剪切形成1個(gè)C端含有羥基的β-亞基（約3 kD）和1個(gè)N端含有丙酮?；摩?亞基（約11 kD），這2個(gè)亞基的空間位置非常緊密，但卻沒(méi)有共價(jià)鍵連接［7］?？莶菅挎邨U菌L-天冬氨酸-α-脫羧酶蛋白模擬結(jié)構(gòu)與大腸桿菌 L-天冬氨酸-α-脫羧酶蛋白結(jié)構(gòu)非常相似，并且具有保守的切割位點(diǎn)殘基，推測(cè)也具有類(lèi)似的自剪切機(jī)制。β-丙氨酸廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品飼料和化工等領(lǐng)域［8］，被認(rèn)為是12種最具發(fā)展?jié)摿Φ娜蓟衔镏唬?］。通過(guò)panD轉(zhuǎn)化L-天冬氨酸制備β-丙氨酸是主要途徑之一，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值，因此近年來(lái)panD的克隆表達(dá)、分子改造及應(yīng)用等方面的研究逐漸升溫。

研究發(fā)現(xiàn)L-天冬氨酸-α-脫羧酶普遍存在酶活力低［10］和穩(wěn)定性差［11］等問(wèn)題，篩選高活性、高穩(wěn)定性panD新酶或酶變體是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，這離不開(kāi)高效的篩選技術(shù)［12］。酶活測(cè)定使酶催化功能可以被“量化”，是新酶或酶變體高通量篩選不可或缺的過(guò)程［13］，開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單、高效的高通量酶活檢測(cè)方法是非常重要和必要的。建立有效的高通量檢測(cè)方法需要滿足以下條件［14］：（1）高度的準(zhǔn)確性；（2）快速，例如103-104樣品/天；（3）易操作；（4）可重復(fù)性；（5）廉價(jià)并容易獲得的篩選底物；（6）無(wú)需過(guò)于昂貴的儀器設(shè)備等。

目前，L-天冬氨酸-α-脫羧酶活力測(cè)定方法主要包括高效液相色譜法（HPLC）［15］、熒光法［16］、薄層層析法［17］，其中最常用的是HPLC法。但是HPLC法及熒光法檢測(cè)panD酶活力時(shí)，需要使用專用設(shè)備及有毒試劑，檢測(cè)準(zhǔn)備過(guò)程長(zhǎng)、成本高。薄層色譜法靈敏度較低，且難以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的定量分析。因此，建立操作簡(jiǎn)便易行、靈敏度高的檢測(cè)方法尤為重要。自1940年以來(lái)，pH指示劑已廣泛用于檢測(cè)釋放或消耗質(zhì)子的酶催化反應(yīng)的進(jìn)程［18］。原則上，只要緩沖液和pH指示劑具有相等或相似的質(zhì)子親和力，pH指示劑的顏色變化可以與脫羧反應(yīng)期間消耗的質(zhì)子量成比例，從而提供檢測(cè)酶活性的定量工具［19］?；趐H指示劑的比色法已經(jīng)成功檢測(cè)氨基酸脫羧酶［20］、碳酸酐酶［21］、糖基轉(zhuǎn)移酶［22］和許多其他水解酶［23-24］催化的反應(yīng)。相比于其他方法，比色法具有安全、簡(jiǎn)便、成本低且檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，當(dāng)考慮底物失活時(shí)，panD的反應(yīng)速率可以更精確地通過(guò)質(zhì)子轉(zhuǎn)移速率來(lái)確定，而不是通過(guò)量化產(chǎn)生的β-丙氨酸，該方法可以連續(xù)對(duì)反應(yīng)過(guò)程進(jìn)行檢測(cè)，不用考慮樣品穩(wěn)定性，因此更能準(zhǔn)確測(cè)定酶與底物的反應(yīng)情況［25］。Mo等［25］通過(guò)利用HEPES-中性紅緩沖液/指示劑對(duì)，使用高通量比色法從突變體文庫(kù)中獲得了4個(gè)活性分別提高了3.18%-24.69%的L-天冬氨酸-α-脫羧酶突變體。Jiang等［19］證實(shí)了4-嗎啉乙磺酸（MES）-CPR和3-嗎啉丙磺酸（MOPS）-BTB在高通量篩選各種脫羧酶方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。為了實(shí)現(xiàn)高通量篩選L-天冬氨酸-α-脫羧酶這一目標(biāo)，應(yīng)仔細(xì)研究緩沖液/指示劑對(duì)借助酶標(biāo)儀及微孔板組合的比色法實(shí)現(xiàn)酶催化反應(yīng)高通量檢測(cè)的適用性。

相較于其他來(lái)源的panD，來(lái)源于枯草芽孢桿菌的panDBs的活性和穩(wěn)定性較好，具有較好的工業(yè)應(yīng)用潛力［4］，但panDBs仍存在酶活力低和機(jī)理失活現(xiàn)象，Pei等［26］利用易錯(cuò)PCR技術(shù)，創(chuàng)建了一個(gè)隨機(jī)突變文庫(kù)，通過(guò)測(cè)試4 000個(gè)轉(zhuǎn)化子，成功篩選到V68I和I88M兩個(gè)突變體，其酶活和催化穩(wěn)定性相比野生型分別提高了18%-22%和29%-64%。Qian等［27］利用分子動(dòng)力學(xué)和結(jié)構(gòu)比對(duì)方法相結(jié)合，篩選到組合突變體Q5（BsPanDI46V/I88M/K104S/I126*）。由于其中2種枯草芽孢桿菌來(lái)源的L-天冬氨酸-α-脫羧酶突變體I88M和I46V/I88M/K104S/I126*在一定程度上提高了酶活和減弱了酶的機(jī)理失活現(xiàn)象，因此本研究選擇這2種突變體與野生酶一起作為模型酶，用于高通量檢測(cè)方法的驗(yàn)證。

本文首先以Bacillus subtilis的基因組DNA作為模板，擴(kuò)增得到L-天冬氨酸-α-脫羧酶編碼基因并在Escherichia coli BL21（DE3）實(shí)現(xiàn)了成功表達(dá)，在此基礎(chǔ)上采用定點(diǎn)突變構(gòu)建了2個(gè)突變體（I88M和Q5）。然后，篩選了緩沖液/指示劑體系并優(yōu)化檢測(cè)體系中緩沖液和指示劑的濃度，建立基于比色法原理的微孔板高通量檢測(cè)方法。最后以L-天冬氨酸-α-脫羧酶及其突變體作為模型酶，對(duì)高通量檢測(cè)方法進(jìn)行驗(yàn)證。本方法的建立旨在通過(guò)顯著提高篩選速度，對(duì)篩選和鑒定酶變體具有較好的應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 大腸桿菌JM109、大腸桿菌BL21（DE3）、枯草芽孢桿菌168、質(zhì)粒pET24a（+）由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB種子培養(yǎng)基（g/L）：酵母粉5，蛋白胨10，氯化鈉10，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。TB發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：酵母粉24，蛋白胨12，甘油5，K2HPO4·3H20 16.43，KH2PO42.3，pH 7.0-7.2，121℃滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑及儀器 擴(kuò)增L-天冬氨酸-α-脫羧酶基因panD的引物（表1），上海生工生物有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒、細(xì)菌質(zhì)粒提取試劑盒、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒，天根生化科技有限公司；r Taq DNA聚合酶、dNTP、核酸限制性內(nèi)切酶Nde I、Sac I和無(wú)痕連接緩沖液，大連TaKaRa公司；甲基化模板消化酶（Dpn I）Fermentas公司；L-天冬氨酸、β-丙氨酸、氫氧化鈉，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氯酚紅（CPR）、4-嗎啉乙磺酸（MES），生工生物工程（上海）股份有限公司。

表1 本研究中使用的引物Table 1 Primers used in this study

PCR儀、電泳儀，美國(guó)Bio-Rad公司；722N可見(jiàn)光分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；酶標(biāo)儀，美谷分子儀器（上海）有限公司；JY92-IIN型超聲波細(xì)胞破壁儀，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 枯草芽孢桿菌L-天冬氨酸-α-脫羧酶基因的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建 提取Bacillus subtilis基因組DNA，以該基因組DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增 L-天冬氨酸-α-脫羧酶基因panD，質(zhì)粒pET24a（+）采用Nde I和Sac I雙酶切，經(jīng)鑒定、膠回收后通過(guò)無(wú)痕連接構(gòu)建重組表達(dá)載體pET24a（+）-panD，熱激轉(zhuǎn)化E.coli JM109，卡那霉素抗性平板篩選出陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序分析。將測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3），得 到 重 組 菌E.coli BL21（DE3）/ pET24a（+）-panD。

1.2.2 突變體構(gòu)建方法 以野生型panDBs基因的重組質(zhì)粒pET24a（+）-panD為模板，利用表1所示引物對(duì)，通過(guò)高保真聚合酶pfu進(jìn)行全質(zhì)粒PCR。采用Dpn I酶于37℃對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切以消化野生型模板。將測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主E. coli BL21（DE3），挑取陽(yáng)性克隆培養(yǎng)后，得到含有突變基因的重組菌株。

1.2.3 重組蛋白表達(dá)及SDS-PAGE分析 挑取單菌落至LB種子培養(yǎng)基中，于37℃搖床200 r/min培養(yǎng)8-10 h，制備種子液。將種子液以5%接種體積分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)接至TB發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃、200 r/min培養(yǎng)3 h，加入15 g/L乳糖誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)36 h。發(fā)酵液離心去上清，用緩沖液懸浮菌體至菌體濃度OD600為15，菌體懸浮液經(jīng)超聲波細(xì)胞破壁儀破碎后，再經(jīng)過(guò)離心后收集上清液和沉淀，上清液即為L(zhǎng)-天冬氨酸-α-脫羧酶的粗酶液，并進(jìn)行SDS-PAGE分析。此外，對(duì)粗酶進(jìn)行了硫酸銨沉淀、透析和離子交換純化，得到的純酶用于后續(xù)酶動(dòng)力學(xué)分析。

1.2.4 緩沖液/指示劑檢測(cè)體系吸光度的確定 氯酚紅（CPR）的質(zhì)子化和去質(zhì)子化形式的吸收光譜在酶標(biāo)儀上進(jìn)行測(cè)定。在微孔板中分別加入濃度為5 mmol/L MES緩沖液，分別用鹽酸調(diào)節(jié)至pH 3.0或氫氧化鈉調(diào)節(jié)至pH 9.0，然后加入50 μmol/L CPR指示劑，用酶標(biāo)儀從350-700 nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，記錄下指示劑在質(zhì)子化和去質(zhì)子化形式下的最大光譜吸收差值。

確定體系檢測(cè)波長(zhǎng)后，制備12.5、25、37.5、50、62.5、75、100 μmol/L的CPR溶液，然后在最佳檢測(cè)波長(zhǎng)下檢測(cè)溶液的吸光度，驗(yàn)證不同指示劑濃度與吸光度的線性關(guān)系，確定該波長(zhǎng)是否適用于定量檢測(cè)。

1.2.5 緩沖液最適濃度的確定 通過(guò)檢測(cè)在酶標(biāo)板中37℃預(yù)熱的混合物中添加氫氧化鈉后指示劑吸光度的變化來(lái)建立校準(zhǔn)曲線。測(cè)定混合物（250 μL）為75 mmol/L L-天冬氨酸［19］（初始pH值為6.5），75 μmol/L CPR和MES（2、5、10、20 mmol/L）。然后，添加100 μL NaOH（0-1 mmol/L）于檢測(cè)混合物中模擬酶促脫羧反應(yīng)中質(zhì)子的消耗。

1.2.6 指示劑最適濃度的確定 測(cè)定混合物（250 μL）為75 mmol/L L-天冬氨酸，2 mmol/L的MES和CPR（25、50、75、100 μmol/L）。然后，添加100 μL NaOH（0-1 mmol/L）于檢測(cè)混合物中模擬酶促脫羧反應(yīng)中質(zhì)子的消耗。

1.2.7 酶活的測(cè)定 在微孔板中分別加入2 mmol/L MES緩沖液、75 μmol/L CPR指示劑及75 mmol/L L-天冬氨酸溶液于37℃預(yù)熱10 min，然后加入100 μL酶液。立即在酶標(biāo)儀中振蕩10 s保證完全混勻，并連續(xù)測(cè)定反應(yīng)10 min內(nèi)反應(yīng)液在567 nm處的吸光值，每隔1 min測(cè)一次。

HPLC法：準(zhǔn)確吸取500 μL L-天冬氨酸溶液于試管中，加入500 μL MES緩沖液于37℃水浴預(yù)熱10 min。然后準(zhǔn)確加入1 mL酶液，立即搖勻并計(jì)時(shí)，37℃水浴準(zhǔn)確保溫酶解反應(yīng)10 min后，將反應(yīng)樣品置于沸水浴中煮沸5 min，12 000 r/min離心5 min，上清用0.22 μm針頭式有機(jī)濾膜過(guò)濾，等待上樣，檢測(cè)樣品中β-丙氨酸含量。HPLC檢測(cè)條件，檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器，波長(zhǎng)334 nm，色譜柱：安捷倫HC-C18（2）150 mm×4.6 mm，流動(dòng)相為35 mmol/L含有30%甲醇（pH值7.5）的乙酸鈉，進(jìn)樣量：10 μL，流速：1 mL/min，柱溫：30℃。

1.2.8 動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定 在微孔板中加入2 mmol/L MES緩沖液，75 μmol/L CPR指示劑及不同濃度的 L-天冬氨酸溶液（2、5、10、15、20、30、40、50、60、75 mmol/L）。預(yù)熱10 min，然后加入100 μL酶液，立即在酶標(biāo)儀中振蕩10 s保證完全混勻，并連續(xù)測(cè)定反應(yīng)10 min內(nèi)反應(yīng)液在567 nm處的吸光值，每隔1 min測(cè)一次。利用Graphpad Prism8.0軟件將結(jié)果進(jìn)行非線性擬合測(cè)定動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

1.2.9 酶活計(jì)算公式

將指示劑吸光度變化速率與反應(yīng)速率之間的比例定義為緩沖因子Q。公式中Qexp是實(shí)驗(yàn)確定的緩沖因子，為校準(zhǔn)曲線斜率1 000倍的倒數(shù)，用于計(jì)算酶促脫羧反應(yīng)的速度［18］；dA / dt是指示劑吸光度變化的速率［28-29］；v為反應(yīng)體積（L）。酶活力定義：1 min反應(yīng)產(chǎn)生1 μmol/L產(chǎn)物β-丙氨酸的酶量，定義為1個(gè)單位（U）酶活力。

2 結(jié)果

2.1 枯草芽孢桿菌L-天冬氨酸-α-脫羧酶在大腸桿菌中的表達(dá)

2.1.1 枯草芽孢桿菌L-天冬氨酸-α-脫羧酶基因的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建 首先以提取的Bacillus subtilis的基因組DNA作為模板，進(jìn)行PCR克隆 擴(kuò)增，得到panDBs片段（384 bp），與經(jīng)過(guò)Nde I和Sac I雙酶切的pET24a（+）膠回收片段（圖1-A）進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化克隆宿主JM109，測(cè)序結(jié)果顯示質(zhì)粒上連接的基因序列與panDBs理論序列一致，重組表達(dá)載體pET24a（+）-panDBs結(jié)構(gòu)示意圖如圖1-B所示。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳圖及表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1 Agarose gel electropherogram and structural schematic diagram of expression vector

2.1.2 L-天冬氨酸-α-脫羧酶panDBs的定點(diǎn)突變及在大腸桿菌BL21（DE3）中的誘導(dǎo)表達(dá) 以pET24a（+）-panDBs為模板，根據(jù)表1中的引物，利用PCR介導(dǎo)的方法，分別構(gòu)建得到帶有突變體編碼基因的突變體panDBs-1（I46V/I88M/K104S/I126*）和panDBs-2（I88M）。將測(cè)序驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主E.coli BL21（DE3），得到突變后的重組菌株。重組菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)、破碎離心后，菌體破碎上清經(jīng)SDS-PAGE蛋白分析，結(jié)果如圖2所示。panDBs和panDBs-1菌體破碎上清中在小于14 kD左右的位置有明顯的蛋白條帶，與理論蛋白大小一致，說(shuō)明panDBs基因已成功表達(dá)。野生型和突變體panDBs-2只有斷裂后較大的α-亞基和較小的β-亞基，表明野生型和panDBs-2可以完全自我剪切。而突變體panDBs-1包括酶原π-蛋白（即沒(méi)有完成剪切斷裂前的蛋白）、少量α-亞基及β-亞基，可能是突變體panDBs-1只能實(shí)現(xiàn)部分剪切。

圖2 重組酶panDBs及突變體蛋白電泳圖Fig. 2 Electropherogram of recombinant protein panDBs and its mutant proteins

2.2 微孔板法酶活測(cè)定方法的建立

2.2.1 緩沖液/指示劑體系的選擇 L-天冬氨酸-α-脫羧酶在酶促脫羧反應(yīng)過(guò)程中，能夠消耗底物L(fēng)-天冬氨酸生成β-丙氨酸和CO2，每脫去一分子的羧基消耗一分子的質(zhì)子，因此可以基于酶催化反應(yīng)中隨著質(zhì)子的消耗而引起的pH值的增加，從而使得指示劑顏色變化的原理建立比色法測(cè)定酶活的方法，如圖3所示。

圖3 比色法測(cè)定L-天冬氨酸-α-脫羧酶酶活的原理Fig. 3 Principle for the determination of panD activity by colorimetric method

CPR指示劑在質(zhì)子化和去質(zhì)子化狀態(tài)下在350-700 nm之間的吸收光譜圖，如圖4-A所示，并且獲得了二者光譜吸收差值譜圖見(jiàn)圖4-B，CPR指示劑光譜吸收差值最顯著的波長(zhǎng)為567 nm。此外，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在567 nm波長(zhǎng)條件下，CPR濃度與吸光值是成正比的，如圖4-C所示，曲線滿足回歸相關(guān)系數(shù)R2= 0.99以上，說(shuō)明此波長(zhǎng)適合進(jìn)行定量檢測(cè)。因此，選用567 nm波長(zhǎng)作為L(zhǎng)-天冬氨酸-α-脫羧酶酶活測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖4 基于比色法的PanD高通量篩選方法的建立Fig. 4 Development of a colorimetric high-throughput screening method for PanD assay

2.2.2 MES緩沖液最適濃度的確定 將不同濃度的氫氧化鈉（0-1 mmol/L）加入到測(cè)定混合物中模擬脫羧反應(yīng)中質(zhì)子的消耗，制作校準(zhǔn)曲線觀察質(zhì)子變化與吸光度變化之間的線性關(guān)系。首先將CPR指示劑的濃度設(shè)定成75 μmol/L，檢測(cè)不同濃度緩沖液（2-20 mmol/L）對(duì)校準(zhǔn)曲線的影響，結(jié)果如圖5所示，使用2 mmol/L MES緩沖液得到的曲線呈大幅度上升的趨勢(shì)，而更高濃度的3種緩沖液，它們的曲線變化幅度較小，表明緩沖液濃度為2 mmol/L的校準(zhǔn)曲線具有較高的靈敏度。此外，將不同濃度緩沖液的回歸方程及相關(guān)系數(shù)進(jìn)行對(duì)比，緩沖液濃度為2 mmol/L的緩沖因子Qexp為0.002 0，并且具有良好的線性，因此在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中將MES緩沖液濃度固定在2 mmol/L。

圖5 CPR為指示劑時(shí)緩沖液濃度對(duì)測(cè)定體系pH敏感性的影響Fig. 5 Effects of buffer concentrations on sensing pH change using CPR as indicator

2.2.3 CPR指示劑最適濃度的確定 確定MES緩沖液濃度后，進(jìn)一步檢測(cè)CPR指示劑濃度（25-100 μmol/L）對(duì)校準(zhǔn)曲線的影響，如圖6結(jié)果所示，4種不同CPR指示劑濃度在在氫氧化鈉濃度為0-1 mmol/L的線性范圍內(nèi)，曲線上升趨勢(shì)均較平緩。此外，隨著指示劑濃度的增加，Qexp的值逐漸降低，說(shuō)明指示劑濃度越高，檢測(cè)的靈敏度越高，這對(duì)于檢測(cè)酶活較低的L-天冬氨酸-α-脫羧酶具有優(yōu)勢(shì)，但是觀察發(fā)現(xiàn)指示劑濃度對(duì)初始吸光度值的影響大，高濃度指示劑一開(kāi)始就具有很高的吸光度值，限制了檢測(cè)的范圍，并且75 μmol/L的指示劑線性良好，因此綜合選擇75 μmol/L的CPR指示劑進(jìn)行接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)。

圖6 CPR為指示劑時(shí)指示劑濃度對(duì)測(cè)定體系pH敏感性的影響Fig. 6 Effects of indicator concentration on sensing pH change using CPR as indicator

2.3 微孔板法在L-天冬氨酸-α-脫羧酶酶活檢測(cè)中的應(yīng)用

微孔板法的建立選擇的是濃度為2 mmol/L的MES緩沖液與75 μmol/L的CPR指示劑，在此條件下建立的校準(zhǔn)曲線如圖7-A所示，回歸方程為y=0.285x+1.126 5，R2=0.998 5，該檢測(cè)體系的線性范圍為0-0.25 μmol/（min·mL），最低檢測(cè)限為0.096 μmol/（min·mL）。進(jìn)一步測(cè)定不同底物濃度下對(duì)應(yīng)的酶反應(yīng)速率，利用Graphpad Prism8.0軟件將結(jié)果進(jìn)行非線性擬合，結(jié)果如圖7-B所示，根據(jù)動(dòng)力學(xué)曲線擬合結(jié)果計(jì)算出panDBs的Km值為2.78 mmol/L。

圖7 PanD活性的測(cè)定Fig. 7 Determination of PanD activity

在微孔板中使用CPR-MES體系對(duì)反應(yīng)過(guò)程進(jìn)行檢測(cè)，加入酶液與僅加入緩沖液的反應(yīng)體系相比，吸光度值呈明顯線性增長(zhǎng)，其中突變體panDBs-2的變化速率最大。表2結(jié)果顯示突變體panDBs-2的Vmax是野生型的1.82倍，通過(guò)HPLC方法檢測(cè)的突變體panDBs-2酶活力是野生型的2.58倍，這兩種方法的趨勢(shì)是一致的。Km值較野生型小，說(shuō)明該突變體的底物親和力有所提高。

表2 重組酶及其突變體的部分動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 Partial kinetic parameters of recombinant enzyme and its mutants

2.4 微孔板法與其它方法對(duì)L-天冬氨酸-α-脫羧酶酶活檢測(cè)效率的比較

對(duì)不同的樣品數(shù)量進(jìn)行酶活檢測(cè)，將微孔板法和HPLC法這兩種方法所需要的檢測(cè)時(shí)間進(jìn)行對(duì)比。發(fā)現(xiàn)當(dāng)檢測(cè)樣品為1 h，微孔板法需10 min，HPLC法需15 min（僅考慮檢測(cè)過(guò)程，不考慮前期準(zhǔn)備時(shí)間），兩種方法所需時(shí)間的差異較小。當(dāng)樣品數(shù)量為10個(gè)時(shí)，微孔板法檢測(cè)時(shí)間需10 min，而HPLC法則需要150 min，隨著檢測(cè)樣品數(shù)量的增加至30個(gè)、50個(gè)、80個(gè)時(shí)，微孔板法的檢測(cè)時(shí)間可近似看成無(wú)明顯變化，但HPLC法的檢測(cè)所需時(shí)間迅速增加至450 min、750 min甚至1 200 min，由此可以看出HPLC法的檢測(cè)所需時(shí)間與樣品數(shù)量成正相關(guān)。

3 討論

鄧思穎等［4］比較了不同來(lái)源的panD 的比酶活，發(fā)現(xiàn)來(lái)源于枯草芽孢桿菌的panD的活性和穩(wěn)定性較好，具有更好的應(yīng)用潛力。而大腸桿菌是常用于生產(chǎn)重組蛋白的宿主之一，與其他原核表達(dá)系統(tǒng)相比，大腸桿菌因其遺傳背景清楚、繁殖快、成本低、操作簡(jiǎn)便、可大規(guī)模高密度發(fā)酵培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于外源蛋白表達(dá)研究［30］?？莶菅挎邨U菌是革蘭氏陽(yáng)性菌，沒(méi)有內(nèi)毒素，是一種安全的蛋白表達(dá)系統(tǒng)，作者也嘗試過(guò)將panDBs在枯草芽孢桿菌中進(jìn)行表達(dá)，但是其表達(dá)水平遠(yuǎn)低于大腸桿菌，因此本文將panDBs在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)和研究，后期我們將繼續(xù)嘗試優(yōu)化枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)，提高panDBs在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)水平。

基于比色法原理的微孔板高通量檢測(cè)方法的建立，首先需要選擇合適的緩沖液/指示劑體系，該體系需要滿足以下幾個(gè)條件［19，28］：（1）為了保證pH指示劑的顏色變化與脫羧反應(yīng)過(guò)程中消耗的質(zhì)子數(shù)成正比，緩沖液與指示劑的pKa值應(yīng)該盡可能相等或相似，因此可以通過(guò)顏色的變化定量測(cè)定目標(biāo)脫羧酶的催化活性；（2）酶促反應(yīng)的pH范圍需要在指示劑的變色范圍內(nèi)，保證酶具有催化活性；（3）指示劑不能是待測(cè)酶的抑制劑且不與酶發(fā)生反應(yīng)。分析發(fā)現(xiàn)CPR指示劑顏色變化范圍為pH 5.2 （黃色）-pH 6.6（紫紅色），L-天冬氨酸-α-脫羧酶在此范圍內(nèi)具有較好活性，同時(shí)CPR指示劑和MES緩沖液的pKa值均為6.0，緩沖良好的pH范圍為5.5-6.7，且不會(huì)對(duì)酶活產(chǎn)生抑制作用或發(fā)生反應(yīng)，滿足比色法測(cè)定L-天冬氨酸-α-脫羧酶酶活的條件，因此實(shí)驗(yàn)選用CPR-MES反應(yīng)體系。

反應(yīng)體系確定后，為了計(jì)算特定反應(yīng)的速率，需要吸光度的變化與質(zhì)子消耗之間存在良好的線性關(guān)系［18］。公式中dA/dt為指示劑吸光度變化率，當(dāng)緩沖因子Q很小時(shí)，靈敏度最高（最大的dA/dt），降低緩沖液濃度或增加指示劑濃度可以提高檢測(cè)的靈敏度［29］，因此對(duì)反應(yīng)體系中緩沖液和指示劑濃度進(jìn)行了優(yōu)化。在最優(yōu)條件下建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=0.285x+1.126 5，R2=0.998 5，說(shuō)明在此檢測(cè)條件下，pH指示劑的顏色變化可以與脫羧反應(yīng)期間消耗的質(zhì)子量成比例，可以用于定量檢測(cè)酶活力，該檢測(cè)體系的線性范圍為0-0.25 μmol/（min· mL），最低檢測(cè)限為0.096 μmol/（min·mL），能夠滿足實(shí)際應(yīng)用的需要，并且方法操作簡(jiǎn)單，測(cè)定結(jié)果快速準(zhǔn)確。

然后，將優(yōu)化后的檢測(cè)體系以L-天冬氨酸-α-脫羧酶及其突變體作為模型酶，對(duì)高通量檢測(cè)方法進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果顯示，突變體panDBs-2酶活力及底物親和力均有明顯提高，其中突變體panDBs-2的Vmax是野生型的1.82倍，通過(guò)HPLC方法檢測(cè)的突變體panDBs-2酶活力是野生型的2.58倍，這兩種方法測(cè)得結(jié)果的趨勢(shì)是一致的。并且測(cè)得的Km值也與HPLC法（2.02 mmol/L）［26］相近，二者之間的差別可能是采用的檢測(cè)儀器不同、反應(yīng)體系體積不同及酶活定義不同所造成的。HPLC法測(cè)定的酶活定義為測(cè)定體系中產(chǎn)物β-丙氨酸的生成速率，而微孔板法測(cè)定的為體系中質(zhì)子濃度的減少速率。相對(duì)而言，微孔板法能更準(zhǔn)確測(cè)定酶與底物的反應(yīng)情況，因?yàn)樵摲椒ㄊ且粋€(gè)連續(xù)的反應(yīng)體系，酶活的測(cè)定也是即時(shí)的，每60 s進(jìn)行一次監(jiān)測(cè)，而不用考慮樣品的穩(wěn)定性，而在HPLC方法中則計(jì)算的是平均速率，從這個(gè)角度看微孔板法可能比HPLC更準(zhǔn)確［18］。突變體panDBs-1的Vmax和Km值相較于野生型無(wú)明顯變化，這可能與酶是否剪切成熟有關(guān)。從野生型和突變體的蛋白電泳圖發(fā)現(xiàn)，突變體panDBs-1沒(méi)有完全剪切成熟，而野生型和突變體panDBs-2可以自我完成剪切成熟，由無(wú)活性的酶原π-蛋白，裂解生成有活性基團(tuán)丙酮?；摩?亞基和β-亞基，α-亞基的丙酮酰基才是催化基團(tuán)［31］，從中篩選出的具有優(yōu)勢(shì)的突變體panDBs-2，在后續(xù)轉(zhuǎn)化L-天冬氨酸制備β-丙氨酸中表現(xiàn)出較好的應(yīng)用潛力，也說(shuō)明該檢測(cè)方法具有一定篩選能力。對(duì)比微孔板法與其它方法在L-天冬氨酸-α-脫羧酶酶活檢測(cè)中的效率發(fā)現(xiàn)，一方面，微孔板法操作簡(jiǎn)單快速，且費(fèi)用低；另一方面，隨著酶分子改造技術(shù)的快速發(fā)展，突變文庫(kù)包含的突變體數(shù)量巨大（通常含104-106個(gè)突變子），用傳統(tǒng)的基于HPLC的篩選方法，去逐一測(cè)定“海量”樣品的活性是十分費(fèi)時(shí)費(fèi)力的，這對(duì)快速、準(zhǔn)確的高通量篩選模型的建立提出了更為迫切的要求［32］。高通量篩選模型的建立將大幅度提高篩選速度，對(duì)篩選和鑒定酶變體具有較好的應(yīng)用潛力。

4 結(jié)論

對(duì)來(lái)源于Bacillus subtilis L-天冬氨酸-α-脫羧酶采用定點(diǎn)突變的方法，得到了2個(gè)突變體panDBs-1和panDBs-2。建立基于比色法原理的微孔板高通量檢測(cè)方法，得到最適檢測(cè)條件為MES緩沖液2 mmol/L，CPR指 示 劑75 μmol/L，L-天 冬 氨 酸75 mmol/L，pH 6.5，溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間10 min，檢測(cè)波長(zhǎng)為567 nm。

該檢測(cè)方法具備一定篩選能力，這將顯著提高篩選速度，對(duì)篩選和鑒定酶變體具有較好的應(yīng)用潛力。