噬菌體抗體展示技術(shù)及其在抗新冠病毒抗體發(fā)現(xiàn)中的 應(yīng)用

王加利 和似琦 康子茜 王建勛

（北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 102400）

20世紀(jì)90年代初，John McCafferty和Sir. Gregory Winter開(kāi)發(fā)了一種被稱(chēng)為噬菌體抗體展示的體外抗體篩選技術(shù)，該技術(shù)不依賴(lài)于體內(nèi)的免疫反應(yīng)，可用于發(fā)現(xiàn)針對(duì)幾乎所有類(lèi)型抗原及單個(gè)靶點(diǎn)多表位的抗體，已被證明是一種強(qiáng)大的用于發(fā)現(xiàn)全人源抗體的技術(shù)平臺(tái)。2018年10月，Sir Gregory P. Winter因開(kāi)發(fā)了此項(xiàng)技術(shù)獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。該技術(shù)主要通過(guò)在絲狀噬菌體上構(gòu)建抗體組合表達(dá)庫(kù)來(lái)篩選抗原特異性單克隆抗體［1］。由于單克隆抗體分子量（150 kD）較大，在噬菌體表面展示具有一定的挑戰(zhàn)性。因此，在噬菌體上展示的抗體多為保留親和性的較小的抗體片段，如單鏈可變片段（singlechain fragment variable，scFv）、抗原結(jié)合片段（fragment antigen binding，F(xiàn)ab）和 單 域 抗 體（single domain antibody，sdAb）。這些抗體片段具有較小的尺寸（15-50 kD），往往具有更好的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)特性。與多克隆抗體和單克隆抗體相比，基于噬菌體展示技術(shù)的重組抗體片段生產(chǎn)速度更快，程序更自動(dòng)化，且減少了對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的利用。首個(gè)獲美國(guó)食品藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)上市的全人源抗腫瘤壞死因子-α（anti-tumor necrosis factor-α，TNF-α）單克隆抗體阿達(dá)木單抗即通過(guò)該技術(shù)發(fā)現(xiàn)。截至2020年，共有70多個(gè)通過(guò)噬菌體抗體展示技術(shù)發(fā)現(xiàn)的單克隆抗體進(jìn)入臨床研究，其中14個(gè)已經(jīng)獲得批準(zhǔn)［2］。

重癥急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）引起的 2019 冠狀病毒?。–oronavirus Disease 2019，COVID-19）仍在全球肆虐，成為目前最受關(guān)注的突發(fā)傳染性疾病。截至 2021 年6月21日，已有 178 503 429例確診病例，其中死亡 3 872 457例。（數(shù)據(jù)來(lái)源：https：//covid19.who.int/）。自新冠病毒爆發(fā)以來(lái)，國(guó)內(nèi)外多家研究機(jī)構(gòu)和企業(yè)對(duì)其開(kāi)展了流行病學(xué)和藥理學(xué)研究，其中包括治療和預(yù)防SARSCoV-2疫苗和抗體藥物的研究。雖然目前已有多種疫苗成功上市，但這些疫苗的保護(hù)率均無(wú)法達(dá)到100%，因此中和抗體的研究十分必要。并且相比新冠疫苗，中和抗體療法具有預(yù)防和治療的雙重作用。噬菌體抗體展示技術(shù)已被廣泛用于發(fā)現(xiàn)抗病毒感染的中和抗體，如流感［3］、麻疹［4］和狂犬?。?］等。在此次疫情中，研究人員也同樣通過(guò)該技術(shù)篩選抗新冠病毒中和抗體。目前已有多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)獲得該中和抗體，并進(jìn)入臨床前研究階段。

本文闡述了噬菌體抗體展示技術(shù)的基本原理，抗體庫(kù)的構(gòu)建、分類(lèi)及淘篩流程，同時(shí)對(duì)該技術(shù)的優(yōu)勢(shì)及局限性進(jìn)行了分析。另外，總結(jié)了自新冠肺炎爆發(fā)以來(lái)，噬菌體抗體展示技術(shù)在研發(fā)新冠病毒中和抗體研究中的應(yīng)用情況。

1 噬菌體抗體展示技術(shù)原理

噬菌體抗體展示技術(shù)通過(guò)將抗體基因序列插入到噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因中，使抗體與噬菌體的外殼蛋白形成融合蛋白，并隨著子代噬菌體的重新組裝展示在噬菌體表面，同時(shí)又可以保持相對(duì)的空間結(jié)構(gòu)和生物活性。該技術(shù)的突破性貢獻(xiàn)在于建立體外抗體功能和其對(duì)應(yīng)的遺傳信息的直接聯(lián)系，其核心是基于噬菌體的生物學(xué)特征。T4、T7、λ，以及絲狀M13噬菌體均可用于噬菌體展示，其中M13噬菌體在噬菌體抗體展示技術(shù)中應(yīng)用最廣泛［6］。

1.1 M13絲狀噬菌體

M13絲狀噬菌體是一種圓柱形病毒粒子，包含一個(gè)環(huán)狀單鏈DNA分子（6 407個(gè)堿基對(duì)），由9個(gè)基因組成，編碼5種衣殼蛋白（pIII、pVIII、pVI、pVII和pIX）以及6個(gè)組裝和復(fù)制蛋白［7-8］。主要衣殼蛋白pVIII以2 700個(gè)拷貝在DNA周?chē)纬梢粋€(gè)管狀結(jié)構(gòu)，呈重疊的螺旋排列。而其他4種次要衣殼蛋白均有5個(gè)拷貝，pVII和pIX位于衣殼的一端，pIII和pVI位于衣殼的另一端。大多數(shù)噬菌體抗體展示系統(tǒng)都是將抗體序列融合到pIII衣殼蛋白的N端，這是由于pIII蛋白結(jié)構(gòu)的靈活性和它在不喪失其功能的情況下展示大蛋白的能力［9］。

1.2 M13噬菌體展示系統(tǒng)

在早期的研究中，抗體基因被直接克隆到絲狀噬菌體基因組中。由于每個(gè)噬菌體通常包含5個(gè)G3P拷貝，所以使用噬菌體載體會(huì)出現(xiàn)抗體-G3P融合蛋白的多價(jià)展示。盡管這樣的多價(jià)展示系統(tǒng)會(huì)干擾pIII-F菌毛的相互作用，從而對(duì)噬菌體侵染性和抗體庫(kù)多樣性產(chǎn)生負(fù)面影響［10］。但使用噬菌體系統(tǒng)的主要問(wèn)題是克隆大量外源性DNA到噬菌體基因組可能產(chǎn)生的有害影響，如遺傳不穩(wěn)定等［11］。為了避免這些問(wèn)題，具有單價(jià)展示特性的噬菌粒載體系統(tǒng)現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于噬菌體抗體展示技術(shù)中。

噬菌粒（phagemid）包含3個(gè)關(guān)鍵元素：（1）用于質(zhì)粒篩選和擴(kuò)增的抗生素標(biāo)記；（2）抗體- G3P融合蛋白的編碼基因；（3）啟動(dòng)滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)生ss-DNA的M13 復(fù)制起點(diǎn)。在沒(méi)有其他噬菌體蛋白的情況下，噬菌粒會(huì)像質(zhì)粒一樣進(jìn)行擴(kuò)增。為了制備展示抗體- G3P融合蛋白的功能性噬菌體，攜帶噬菌粒載體的大腸桿菌必須被輔助噬菌體感染。輔助噬菌體包含完整的M13基因組，具有編碼衣殼生成、噬菌體裝配、染色體復(fù)制和出芽所需的所有噬菌體蛋白。最常用的輔助噬菌體是M13KO7，它是M13的衍生物［12］。由于輔助噬菌體的野生型pIII基因的表達(dá)水平優(yōu)于噬菌粒編碼的pIII-抗體融合基因，所以90%的子代噬菌體沒(méi)有展示抗體- G3P融合蛋白，而且絕大多數(shù)攜帶抗體- G3P融合蛋白的噬菌體均為單價(jià)展示［13］。目前利用超級(jí)輔助噬菌體可以將噬菌粒載體系統(tǒng)的抗體展示水平恢復(fù)到與噬菌體載體系統(tǒng)相同的水平［14］。然而，在構(gòu)建噬菌體抗體庫(kù)中單價(jià)展示依然是最受歡迎的展示系統(tǒng)，因?yàn)樗试S選擇更高親和力的抗體［15］。

2 噬菌體抗體庫(kù)

基于噬菌體抗體展示技術(shù)原理，研究人員通常在絲狀噬菌體上構(gòu)建抗體庫(kù)來(lái)篩選抗原特異性單克隆抗體。

2.1 噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建

噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建包括：（1）提取B細(xì)胞mRNA（可來(lái)源于免疫或未免疫的人或動(dòng)物），（2）用隨機(jī)引物將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，（3）設(shè)計(jì)合適的引物從cDNA文庫(kù)中PCR擴(kuò)增得到抗體V片段基因，（4）將基因克隆至噬菌粒載體中，（5）噬菌粒電轉(zhuǎn)TG1感受態(tài)細(xì)胞，（6）用輔助噬菌體感染對(duì)數(shù)期TG1細(xì)胞，擴(kuò)增純化得到噬菌體抗體庫(kù)。

成功構(gòu)建一個(gè)大型多樣化的噬菌體抗體庫(kù)的關(guān)鍵在于：（1）PCR擴(kuò)增出多樣化的抗體基因組合庫(kù)；（2）抗體基因片段與噬菌粒載體的高效連接；（3）制備超高效率的電轉(zhuǎn)感受態(tài)，提高電轉(zhuǎn)效率［16］。噬菌體抗體庫(kù)質(zhì)量評(píng)價(jià)的最佳標(biāo)準(zhǔn)是能否從中篩選出具有研究?jī)r(jià)值的抗體。

2.2 噬菌體抗體庫(kù)分類(lèi)

噬菌體展示抗體庫(kù)可以根據(jù)獲得的抗體基因來(lái)源進(jìn)行分類(lèi)，主要包括：天然文庫(kù)，免疫文庫(kù)，半合成和全合成文庫(kù)。

天然文庫(kù)，也被稱(chēng)為通用文庫(kù)，是由未免疫的健康人或動(dòng)物的外周血淋巴細(xì)胞、脾臟和骨髓細(xì)胞中B細(xì)胞的IgM mRNA構(gòu)建。由于天然文庫(kù)的抗體基因來(lái)源于未免疫者，所以該文庫(kù)中的抗體不偏向于任何特定的靶標(biāo)，可用于分離針對(duì)所有類(lèi)型抗原的抗體，也包括非免疫原性、疏水靶點(diǎn)和毒性抗原的抗體［17］。但從天然文庫(kù)獲得的抗體因在體內(nèi)的親和力不夠成熟，往往較免疫庫(kù)抗體的親和力弱［18］。通常為了建立一個(gè)高度多樣化的天然噬菌體抗體文庫(kù)，研究人員會(huì)使用大量來(lái)自不同種族的抗體基因，并在文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中最大限度地提高抗體基因擴(kuò)增的效率［19］。從實(shí)用的角度來(lái)看，天然庫(kù)是開(kāi)發(fā)抗體的首選文庫(kù)，因?yàn)樗梢葬槍?duì)多種疾病循環(huán)利用。

免疫文庫(kù)是由免疫的人或動(dòng)物的血細(xì)胞樣本中IgG基因的mRNA構(gòu)建。由于VH和VL基因片段在體內(nèi)經(jīng)歷了自然的親和力成熟過(guò)程，這些抗體往往比從類(lèi)似大小的天然文庫(kù)中分離的抗體具有更高的親和力［20］。免疫文庫(kù)的規(guī)模通常相對(duì)較小，但可通過(guò)從多個(gè)個(gè)體或宿主動(dòng)物中獲取免疫球蛋白基因，來(lái)進(jìn)一步提高抗體庫(kù)的庫(kù)容和多樣性。免疫庫(kù)的缺點(diǎn)是需要免疫，且有時(shí)引起的免疫反應(yīng)是不可預(yù)測(cè)的或不正確的。而且，由于倫理問(wèn)題、高成本和繁瑣的程序等原因，我們不可能為每種疾病建立免疫庫(kù)，因此構(gòu)建天然文庫(kù)成為研究者的另一種選擇［21］。在醫(yī)學(xué)研究中，免疫庫(kù)常用于分離抗感染性疾病的抗體以及針對(duì)癌癥靶點(diǎn)的抗體［22-23］。

半合成抗體庫(kù)由天然抗體序列和合成抗體序列組合構(gòu)建。被報(bào)道的半合成庫(kù)多通過(guò)人工合成隨機(jī)化CDR3，再與胚系可變區(qū)基因（CDR1和CDR2）組合，然后在體外模擬V（D）J重組構(gòu)建［24］。在全合成抗體庫(kù)中，抗體基因的全部序列均由人工合成。半合成庫(kù)和全合成庫(kù)增加了抗體基因的多樣性，且不受人抗體基因種類(lèi)的限制，具有極大的發(fā)展優(yōu)勢(shì)［25］。但因抗體基因序列是人工隨機(jī)合成的，可能會(huì)導(dǎo)致部分克隆沒(méi)有生物學(xué)活性［26］。半合成文庫(kù)和全合成文庫(kù)是篩選針對(duì)自身抗原抗體的首選 文庫(kù)［27］。

2.3 噬菌體抗體庫(kù)的抗體片段形式

自1990年以來(lái)，不同的抗體形式已被用于構(gòu)建噬菌體抗體展示文庫(kù)。由于大腸桿菌在折疊和分泌復(fù)雜的抗體時(shí)存在很強(qiáng)的偏倚，所以在大腸桿菌中很難實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)全長(zhǎng)IgG。因此，目前在噬菌體表面展示的均為抗體片段，如單鏈可變片段（scFv）、抗原結(jié)合片段（Fab）和單域抗體（sdAb）。

scFv是由抗體輕鏈可變區(qū)（VL）和重鏈可變區(qū)（VH）通過(guò)10-25個(gè)氨基酸組成的短而靈活的甘氨酸連接肽（linker）連接而成的單一肽鏈［28］。由于單鏈抗體體積小，其可以與隱蔽的或空間受限的抗原表位結(jié)合［29］。單鏈抗體在非目標(biāo)組織滯留時(shí)間短且半衰期短，使其可應(yīng)用于成像、藥物靶向輸送［30］、放射性核苷酸［31］以及毒素［32］等應(yīng)用中。Fabs由抗體的整個(gè)輕鏈和位于鏈N端的兩個(gè)區(qū)域（VH和CH1）組成。噬菌體外殼蛋白上顯示的Fab抗體片段具有較高的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，并且很容易轉(zhuǎn)換為完整的IgG抗體，并不會(huì)影響其結(jié)合活性［33］。重組抗體片段的另一種常見(jiàn)形式為單域抗體（sdAbs），也被稱(chēng)為納米抗體，其來(lái)源于駱駝和鯊魚(yú)體內(nèi)重鏈抗體（HCAbs）的可變區(qū)。由于其分子量?。ā?12-15 kD），在溶解度、穩(wěn)定性和靶標(biāo)可及性方面表現(xiàn)出一些優(yōu)勢(shì)［34］。

從噬菌體抗體庫(kù)中篩選的抗體片段可以直接用于各種應(yīng)用，也可以根據(jù)需要工程轉(zhuǎn)換成其他不同的形式，如全長(zhǎng)單克隆抗體IgG、多價(jià)抗體、多特異性抗體以及免疫偶聯(lián)物［35］。

3 特異性抗體的淘選

從噬菌體抗體庫(kù)中獲得抗原特異性抗體需要經(jīng)過(guò)生物淘選（biopanning）。淘選所用抗原可以是不同的形式，如純化的蛋白、合成的多肽、組織或全細(xì)胞［36］。通常體外淘選需要將目標(biāo)抗原固定在固體表面，如磁珠、聚苯乙烯管或板。但當(dāng)純化蛋白較難獲得或其在固體表面附著可能發(fā)生構(gòu)象改變時(shí)，也可以在溶液中進(jìn)行淘選，如使用含蛋白G/A、鏈霉親和素的磁珠。包被好抗原后，需使用封閉液封閉固體表面的剩余位點(diǎn)，如BSA、牛奶或酪蛋白，以防止非特異性噬菌體結(jié)合到表面［37］。當(dāng)加入噬菌體抗體庫(kù)與固定的抗原相互作用后，大量的未結(jié)合或弱結(jié)合噬菌體必須通過(guò)嚴(yán)格的洗滌去除。隨后，結(jié)合的噬菌體可通過(guò)胰蛋白酶酶解或其他洗脫方法（如稀酸或稀堿）洗脫［13］。然后重新感染大腸桿菌，加入輔助噬菌體后擴(kuò)增形成一個(gè)次級(jí)噬菌體抗體庫(kù)，用于下一輪淘選。通常經(jīng)過(guò)3-5輪淘選，文庫(kù)中展示抗原特異性抗體的噬菌體達(dá)到顯著富集。完成生物淘選的陽(yáng)性噬菌體文庫(kù)通過(guò)感染TG1細(xì)胞后挑選單克隆，然后利用噬菌體ELISA法進(jìn)行高通量篩選。得到的陽(yáng)性克隆通過(guò)測(cè)序可獲得抗體基因序列，以便對(duì)其進(jìn)行下一步的基因工程改造。例如，陽(yáng)性克隆的單鏈抗體基因可以被重新克隆到細(xì)菌表達(dá)載體中用于大規(guī)模生產(chǎn)，或者通過(guò)將可變區(qū)插入到含有抗體恒定區(qū)的表達(dá)載體中來(lái)重組成完整的單抗［38］。

最優(yōu)淘選策略取決于許多參數(shù)，包括目標(biāo)抗原濃度、抗原固定表面的類(lèi)型、庫(kù)的質(zhì)量以及結(jié)合和洗滌條件［39］。因?yàn)椴倏v洗滌條件可以控制結(jié)合特性，所以為了分離出高親和力的噬菌體抗體，每輪生物淘選的洗滌強(qiáng)度都應(yīng)逐漸增加［40］。另外還可使用不同的洗滌條件，如改變pH值或與游離抗原競(jìng)爭(zhēng)等。生物淘選過(guò)程的另一個(gè)重點(diǎn)是抗原濃度，一般隨著淘選次數(shù)的增加，抗原濃度應(yīng)該逐漸降低?？傊ㄟ^(guò)靈活調(diào)節(jié)淘選壓力，我們可以從噬菌體文庫(kù)中得到更多或者親和力更強(qiáng)或者有某種特性的抗體。

4 噬菌體抗體展示技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)和局限性

噬菌體抗體展示技術(shù)不論是作為抗體發(fā)現(xiàn)的有力工具，還是作為抗體工程改造中的篩選工具，都有著傳統(tǒng)技術(shù)無(wú)可替代的優(yōu)勢(shì)。其優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：（1）該技術(shù)對(duì)人或動(dòng)物的B細(xì)胞抗體基因庫(kù)進(jìn)行體外建庫(kù)篩選，避免了免疫和細(xì)胞融合等步驟，大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期。且從構(gòu)建的人源抗體庫(kù)中可直接獲得全人源抗體，免去了抗體人源化過(guò)程。（2）通過(guò)嚴(yán)格控制體外淘選條件可預(yù)先設(shè)計(jì)抗體特性，包括抗原表位特異性［41］，甚至構(gòu)象特異性［42］和種間交叉反應(yīng)等［43］。（3）可被用于發(fā)現(xiàn)具有細(xì)微構(gòu)象差異的靶標(biāo)抗體，典型的例子是針對(duì)阿爾茨海默病肽聚集體的抗體和針對(duì)馬爾堡病毒的納米抗體［44-45］。（4）可通過(guò)隨機(jī)致突變技術(shù)，鏈置換或PCR錯(cuò)配等改變抗體親和力，模擬抗體體內(nèi)親和力成熟過(guò)程，篩選出親和力更高的抗體［46］。（5）使用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)使該技術(shù)在成本效益和可擴(kuò)展性方面優(yōu)于其他真核展示方法，如酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示。

噬菌體抗體展示技術(shù)的局限性包括以下幾點(diǎn)：（1）與基于細(xì)胞的抗體制備技術(shù)相比，噬菌體抗體庫(kù)的篩選過(guò)程比較繁瑣［47］。（2）該技術(shù)無(wú)法控制生物淘選過(guò)程中的富集程度，這導(dǎo)致一些克隆在生物淘選過(guò)程中占主導(dǎo)地位，從而在淘選結(jié)束時(shí)只有少數(shù)陽(yáng)性克隆。（3）在構(gòu)建的抗體庫(kù)中，抗體可變重鏈（VH）和可變輕鏈（VL）基因通過(guò)PCR隨機(jī)重組，雖然增加了庫(kù)的多樣性，但也破壞了抗體分子的天然狀態(tài)，使其穩(wěn)定性難以保證。（4）噬菌體抗體展示過(guò)程必須經(jīng)過(guò)細(xì)菌轉(zhuǎn)化、噬菌體包裝，這大大限制了所建抗體庫(kù)的庫(kù)容和多樣性。

5 在抗新冠病毒抗體發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用

SARS-CoV-2屬于冠狀病毒科β冠狀病毒屬，是一種單鏈RNA包膜病毒，可通過(guò)表面的刺突蛋白（S蛋白）與宿主細(xì)胞受體血管緊張素轉(zhuǎn)換酶-2（angiotensin converting enzyme-2，ACE-2）結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞［48］。S蛋白包含S1和S2兩個(gè)亞基，其中S1亞基C-端區(qū)的受體結(jié)合域（receptor binding domain，RBD）主要負(fù)責(zé)與宿主細(xì)胞受體結(jié)合，是目前篩選新冠中和抗體的主要靶點(diǎn)［49］。目前，國(guó)內(nèi)外多家研究機(jī)構(gòu)和企業(yè)正在加快推進(jìn)新冠病毒中和抗體藥物的開(kāi)發(fā)。噬菌體抗體展示技術(shù)在篩選抗病毒感染抗體方面有其獨(dú)特的優(yōu)越性，在此次疫情中也發(fā)揮了其強(qiáng)大的功能。

中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所的研究人員利用重組RBD蛋白免疫的小鼠外周淋巴細(xì)胞的RNA構(gòu)建了一個(gè)Fab噬菌體抗體庫(kù)，然后以RBD作為靶點(diǎn)對(duì)抗體庫(kù)進(jìn)行篩選，篩選出與 RBD特異性結(jié)合的抗體（H014）后對(duì)其進(jìn)行人源化，通過(guò)新冠病毒假病毒和真病毒中和試驗(yàn)測(cè)試其中和活性分別為 3 nmol/L和38 nmol/L［50］。匹茲堡大學(xué)的研究者同樣以SARSCoV-2 RBD蛋白為篩選靶點(diǎn)，6 d內(nèi)從8個(gè)天然噬菌體展示抗體文庫(kù)（Fab、scFv和VH文庫(kù)）中篩選出多個(gè)全人源單克隆抗體。其中，IgG1 ab1對(duì)SARSCoV-2活病毒有很好的中和效果，IC50約為200 ng/mL。在hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠的動(dòng)物試驗(yàn)中，也展示了抑制病毒感染的能力，在預(yù)先注射中和抗體之后，5只小鼠中只有一只被新冠病毒所感染［51］。秦成峰課題組通過(guò)構(gòu)建新冠病毒免疫Fab噬箘體抗體庫(kù)，篩選出一種對(duì)活病毒中和效價(jià)可達(dá)0.22 nmol/L的高效中和抗體HB27。值得注意的是，HB27也可以防止SARS-CoV-2膜融合。在兩個(gè)已建立的小鼠模型中，單劑量的HB27對(duì)SARS-CoV-2具有有效的保護(hù)作用，且10倍有效劑量的HB27在恒河猴中并未發(fā)生明顯不良反應(yīng)。目前該抗體已經(jīng)在中國(guó)和美國(guó)進(jìn)入臨床研究，是一種很有前途的抗COVID-19免疫療法的候選藥物［52］。Parray 等［53］從天然人源半合成噬菌體抗體庫(kù)中篩選出對(duì)新冠RBD具有高親和力的單鏈抗體片段II62，并將其進(jìn)一步設(shè)計(jì)成另外兩種抗體形式，scFv- Fc和IgG1。在不同的檢測(cè)系統(tǒng)中，3種抗體均對(duì)SARS-CoV-2 RBD和S蛋白具有較高的結(jié)合活性。

納米抗體（Nanobodies，Nbs）體積較?。?3-15 kD），具有優(yōu)良的物理和化學(xué)性能，可霧化吸入，直接應(yīng)用于感染部位，且生物利用度高，患者依從性高。它在治療呼吸道病毒方面具有非常吸引人的潛力［54］。近年來(lái)，它們對(duì)呼吸道病原體的應(yīng)用研究也在加速。例如，使用納米抗體對(duì)抗MERSCoV［55］、H1N1［56］、H5N1［57］、流感［58］等。因此，通過(guò)噬菌體抗體展示技術(shù)開(kāi)發(fā)高效的抗新冠病毒納米抗體成為許多科研工作者的研究方向。Wrapp等［59］使用SARS-CoV-1 和MERS-CoV S蛋白對(duì)駱駝進(jìn)行免疫，構(gòu)建了一個(gè)駝源噬菌體納米抗體庫(kù)，通過(guò)兩輪淘選獲得多個(gè)抗S蛋白的納米抗體，其中包括VHH-72。他們還發(fā)現(xiàn)VHH72對(duì)SARS-CoV-1 和SARS-CoV-2 S蛋白存在交叉反應(yīng)，且將VHH72轉(zhuǎn)化為二價(jià)人IgG Fc融合體后能更有效地中和SARSCoV-2假病毒S蛋白，IC50約為0.2 μg/mL。此外，Huo等［60］利用SARS-CoV-2 RBD作為篩選靶標(biāo)，從羊駝天然噬菌體納米抗體庫(kù)中分離出兩個(gè)納米抗體，H11-D4和H11-H4。它們結(jié)合RBD（KD分別為39和12 nmol/L）并在體外阻斷S蛋白與ACE2的結(jié)合。這兩種抗體與Fc融合后均能中和SARSCoV-2活病毒，H11-H4的中和活性為4-6 nmol/L，而H11-D4的中和活性為18 nmol/L。Hanke等［61］用SARS-CoV-2 S1-Fc和RBD蛋白免疫羊駝，通過(guò)對(duì)構(gòu)建的噬菌體納米抗體庫(kù)進(jìn)行連續(xù)兩輪的淘選后，結(jié)合ELISA實(shí)驗(yàn)篩選出納米抗體Ty1。他們發(fā)現(xiàn)Ty1對(duì)SARS-CoV-2假病毒的中和作用可達(dá)0.77 μg/mL（54 nmol/L），而Ty1-Fc有效中和作用可進(jìn)一步提高到約12 ng/mL。低溫電鏡的結(jié)構(gòu)顯示，Ty1可以與“向上”或“向下”構(gòu)象的RBD結(jié)合，并在空間上阻礙RBD- ACE2的結(jié)合。同樣，上海羅奇生物醫(yī)學(xué)科技有限公司使用SARS-CoV-2 RBD蛋白免疫駱駝后，從構(gòu)建的噬菌體納米抗體庫(kù)中鑒定出381個(gè)與RBD特異性結(jié)合的Nbs，其中Nb11-59對(duì)SARS-CoV-2真病毒具有較強(qiáng)中和活性，約為0.55 μg/mL［62］。Dong等［63］從兩個(gè)羊駝VHH文庫(kù)（天然和合成）中發(fā)現(xiàn)了80多種針對(duì)SARS-CoV-2 S1蛋白的VHH抗體，其中19種可阻止S/ACE2 的結(jié)合。為了分析不同VHH抗體的協(xié)同效應(yīng)，他們構(gòu)建了雙特異性VHHFc抗體，該抗體對(duì)SARS-CoV-2 RBD的結(jié)合和S/ACE2 的阻斷明顯強(qiáng)于單價(jià)VHH-Fc抗體。其他研究人員也嘗試設(shè)計(jì)多價(jià)、多特異性Nbs來(lái)中和SARSCoV-2。如Koenig等［64］利用SARS-CoV-2 RBD和福爾馬林滅活的SARS-CoV-2免疫羊駝，通過(guò)對(duì)噬菌體納米抗體庫(kù)的淘選，發(fā)現(xiàn)了4種Nbs（VHHs E、U、V和W）能有效中和SARS-CoV-2真病毒和假病毒。這4個(gè)Nbs結(jié)合RBD上兩個(gè)不同的表位。他們?cè)O(shè)計(jì)了多種二價(jià)、三價(jià)和多特異性的Nbs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VHH EEE（三價(jià)抗體）中和SARS-CoV-2假病毒的活性最高，IC50約為0.52 nmol/L。以上報(bào)道顯示出了對(duì)SARS-CoV-2具有中和作用的Nbs作為抗COVID-19潛在療法的潛力?；谑删w抗體展示技術(shù)發(fā)現(xiàn)靶向SARS-CoV-2 刺突蛋白抗體的臨床前研究如表1所示。

表1 噬菌體展示來(lái)源的靶向SARS-CoV-2刺突蛋白抗體的臨床前研究Table 1 Preclinical studies of phage display-derived antibodies targeting the spike protein of SARS-CoV-2

6 結(jié)論與展望

噬菌體抗體展示技術(shù)是最早也是應(yīng)用最廣泛的體外抗體篩選技術(shù)，其無(wú)論是作為抗體發(fā)現(xiàn)的源頭技術(shù)，還是作為抗體工程中抗體特性改造中的篩選工具，都有著無(wú)可替代的優(yōu)勢(shì)和多領(lǐng)域的應(yīng)用。大量臨床開(kāi)發(fā)中的噬菌體展示衍生抗體證明了這種體外篩選技術(shù)在發(fā)現(xiàn)治療性抗體方面的價(jià)值。一個(gè)龐大的多樣性噬菌體抗體庫(kù)，在短時(shí)間內(nèi)可篩選出大量針對(duì)各種抗原的重組抗體。而且它不需要通過(guò)免疫就能分離出針對(duì)多種類(lèi)型抗原的人類(lèi)抗體，這使它與轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)、抗體人源化技術(shù)和單個(gè)B細(xì)胞技術(shù)一起成為發(fā)現(xiàn)人類(lèi)治療性抗體的主要平臺(tái)［65］。過(guò)去由于噬菌體展示技術(shù)的商業(yè)應(yīng)用僅限于少數(shù)擁有其技術(shù)專(zhuān)利的公司，導(dǎo)致其發(fā)展受限。但近年來(lái)，隨著歐洲和美國(guó)的大部分噬菌體展示技術(shù)專(zhuān)利已經(jīng)過(guò)期，促使該技術(shù)在抗體藥物研發(fā)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。許多研究機(jī)構(gòu)、初創(chuàng)企業(yè)和工業(yè)實(shí)驗(yàn)室都在不斷對(duì)噬菌體抗體文庫(kù)的設(shè)計(jì)、構(gòu)建和篩選進(jìn)行優(yōu)化。由于其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，相信該技術(shù)在今后單抗的研發(fā)和生產(chǎn)中會(huì)愈發(fā)地受到重視。

在抗擊新冠疫情的療法開(kāi)發(fā)方面，中和抗體的開(kāi)發(fā)一直是研發(fā)的重心之一。因?yàn)槠淇膳c疫苗一起形成雙重防御性的治療和保護(hù)作用。通過(guò)噬菌體抗體展示技術(shù)，不少研究者發(fā)現(xiàn)了對(duì)SARS-CoV-2中和活性較好的抗體，其中以納米抗體居多。鑒于納米抗體較穩(wěn)定、具有容易表達(dá)和折疊的特性，有些研究者利用它們構(gòu)建多價(jià)或多特異性分子，大大提高了對(duì)SARS-CoV-2的中和活性。雖然納米抗體可霧化吸入，直接應(yīng)用于感染部位，但我們還需要通過(guò)進(jìn)一步的研究來(lái)評(píng)估開(kāi)發(fā)基于納米抗體的吸入藥物治療COVID-19的可行性。另外，有研究者認(rèn)為噬菌體抗體展示技術(shù)在分離針對(duì)多種SARS相關(guān)冠狀病毒或SARS-CoV-2多種變異/突變體的交叉反應(yīng)抗體方面比其他篩選策略具有優(yōu)勢(shì)［66］?？傊?，噬菌體抗體展示技術(shù)作為一個(gè)多功能強(qiáng)大的抗體篩選平臺(tái)，為發(fā)現(xiàn)和設(shè)計(jì)新的具有更好藥代動(dòng)力學(xué)特性、安全性和有效性的重組抗體分子提供了巨大的機(jī)會(huì)。