發(fā)光核酸適配體的篩選及應(yīng)用

周子琦 張洋子 蘭欣悅 劉洋兒 朱龍佼 許文濤

（1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；2. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)營養(yǎng)與健康系 食品精準(zhǔn)營養(yǎng)與質(zhì)量控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

先進(jìn)的活細(xì)胞生物分析手段有助于我們更好地了解生命活動(dòng)的運(yùn)作模式、實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)物質(zhì)的原位檢測和成像，對研究細(xì)胞代謝有重要意義，同時(shí)有助于臨床醫(yī)學(xué)的發(fā)展［1-2］。隨著相關(guān)研究的深入，一系列胞內(nèi)成像技術(shù)得到開發(fā)，但技術(shù)存在的局限性不容忽視［3-5］，例如分子信標(biāo)法中的反義序列會(huì)對活細(xì)胞造成致命傷害［6-7］，而常用的蛋白標(biāo)記方法，如MS2-綠色熒光蛋白融合蛋白（MS2- GFP）系統(tǒng)，則會(huì)造成細(xì)胞蛋白表達(dá)超負(fù)荷，且難以直接對目的基因?qū)崿F(xiàn)精準(zhǔn)定位［8］。

核酸發(fā)光適配體（LNAs）的研發(fā)為活細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)原位分析所面臨的挑戰(zhàn)提供了一種適合而新穎的應(yīng)對策略，現(xiàn)如今越來越多的LNAs得到開發(fā)和優(yōu)化。LNAs是一類能夠特異性地結(jié)合熒光團(tuán)等小分子物質(zhì)、誘導(dǎo)和增強(qiáng)其發(fā)光的FNAs［7］。與分子信標(biāo)、熒光蛋白標(biāo)簽和多拷貝融合蛋白系統(tǒng)相比，LNAs提供了一種快速準(zhǔn)確的基因定位方法［9］，甚至一些單拷貝的LNAs在結(jié)合熒光團(tuán)后就能在活細(xì)胞中發(fā)出清晰明亮的熒光［10］，最強(qiáng)的LNA可以將熒光團(tuán)等小分子的熒光強(qiáng)度提高3 000倍［11］。在輸出器件的幫助下，它們可以作為細(xì)胞內(nèi)外的優(yōu)秀生物傳感器，進(jìn)一步應(yīng)用于生物分析。本文綜述了LNAs的篩選過程，總結(jié)了LNAs系統(tǒng)在生物傳感方面的應(yīng)用，分析了當(dāng)前LNAs研究的不足之處，以期能夠拓寬生物傳感研究領(lǐng)域，使LNAs系統(tǒng)成為細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)成像與檢測的優(yōu)秀傳感元件。

1 LNAs的獲得

實(shí)際上，LNAs就是熒光團(tuán)等小分子的適配體［12］，因此可以通過配體指數(shù)富集的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）獲得［13-14］。DNA發(fā)光適配體（DNA light-up aptamers，DLAs）和RNA發(fā)光適配體（RNA light-up aptamers，RLAs）的SELEX條件略有不同 （圖1），應(yīng)用場景與最適檢測物質(zhì)也各有偏重，因此對于不同種類的LNAs來說，最適合的就是最佳的篩選方法。

圖1 采用SELEX等技術(shù)對LNAs進(jìn)行體外篩選Fig. 1 In vitro selection of LNAs using SELEX and other techniques

1.1 DNA發(fā)光適配體的體外篩選

DLAs主要通過基于靶分子與其LNAs之間親和力的親和層析-SELEX獲得［14］，一般方法有珠基- SELEX、目標(biāo)結(jié)合觸發(fā)釋放-SELEX和氧化石墨 烯（graphene oxide，GO）-SELEX［12，15］。前 兩種方法之間最顯著的區(qū)別是固相載體上的對象。珠基-SELEX的工作原理是將靶分子修飾到瓊脂糖珠或磁珠上［16-17］，然后與DNA文庫孵育。例如Sando等［18］利用Hoechst衍生物7，通過生物素-鏈霉親和素（streptavidin-biotin）磁珠-SELEX獲得了Hoechst的第一個(gè)DLAs：I-1-mini。而在目標(biāo)結(jié)合觸發(fā)釋放-SELEX的過程中，DNA文庫與修飾在珠基上的互補(bǔ)序列結(jié)合，當(dāng)序列與靶分子結(jié)合時(shí)就會(huì)被釋放到溶液中，用這種方法，研究者得到了孔雀石 綠（malachite green，MG）［19］、結(jié) 晶 紫（crystal violet，CV）［16］、硫黃素T（thioflavine T，ThT）［15］以及小檗堿（berberine，BBR）［20］的LNAs。與前兩種方法相比，GO-SELEX省去了復(fù)雜的修飾。由于GO可以吸附無結(jié)構(gòu)的單鏈核酸，文庫就可以與GO結(jié)合，在上清液中去除結(jié)構(gòu)化和未結(jié)合的序列后，將氧化石墨烯與目標(biāo)分子混合，使結(jié)構(gòu)化的序列留在上清液中。Islam等［15，21］就用此法篩選得到了ThT的LNA——ThT.2-2。

1.2 RNA發(fā)光適配體的體外篩選

與DLAs相比，RLAs可以依靠轉(zhuǎn)錄在活細(xì)胞內(nèi)大量產(chǎn)出，因此更適合RNA等物質(zhì)的胞內(nèi)檢測。在篩選時(shí)，不僅需要增加轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)，還需要考慮應(yīng)用環(huán)境。細(xì)胞內(nèi)具有多種酶和離子的復(fù)雜環(huán)境使得體外篩選獲得的高度特異性RLAs可能無法正常發(fā)揮作用，此外其他RNA的競爭性結(jié)合還會(huì)導(dǎo)致RLAs的錯(cuò)誤折疊，所以親和力不能作為NALAs的唯一選擇依據(jù)，親和層析-SELEX也不是NALAs的最佳選擇方法［11，22-26］。一些新的或聯(lián)用的方法可以很好地解決上述問題，熒光激活細(xì)胞分選-SELEX（fluorescence activated cell sorting -SELEX，F(xiàn)ACSSELEX）是將RNA文庫作為表達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌中并誘導(dǎo)大規(guī)模轉(zhuǎn)錄的半活體篩選方法，在培養(yǎng)液中加入靶分子就可以觀察細(xì)菌的發(fā)光情況（圖1），F(xiàn)ACS-SELEX可以將RLAs誘導(dǎo)靶分子的光學(xué)特性作為篩選條件，同時(shí)確保它們在細(xì)胞中仍能夠執(zhí)行正常的功能，苯胺取代的磺酰羅丹明（aniline-substituted sulforhodamine，ASR）和綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）熒光團(tuán)衍生物DFHBI-1T的LNAs就是通過此方法獲得的［27-28］。微流體輔助的體外分選-SELEX（microfluidic-assisted in vitro compartmentalization -SELEX，μIVC-SELEX）也是一 種新型RLAs篩選方法，該方法與前兩種方法不同的是，它以小液滴為篩選單位，并可以準(zhǔn)確地測定每一個(gè)單位中LNAs的親和及發(fā)光性能，通過控制外部電壓以及微流控面板上的不同管道來引導(dǎo)液滴流動(dòng)，進(jìn)而完成分選［10，29］。Ryckelynck等利用該方法對GFP熒光團(tuán)衍生物的LNAs——Spinach和Broccoli進(jìn)行了優(yōu)化，并篩選出了磺酰羅丹明B二聚體 Gemini-561的LNA［10，29-30］。

1.3 LNAs的最佳篩選方法

在一定程度上，檢測需求決定了LNAs篩選方法。目前基于LNAs開發(fā)的生物傳感器主要用于細(xì)胞內(nèi)外特定核酸序列、代謝物和小分子毒素的檢測［16，20-21，24，31］。DLAs的應(yīng)用場景顯然比RLAs更廣闊，可以自如地成為體外檢測設(shè)備的基本元件。雖然DNA相比于RNA結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定一些，但是在體外復(fù)雜環(huán)境中單鏈DNA的結(jié)構(gòu)也不夠穩(wěn)定，波動(dòng)的構(gòu)象會(huì)導(dǎo)致靶向效率降低，所以基于目標(biāo)結(jié)合觸發(fā)釋放-SELEX的篩選方法更適合DLAs。這是因?yàn)樵摲椒ūＷC了單鏈DNA的穩(wěn)定性，增加了特異性結(jié)合的選擇壓力，這種方法與珠基-SELEX相比，可以避免因?yàn)槿玖戏肿又谢钚晕稽c(diǎn)較少而結(jié)合不強(qiáng)的情況，使DNA庫可以完全與染料分子接觸［12］。

同時(shí)，基于RLAs的生物傳感器更傾向用于細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)（RNA和蛋白質(zhì)）的成像［2，7，11，23，32-34］。篩選手段的選擇需要綜合考慮RLAs的結(jié)合特異性、結(jié)構(gòu)和發(fā)光穩(wěn)定性以及細(xì)胞毒性。因此，在篩選RLAs時(shí)不應(yīng)局限于一種選擇方法，如FACS-SELEX或μIVC- SELEX。串聯(lián)SELEX（這里指的是將幾種篩選方法串聯(lián)使用）可以通過增加選擇壓力，盡可能模擬細(xì)胞環(huán)境，獲得效能更強(qiáng)的RLAs［27，30］。

2 LNAs系統(tǒng)在生物傳感領(lǐng)域的應(yīng)用

2.1 胞內(nèi)生物成像應(yīng)用

LNAs系統(tǒng)的研發(fā)和使用均始于細(xì)胞。1999年，世界上第一條LNAs誕生在一次生色團(tuán)輔助激光滅活（chromophore-assisted laser inactivation，CALI）實(shí)驗(yàn)中，為了得到細(xì)胞內(nèi)有功能的目的基因，人們獲得了一條MG的適配體，沒想到它可以增強(qiáng)MG的熒光接近2 360倍；到后來，科學(xué)家參透了GFP的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，長肽鏈構(gòu)成的富氧剛性環(huán)境竟為內(nèi)部熒光團(tuán)分子的脫氫、發(fā)光提供了天然的條件，對于GFP的模仿就開始了，越來越多的LNAs被研發(fā)出來，要多適合作為LNAs的熒光團(tuán)或小分子物質(zhì)也得到開發(fā)與合成，并逐漸取代蛋白標(biāo)簽、分子信標(biāo)等手段，廣泛應(yīng)用于胞內(nèi)成像領(lǐng)域［10，13，29，35-41］。在長達(dá)20年的更新?lián)Q代中，無論是在意外獲得的MGA，還是取代GFP的菠菜（GFP熒光團(tuán)DFHBI的LNA，Spinach）［23，42］，它們都提高了細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)成像的準(zhǔn)確性和靈敏度。目前，LNAs系統(tǒng)可以在活細(xì)胞內(nèi)對蛋白質(zhì)和RNA實(shí)現(xiàn)原位成像，還可以用于跟蹤部分小分子代謝物。

LNAs可以作為一種穩(wěn)定的RNA標(biāo)簽，插入目標(biāo)RNA的側(cè)翼序列實(shí)現(xiàn)協(xié)同轉(zhuǎn)錄，在加入相應(yīng)的靶分子后，實(shí)現(xiàn)對胞內(nèi)RNA的實(shí)時(shí)成像［4，6，9］。目前，LNAs系統(tǒng)可以用于追蹤毒性RNA，外來病毒RNA中的rRNA、mRNA，三重核酸重復(fù)序列等等序列（圖2-A）［34，36，39］，Strack等［34］將Spinach與毒性RNA序列中常見的三核酸重復(fù)序列（CGG）60（在此之前該三核酸重復(fù)序列并未深入研究過，該三核酸重復(fù)序列的轉(zhuǎn)錄物可以通過積聚在細(xì)胞核中造成功能蛋白質(zhì)的分離，產(chǎn)生細(xì)胞毒性，進(jìn)而造成細(xì)胞損傷）連接在一起瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，該方法成功檢測到了（CGG）60序列形成的RNA顆粒，并觀測到隨著細(xì)胞分裂該RNA顆粒從分散到聚集的動(dòng)態(tài)變化（圖2-A），為三核酸小分子藥物的研發(fā)提供了非常生動(dòng)直觀的研究基礎(chǔ)；在這之后，Nilaratanakul等［36］將引發(fā)脊髓炎的神經(jīng)元病毒Sindbi病毒的基因組（可產(chǎn)生病毒結(jié)構(gòu)性蛋白）、亞基因組（可產(chǎn)生病毒非結(jié)構(gòu)性蛋白）與搭載了兩個(gè)F30支架的兩個(gè)西蘭花（GFP熒光團(tuán)衍生物DFHBI-1T的LNA，Broccoli）結(jié)合，并將帶有結(jié)合序列的表達(dá)盒插入SINV的cDNA克隆中，獲得具有4-28個(gè)Broccoli拷貝的病毒重組基因組，該病毒重組基因組成功幫助研究人員觀察到了病毒RNA侵染神經(jīng)細(xì)胞的過程和偏好性。除了研究目標(biāo)序列的動(dòng)態(tài)追蹤和定位，LNAs甚至可以作為一簇規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）元件，完成基因座成像，實(shí)現(xiàn)RNA譜系分析和超分辨率成像。值得一提的是，對完整的LNAs序列進(jìn)行劈裂處理，并將劈裂后的序列連在不同RNA序列上，還可以實(shí)現(xiàn)對RNA互作的研究（圖2-D）［43］。

LNAs系統(tǒng)也適用于活細(xì)胞內(nèi)的蛋白成像?？蓪NAs與物質(zhì)特異性適配體或結(jié)合序列連接在一起，在細(xì)胞內(nèi)共轉(zhuǎn)錄，就可以在胞內(nèi)結(jié)合特定物質(zhì)，在染料分子的存在下可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的成像。Jaffrey團(tuán)隊(duì)利用這種方法通過Spinach在體外實(shí)現(xiàn)了鏈霉親和素、凝血酶和大腸桿菌MS2衣殼蛋白（MCP）的成和定量檢測，之后該團(tuán)隊(duì)使用MCP -Spinach來成像活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，并完成了對單個(gè)細(xì)胞內(nèi)源性蛋白表達(dá)變異性的檢測［44］。緊接著在2016年，該團(tuán)隊(duì)使用甲基化修飾的無光版Broccoli開發(fā)了一種高通量檢測RNA修飾酶的方法，無光的Broccoli通過結(jié)合去甲基化脂肪和肥胖相關(guān)蛋白（FTO）或m6A去甲基酶ALKBH5后去甲基化而重新發(fā)光，這種方法還可以用來選擇FTO抑制劑（圖2-B）［45］。

此外，LNAs系統(tǒng)還可以用于檢測細(xì)胞中的小分子代謝物，如5'-二磷酸腺苷（adenosine 5'-diphosphate，ADP），腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-methionine，SAM）［46-47］，環(huán)二鳥苷酸（cyclic di-GMP），環(huán)腺苷酸-鳥苷酸（cyclic AMP-GMP）［48］和硫胺素焦磷酸（thiamine 5'-pyrophosphate，TPP）［49］，可以將小分子代謝物的適配體與LNAs結(jié)合，通過適配體結(jié)合小分子后發(fā)生的構(gòu)象變化，使LNAs形成誘導(dǎo)發(fā)光的正確構(gòu)象實(shí)現(xiàn)結(jié)合發(fā)光。Paige等［46］就是將代謝物適配體與Spinach結(jié)合，并通過打開Spinach的DFHBI結(jié)合環(huán)將兩者連接（圖2-C），該適配體復(fù)合物可動(dòng)態(tài)監(jiān)測活細(xì)胞中的ADP和SAM。

圖2 LNAs系統(tǒng)在活細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)用Fig. 2 Application of LNAs system in living cells

2.2 體外生物傳感應(yīng)用

體外檢測環(huán)境簡單可控，背景值比胞內(nèi)檢測低，這些條件使得LNAs系統(tǒng)在體外檢測中具有更廣闊的應(yīng)用前景［7］。目前LNAs主要在金屬檢測、適配體核酸支架篩選等工作中發(fā)揮重要作用［45，50-51］。

核糖開關(guān)是由非翻譯區(qū)折疊成的具有特定構(gòu)象的RNA序列，核糖開關(guān)在結(jié)合代謝物小分子之后的構(gòu)象變化可以觸發(fā)下游反應(yīng)，對代謝通路產(chǎn)生影響。由此可知，核糖開關(guān)是小分子檢測的最佳選擇。Xu等［50］將Spinach 2與czcD核糖開關(guān)結(jié)合，創(chuàng)造了一種可以檢測多種二價(jià)金屬離子（鐵、錳、鈷、鎳、鋅）的熒光生物傳感器。該核糖開關(guān)由一個(gè)代謝物識別區(qū)域和一個(gè)LNA區(qū)域組成（圖3-A），當(dāng)二價(jià)金屬離子與識別區(qū)域結(jié)合時(shí)，構(gòu)象變化導(dǎo)致一個(gè)新的莖環(huán)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，從而使Spinach 2恢復(fù)與熒光團(tuán)結(jié)合并增強(qiáng)發(fā)光的能力。這也是第一個(gè)可逆的Fe2+響應(yīng)的基因編碼熒光傳感器。

細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的環(huán)境會(huì)使LNAs無法正確折疊而完成成像工作，核酸支架可以幫助LNAs正確折疊且不被細(xì)胞內(nèi)核酸酶水解。常見的核酸支架例如轉(zhuǎn)運(yùn)RNA支架，轉(zhuǎn)運(yùn)RNA即tRNA（transfer RNA），序列可折疊成緊密的立體構(gòu)象，因此具有較高的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。tRNA支架在使用時(shí)，需要我們將目標(biāo)序列與tRNA序列連接在一起，實(shí)現(xiàn)共轉(zhuǎn)錄，重組的tRNA可攜帶目標(biāo)序列免受酶水解帶來的傷害［52］。LNAs系統(tǒng)在凝膠內(nèi)成像方面的應(yīng)用將有助于發(fā)現(xiàn)RNA支架［51］，總RNA電泳凝膠用熒光團(tuán)染色，攜帶LNAs的片段發(fā)光。該方法可用于檢測tRNA等RNA支架在細(xì)胞內(nèi)的降解情況、開發(fā)RNA支架，可以顯著提高LNAs的細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性（圖3-B）。此 外，LNAs系統(tǒng)還可以在Northern blot中作為SYBR Gold染料的替代，用已知的LNA作為核酸標(biāo)簽，之后使用熒光團(tuán)溶液沖洗凝膠。這種染色方法不僅表現(xiàn)出與SYBR Gold法相同的靈敏度和高亮度，而且還能節(jié)約成本。

此外，LNAs系統(tǒng)在無細(xì)胞傳感領(lǐng)域也有很大的應(yīng)用潛力。無細(xì)胞傳感器是通過細(xì)胞內(nèi)各種反應(yīng)的模塊化組裝獲得的一種無需細(xì)胞支持即可實(shí)現(xiàn)快速檢測的傳感器。研究人員開發(fā)了一種基于LNAs系統(tǒng)的、配體誘導(dǎo)的RNA輸出無細(xì)胞傳感器（ROSALIND），用于水中污染物的檢測（圖3-C）。該傳感器由RNA聚合酶、變構(gòu)蛋白轉(zhuǎn)錄因子和DNA轉(zhuǎn)錄模板組成，以三路連接二聚體Broccoli和DFHBI-1T作為發(fā)光基礎(chǔ)。當(dāng)環(huán)境中存在目標(biāo)污染物時(shí)，污染物結(jié)合到轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子上，調(diào)控因子離開轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)，誘導(dǎo)Broccoli的轉(zhuǎn)錄，Broccoli與環(huán)境中的DFHBI-1T結(jié)合產(chǎn)生熒光信號。目前ROSALIND已用于檢測一系列水污染物，包括抗生素、小分子和金屬離子［53］。

圖3 LNAs系統(tǒng)在體外的應(yīng)用Fig. 3 Application of LNAs system in vitro

3 總結(jié)與展望

從一次實(shí)驗(yàn)的意外發(fā)現(xiàn)到如今得到充分的開發(fā)與使用，LNAs已經(jīng)走過了20年。與傳統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)成像探針或蛋白質(zhì)標(biāo)簽相比，它們具有更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和更強(qiáng)的光學(xué)特性。一些特定的富G序列會(huì)在一定條件下折疊形成高級結(jié)構(gòu)——G四鏈體（G-quadruplex，G4），G4結(jié)構(gòu)本身可以結(jié)合染料分子實(shí)現(xiàn)非特異性發(fā)光，例如小檗堿的非特異性發(fā)光［54］，但是作為FNAs的一種［55-56］，LNAs能以比G4更強(qiáng)的親和力與特定靶分子結(jié)合［16，31，42，57］。在篩選方面，μIVC-SELEX和FACS-SELEX等具有高選擇壓力的選擇模式可以幫助我們獲得具有高親和力和強(qiáng)光學(xué)性質(zhì)的LNAs系統(tǒng)［10，27］。而在應(yīng)用方面，LNAs可以直接嵌入靶核酸的側(cè)邊位置，在活細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確的原位檢測［23，58］，也可以與其他適配體或核糖開關(guān)聯(lián)用，用于體外小分子物質(zhì)的檢測。

LNAs系統(tǒng)作為一種全新的檢測工具，還面臨著許多挑戰(zhàn)，比如還需進(jìn)一步探索其互作機(jī)制中不明確的部分：（1）篩選方法需優(yōu)化。LNAs尤其是RLAs，需要在不被核酶降解的情況下，在復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境中正確折疊。因此需要不斷更新體內(nèi)篩選方法。（2）機(jī)制未知，相互作用關(guān)系不明。熒光激活的機(jī)理比較清楚，但LNAs與熒光團(tuán)之間的相互作用需要繼續(xù)研究。（3）未知的細(xì)胞毒性。雖然后期研究中使用的熒光團(tuán)的毒性不如最早的MG，但有必要充分了解它們的毒性。LNAs系統(tǒng)對細(xì)胞內(nèi)RNA和蛋白質(zhì)的影響尚不清楚。（4）應(yīng)用廣度不夠。LNAs系統(tǒng)在胞內(nèi)的研究較多，很少在體外和組織層面進(jìn)行應(yīng)用。解決上述問題將有助于開發(fā)更優(yōu)的LNAs系統(tǒng)。

隨著研究的深入與技術(shù)的進(jìn)步，LNAs與靶分子的互作機(jī)制能夠更加透明，應(yīng)用將逐步從胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到胞外，LNAs將會(huì)成為傳感研究最有力的工具之一。