CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)及其在微藻研究中的應(yīng)用

陳映丹 張揚 夏嬙 孫虹霞

（1. 遵義醫(yī)科大學珠海校區(qū) 免疫與病原生物學教研室，珠海 519041；2. 中國科學院南海海洋研究所 中國科學院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室，廣州 510301）

基因編輯技術(shù)是指在基因水平上，對目標基因進行精確插入、刪除和修飾，從而改變基因的結(jié)構(gòu)與功能的生物技術(shù)。近年來，基因編輯技術(shù)已從鋅指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN）技術(shù)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（ranscription activator-like effector nucleases，TALEN）技術(shù)，發(fā)展到成簇的規(guī)律間隔的短回文重復序列CRISPR/Cas（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated）核酸酶系統(tǒng)。其中，ZFN和TALEN技術(shù)依賴于DNA序列與蛋白質(zhì)模板的特異性結(jié)合，設(shè)計和組裝非常繁瑣，且成本較高。相比之下，CRISPR/Cas技術(shù)作為一種新興的基因組編輯工具，能夠引導gRNA對DNA的識別及編輯，具有成本低、設(shè)計簡單、高效、特異的顯著優(yōu)勢。

微藻作為初級生產(chǎn)者［1］，種類繁多，約有5萬余種，且分布廣泛，生存條件多樣化，甚至可在高溫、高鹽等極端條件下生存。目前，其在食品、工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學等多個領(lǐng)域均有應(yīng)用［2］，具有改善免疫功能、預防心血管疾病、調(diào)節(jié)土壤理化性能、生產(chǎn)生物柴油、降解重金屬等功效［3-10］。另一方面，隨著人口的增長，資源儲備的枯竭，以及土地資源和自然環(huán)境資源等的不可再生性，使得人們面臨著資源短缺和環(huán)境污染的巨大挑戰(zhàn)，對微藻進行遺傳改良，以尋找可替代的資源，成為了人們應(yīng)對挑戰(zhàn)的重要舉措之一。然而，野生微藻因其自身碳固定率、油脂積累率和產(chǎn)氫效率都較低，加之商業(yè)成本高昂等原因，嚴重影響了其大規(guī)模應(yīng)用。因此，尋找并利用一種強大、廉價、精確的基因編輯技術(shù)，建立更加經(jīng)濟綠色的生產(chǎn)工藝，是克服這些問題并實現(xiàn)后期大規(guī)模生產(chǎn)的重要策略，其中，CRISPR系統(tǒng)的優(yōu)越性，無疑可為微藻的遺傳改良和應(yīng)用提供重要的支持。

鑒于此，本文在簡要介紹CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)的發(fā)展歷程的基礎(chǔ)上，討論了在微藻中應(yīng)用較為成熟的Cas9和Cpf1兩種系統(tǒng)的不同特征，著重闡述了CRISPR技術(shù)在微藻領(lǐng)域的發(fā)展方向和應(yīng)用，并探討了CRISPR基因編輯技術(shù)在微藻生物資源開發(fā)利用上的發(fā)展前景，以期為CRISPR/Cas系統(tǒng)在微藻基因編輯的相關(guān)研究提供參考。

1 CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)概述

1.1 CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)的發(fā)展歷程

CRISPR/Cas可通過特異性RNA引導Csa蛋白對DNA進行靶向切割，是迄今為止已知的原核生物中唯一的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。自1987年，Ishino等［11］在研究大腸桿菌堿性磷酸酶同工酶轉(zhuǎn)化時，發(fā)現(xiàn)了串聯(lián)的、間隔的短回文重復序列，并在其他細菌中得到鑒定［12-17］。但直到2002年，才正式將存在于細菌和古細菌中的有規(guī)律的重復序列命名為成簇的規(guī)律間隔的短回文重復序列CRISPR，并首次發(fā)現(xiàn)在其附近還有CRISPR相關(guān)基因Cas［18］。之后，西班牙學者Mojica等［19］發(fā)現(xiàn)CRISPR間隔序列與噬菌體和外來質(zhì)粒序列具有同源性，推測CRISPR可能與細菌的免疫防御有關(guān)聯(lián)。隨后，Barrangou等［20］證明了CRISPR/Cas系統(tǒng)參與了細菌對噬菌體免疫防御作用的功效。2008年和2010年，CRISPR的干擾工作［21］及其干擾機制［22］分別得到了揭示。此時，科研人員已經(jīng)對CRISPR/Cas系統(tǒng)的作用機制有了基本了解（圖1）。

圖1 CRISPR研究發(fā)展過程時間線Fig. 1 The time line of the CRISPR development process

2012年，美國Emmanuelle和Jennifer實驗室發(fā)現(xiàn)嗜熱鏈球菌CRISPR/Cas系統(tǒng)的Cas9-crRNA復合物在體外引入了DNA特定位點的雙鏈斷裂，該斷裂序列可與crRNA互補，證實Cas9-crRNA復合物作為由RNA引導的核酸內(nèi)切酶，具有識別目標序列和切割DNA的功能［23-24］。2013年，張鋒團隊首次使用CRISPR/Cas9工具在哺乳動物細胞中進行了有效的基因組編輯［25］。自此，使用CRISPR/Cas9敲除靶基因逐漸成為生物科技領(lǐng)域的熱門研究技術(shù)，為基因功能研究、動植物育種和生物量產(chǎn)率增加提供了新的技術(shù)支持。

1.2 CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)的分類

CRISPR系統(tǒng)包括一段成簇的短回文重復序列和一系列Cas蛋白編碼基因，如Cas 1、Cas 2、Cas 4和效應(yīng)蛋白Cas 9、Cpf 1等，進一步細 化，其可被分為2大類、6種類型和33個子類型（圖2）［26］。其中，Class I類系統(tǒng)包括type I、type III以及type Ⅳ，依賴于多亞基蛋白質(zhì)復合物，可利用幾種Cas蛋白和crRNA形成效應(yīng)復合物；Class II類系統(tǒng)包括type II、type V以及type VI，僅使用單一效應(yīng)蛋白，利用大量的單組分Cas蛋白與crRNA結(jié)合以介導干擾過程。目前，由于克隆及在宿主細胞傳遞的便利性，Class II類效應(yīng)子核酸酶應(yīng)用更為廣泛，而type II的CRISPR/Cas9系統(tǒng)和type V的CRISPR/Cpf 1系統(tǒng)，是目前研究最深入、應(yīng)用最廣泛的兩種類型（表1）。

表1 Cas9和Cpf1的不同特征Table 1 Distinct characteristics of Cas9 and Cpf1

1.2.1 依賴于Cas9的CRISPR基因編輯 化膿性鏈球菌Cas9核酸酶（SpCas9）是在植物、動物和微藻中進行基因組編輯最常用的Cas9變體。CRISPR/Cas9免疫防御系統(tǒng)主要包含兩部分，引導RNA（gRNA）和Cas9蛋白。gRNA可結(jié)合到一個特定的目標DNA序列，并通過一個簡短的DNA序列，鄰近原間隔相鄰基序（protospacer adjacent motif，PAM）定位，通常是“NGG”［27］。由于 PAM 序列位于外來的 DNA 的原始間隔區(qū)旁邊，不在基因組 CRISPR 基因座中的間隔區(qū)旁邊，因此 PAM 有助于區(qū)分自身和非自身 DNA，從而防止自身免疫的產(chǎn)生。Cas9具有核酸酶活性，負責切割DNA雙鏈。當形成gRNA-Cas9復雜形式，Cas9在PAM序列前的3個堿基點進行雙鏈切割，主要產(chǎn)生平末端［24］；切割點通常經(jīng)過非同源端連接（（non-homologous end joining，NHEJ）修復，這種連接通常容易出錯，導致切割點插入或刪除，而這種突變通常會導致移碼突變，影響蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯，從而破壞基因的功能。

1.2.2 依賴于Cpf1核酸酶的CRISPR基因編輯 2015年，張峰團隊發(fā)現(xiàn)了CRISPR系統(tǒng)新的核酸酶Cas12a（后期更改命名為Cpf1）［28］。CRISPR/Cpf1系統(tǒng)與Cas9系統(tǒng)在功能原理上相似，但與Cas9系統(tǒng)相比，存在著以下差別。首先，Cpf1相關(guān)的CRISPR陣列在轉(zhuǎn)錄為成熟的crRNA的過程中，無需tracrRNA和RNase III參與；其二，Cas12識別富含T的更長的PAM序列“TTTN”，Cas9識別富含G的PAM序列“NGG”；其三，Cpf1蛋白切割產(chǎn)生了黏性末端［28］。

與Cas9系統(tǒng)相比，CRISPR/Cpf1系統(tǒng)更具有一些優(yōu)勢［29］，主要表現(xiàn)Cpf1可在不需要tracrRNA的特性的條件下更簡單地制備指導RNA，且Cpf1具有的單個核酸酶結(jié)構(gòu)域（RuvC）體積比Cas9小，編輯效率更準確有效；Cpf1蛋白切割產(chǎn)生的黏性末端，有利于目的基因利用非同源重組的方法插入位點；Cpf1識別更長的原間隔子相鄰基序（PAM），減少了其在富含GC的基因組上被誤讀的機會，從而導致靶標突變效率大大提高［29］。在PAM識別后，Cpf1將目標DNA切割到PAM位點的下游更遠的位置，以使其在非同源末端連接過程中得以保留。而在Cas9中，PAM位點靠近切割位點通常會導致其破壞，從而排除了之后的編輯工作。CRISPR/Cpf1基因編輯可將目標基因重新定位以進行重復編輯，從而提高了目標效率。

1.2.3 CRISPR基因調(diào)控 CRISPR干擾和CRISPR激活 CRISPR/Cas 系統(tǒng)還可通過催化失活的 DNasedead Cas（dCas）變體進行基因調(diào)控，用于CRISPR干 擾（CRISPR interference，CRISPRi）和CRISPR激活（CRISPR activation，CRISPRa）。如果Cas9的兩個蛋白結(jié)構(gòu)域（HNH和RucV）失活，即可突變?yōu)橐粋€保留了靶向DNA結(jié)合能力而無催化活性的Cas9蛋白（dCas9）［30-31］。dCas9是調(diào)節(jié)目標基因轉(zhuǎn)錄水平的工具，基因抑制的程度可以通過調(diào)節(jié)dCas9的表達或調(diào)節(jié)gRNA的結(jié)合位置來控制。為了提高效率，dCas9蛋白通常與各種轉(zhuǎn)錄抑制因子（如KRAB）或者轉(zhuǎn)錄激活因子（如VP64）融合，使目標基因在雙重效應(yīng)下受到最大的抑制或上調(diào)。此外，與傳統(tǒng)的基因組編輯方法相比，使用CRISPRi造成的抑制是可逆的過程，甚至可以同時調(diào)節(jié)多個靶基因的表達?；诖?，CRISPRi具有發(fā)展為一種操縱和修飾代謝途徑關(guān)鍵基因工具的潛能。

2 CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)在微藻中的 應(yīng)用

作為一種新興的生物技術(shù)工具，CRISPR基因編輯技術(shù)在生物的基因功能研究，以及動植物品種如水稻、高粱、小麥、大豆和玉米等的遺傳改造等方面展現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景［32-37］。隨著技術(shù)的成熟和基因組測序成本的降低，CRISPR技術(shù)在微藻上的應(yīng)用也得到了快速發(fā)展。據(jù)報道，CRISPR技術(shù)在微藻中的應(yīng)用最早是在模式生物萊茵衣藻中實現(xiàn)的［38］，隨著萊茵衣藻［39］和小球藻［40］等藻類基因組測序的完成，明確的遺傳背景更有力地推動了其在衣藻、藍藻等多種微藻基因工程中的研究和應(yīng)用。將CRISPR技術(shù)應(yīng)用于微藻中，不僅可證明特定基因的功能，開發(fā)具有工業(yè)性狀的菌株，而且與其他工程核酸酶相比，還具有高效率，高準確性和簡便性的特性。

2.1 衣藻

對模式藻萊茵衣藻的基因工程研究早在幾十年前就開始了［41］。萊茵衣藻具有單細胞形態(tài)，培養(yǎng)條件簡單，可自養(yǎng)、異養(yǎng)、混合營養(yǎng)生長等特征，是首批對其線粒體和葉綠體基因組進行測序的藻類之一［42］。同時，許多異源轉(zhuǎn)基因已在衣藻中表達，包括許多抗生素抗性標記、報告基因等，這些工具的開發(fā)對研究基因表達和篩選轉(zhuǎn)化細胞至關(guān)重要。這些特征使得其作為早期研究基因編輯技術(shù)的模型藻類。

自2014年CRISPR/Cas9系統(tǒng)首次被應(yīng)用在萊茵衣藻的基因編輯中，Jiang等［43］也成功將Cas9和sgRNA轉(zhuǎn)入衣藻細胞進行了短暫表達，并成功敲除了萊茵衣藻中內(nèi)源的雷帕霉素敏感性基因FKB12。然而，在超過109個細胞的16次獨立轉(zhuǎn)化實驗中，僅有一個帶有雷帕霉素抗性的突變體菌落產(chǎn)生，表現(xiàn)出極低的轉(zhuǎn)化效率，并提示Cas9潛在毒性的存在。為了避免Cas9載體引起的細胞毒性和脫靶效應(yīng)，2016年，Shin等［44］在體外合成Cas9-gRNA核糖核蛋白復合物（RNP），并通過電穿孔方法直接將其轉(zhuǎn)化至萊茵衣藻中，成功在MAA7，CpSRP43和Ch1M三個不同基因座上獲得CRISPR/Cas9誘導的突變，與載體驅(qū)動轉(zhuǎn)化相比，RNP方法對基因沉默的效率提高了100倍，而且無非靶向效應(yīng)。

作為具有多種代謝工程技術(shù)和工具的模式生物，萊茵衣藻可用于黃斑色素的工業(yè)生產(chǎn)。葉黃素和玉米黃質(zhì)是膳食類胡蘿卜素，可降低年齡相關(guān)性黃斑變性，在維持眼睛健康方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Baek等［45］使用預組裝的RNP遞送方法敲除玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶（zeaxanthin epoxidas，ZEP）基因，發(fā)現(xiàn)ZEP敲除突變體可持續(xù)產(chǎn)生玉米黃質(zhì)，光合產(chǎn)量也得到了大幅度提高［46］。再者，由于Cas9蛋白只具有瞬時活性并隨后被細胞內(nèi)源蛋白酶降解，因此RNP也減少了脫靶效應(yīng)和細胞毒性。

2017年，Cpf1核酸酶第一次在萊茵衣藻進行了試驗，通過將Cpf1 RNP與單鏈寡聚脫氧核苷酸（ssODNs）作為DNA修復模板，在萊茵衣藻中實現(xiàn)了同源定向的DNA替代，其共轉(zhuǎn)染可達到10%的精確效率，且Cpf1 RNP單獨轉(zhuǎn)化FKB12基因的靶向效率與Cas9 RNP相似。同年，研究人員首次使用CRISPRi系統(tǒng)用于萊茵衣藻中脂質(zhì)的基因調(diào)控［47］。磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC）是脫羧酶家族中的一種關(guān)鍵酶，它與磷酸烯醇丙酮酸（Phosphoenolpyruvate，PEP）形成草酰乙酸直接相關(guān)，草酰乙酸流入三羧酸循環(huán)以進行蛋白質(zhì)合成。通過下調(diào)PEPC1編碼蛋白的表達，調(diào)節(jié)碳在脂質(zhì)中的流向，成功提高了萊茵衣藻的生物量和脂質(zhì)積累速率。MAA7是編碼色氨酸合酶 β-亞基的基因，無功能的MAA7突變體可以在含有5-FI色氨酸類似物的培養(yǎng)基上進行營養(yǎng)缺陷型選擇。為解決低下的基因編輯效率，2020年，研究者選擇研究MAA7基因，使用預先組裝的RNP復合體，成功靶向敲除萊茵衣藻MAA7基因［48］，通過MAA7突變體的選擇和鑒定，評估MAA7的基因編輯效率［44］；通過在RNP上添加雙鏈HDR模板，評估靶向MAA7的HDR敲入效率，闡明了優(yōu)化RNP復合物的濃度和轉(zhuǎn)化方案對于實現(xiàn)高效率的靶向敲除的重要性；同樣的，重組位點和HDR模板的濃度的優(yōu)化對于實現(xiàn)高效率的HDR介導的敲入也至關(guān)重要［48］。同時，該優(yōu)化方法也可以擴展到其他具有工業(yè)潛力的藻類。

2.2 藍藻

藍藻以其能利用太陽光和CO2，且遺傳操作適應(yīng)性好的特性，成為了生產(chǎn)生物燃料和生物衍生化學品的理想底盤生物［49-50］。然而，藍藻基因組的修飾由于部分藍藻是寡倍體或多倍體而變得耗時和復雜。直到CRISPR/Cas技術(shù)對基因組編輯方式的改變，使得藍藻的代謝工程有了新的突破。

2016年，研究者第一次在藍藻中使用了CRISPR/Cas9系統(tǒng)。nblA 基因是聚球藻 2973 中藻膽體降解的必需元素。野生型聚球藻 2973 菌株在缺乏硝酸鹽的培養(yǎng)基中生長時表現(xiàn)出黃色漂白效果，但nblA刪除菌株具有明顯的非漂白表型，并在相同條件下保持綠色。通過選擇敲除nblA基因，可觀地表明了在藍藻中瞬時Cas9表達可以實現(xiàn)基因編輯，并且Cas9的存在提高了編輯效率［51］。隨后，Li及其同事通過敲除glgC基因，使藍藻中的大部分碳通量從糖原轉(zhuǎn)移到琥珀酸酯，從而產(chǎn)生更高水平琥珀酸酯的glgC缺失突變體［52］。但也發(fā)現(xiàn)高濃度的Cas9具有毒性，可降低藍藻細胞的生存力，從而促使人們探索通過使用新的Cpf1核酸酶來克服這一障礙。2016年，Ungerer研究團隊［53］對Cpf1和Cas9兩種蛋白的毒性評估結(jié)果顯示，Cpf1的毒性顯著低于Cas9，Cpf1是藍藻基因組編輯的較為合適的核酸酶，并首次通過2種藍藻的缺失突變、點突變以及插入突變，研究了Cpf1系統(tǒng)的多功能性［53］。

基因的敲除或敲入有時會損害宿主生物的生存力，但CRISPRi為藍藻工程學提供了另一種可行的方法，該方法依賴于無酶活性的dCas9，這對不能刪除而只能降低其表達的必需基因的研究尤其重要。Yao等［54］首次在藍細菌中引入了CRISPRi系統(tǒng)通過下調(diào)phaE和glgC基因，降低多羥基丁酸酯和糖原的產(chǎn)生，抑制phaE基因有效消除了集胞藻屬中的聚羥基丁酸酯（polyhydroxybutyrate，PHB）的合成，抑制glgC基因可使糖原合成大幅度降低。同樣的，Huang等［55］通過抑制glgC、sdhA和sdhB基因，下調(diào)糖原合成，使琥珀酸水平提高了12.5倍。Higo及其同事采用CRISPRi技術(shù)，通過抑制魚腥藻glnA基因不僅可高效生產(chǎn)銨鹽，還可控制細胞以誘導劑依賴的方式開啟和關(guān)閉銨的產(chǎn)生［56］。然而，研究人員在2018年發(fā)現(xiàn)dCas9可改變大腸桿菌的形態(tài)，使其成異常的絲狀形態(tài)，推測dCas9影響了細菌的細胞分裂，并對細胞膜的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響［57］。這促使了研究者對不同Cas蛋白CRISPR干擾系統(tǒng)開展了進一步的研究。甲基-赤蘚糖醇-4-磷酸（methylerythritol-4-phosphate，MEP）途徑中關(guān)鍵酶的過度表達和融合導致藍藻光合角鯊烯的大量生產(chǎn)，首次藍藻中使用CRISPR/dCpf1系統(tǒng)，有效阻止了轉(zhuǎn)錄啟動，通過抑制acnB、cpcB2關(guān)鍵基因，提高了光合角鯊烯的產(chǎn)量［58］。由此可見，dCpf1介導的CRISPRi系統(tǒng)極大地促進了藍藻代謝工程的研究，是提高藍藻生物量切實可行的技術(shù)和方法。

CRISPR的另一個功效是多路復用，即多個基因可以并行編輯而不是單獨靶向。Kaczmarzyk等［59］的研究中運用CRISPR多路復用的作用，將脂肪?；匦露ㄏ蛑林敬己铣?，同時抑制了6個編碼消耗?；鵄CP途徑的酶的天然基因，使C18脂肪醇生產(chǎn)率提高了3倍左右。多路復用開辟了應(yīng)用組合方法優(yōu)化藍藻的可能性，反過來又使藍藻代謝過程得到更大更廣的覆蓋?？傊珻RISPR技術(shù)的出現(xiàn)及廣泛應(yīng)用無疑加速了藍藻代謝工程的研究和進展。

2.3 硅藻

硅藻是單細胞真核生物，在全球海洋中碳和硅的循環(huán)利用中起著至關(guān)重要的作用。同時，由于脂質(zhì)的高水平積累，硅藻被認為是生物燃料生產(chǎn)的重要候選者，在藥物，化妝品，營養(yǎng)補充劑和生物燃料中具有潛在應(yīng)用價值。因此，了解CRISPR技術(shù)在硅藻工業(yè)上的開發(fā)應(yīng)用也極為必要。

2016年，Nymark等［60］首次在硅藻中報道了基于Cas9的基因組編輯技術(shù)，通過轉(zhuǎn)化Cas9-gRNA質(zhì)粒，對8個突變體的高光敏性生長測定和qRT PCR進行了表征，獲得了生長緩慢，對高光的敏感性增強的CpSRP54突變菌株。同年，Hopes等［61］使用兩個sgRNAs誘導脲酶基因的精確刪除，證明在硅藻Thalassiosira pseudonana進行基因編輯的可行性。

然而，CRISPR / Cas9技術(shù)在硅藻中的優(yōu)化改進仍在進行中，以求突變型菌株的生產(chǎn)不被時間、步驟、脫靶等限制住。2018年，Stukenberg等［62］通過優(yōu)化CRISPR/Cas9載體構(gòu)建，簡化了篩選步驟，并誘導了單等位基因和雙等位基因突變。此外，通過CRISPR / Cas9切口酶進行基因組編輯是另一種改良方法。2020年，在海洋硅藻中使用Cas9切口酶進行基因組編輯誘變，靶向TpθCA3基因編輯［63］。通過這種修飾，使得Cas9誘變中潛在的脫靶頻率被最小化。同樣的，Moosburner等［64］通過將Cas9轉(zhuǎn)錄融合到2A肽的選擇標記上，為Cas9基因選擇抗生素，減少了生產(chǎn)和驗證突變細胞系的時間。然而，Cas9切口酶僅適用于少數(shù)幾種模式生物，在微藻的應(yīng)用報道較少。

2.4 其他

微藻具有巨大的物種多樣性，在生態(tài)系統(tǒng)、水產(chǎn)養(yǎng)殖以及生物能源，糧食和飼料部門中都發(fā)揮著重要作用。除了上述藻類，CRISPR技術(shù)也在不斷地的探索性地應(yīng)用在其他非模式藻類上。2016年，以工業(yè)產(chǎn)油微藻Nannochloropsis oceanica菌株IMET1為模型，建立了一種有效的基于CRISPR / Cas的微藻靶向基因敲除方法［65］，從靶向基因敲除的突變菌株中獲得了大約1/1 000-1/100的成功率，比之前報道的［43］編輯效率高了幾個數(shù)量級。2017年，Ajjawi等［66］通過刪除在脂質(zhì)生物合成中充當負調(diào)節(jié)劑的轉(zhuǎn)錄因子，使Nannochloropsis gaditana脂質(zhì)產(chǎn)量增加了一倍。2019年，CRISPR / Cas9系統(tǒng)首次應(yīng)用于小球藻FSP-E中，通過編輯fad3基因，達到脂質(zhì)積累增加的結(jié)果［67］。盡管目前應(yīng)用在非模式藻類的種類還不夠多，但隨著研究的深入，相信在不久的未來，CRISPR/Cas技術(shù)在藻類的潛力將得到更充分的發(fā)揮和利用（表2）。

表2 CRISPR技術(shù)在微藻中的應(yīng)用研究Table 2 Research on the application of CRISPR technology in microalgae

3 轉(zhuǎn)化方法

植物的轉(zhuǎn)化技術(shù)滯后于動物，而微藻的轉(zhuǎn)化又是在植物轉(zhuǎn)化技術(shù)基礎(chǔ)上實現(xiàn)的。正如Altpeter所指出的，成功的基因編輯是基于生物體的轉(zhuǎn)化技術(shù)的［68］。因此，此部分總結(jié)了微藻的轉(zhuǎn)化技術(shù)。

微藻轉(zhuǎn)化技術(shù)的滯后，可能與藻體細胞較小，以及存在保護細胞的細胞壁阻礙有關(guān)。藻類細胞壁是阻止外來DNA通過細胞膜進入的物理屏障，因此，許多轉(zhuǎn)化的方案依賴于細胞壁缺陷的衣藻細胞。目前，微藻常用的核轉(zhuǎn)化方法有粒子槍介導的生物轉(zhuǎn)化、玻璃珠方法和電穿孔等3種。1988 年首次使用包被DNA的鎢微粒轟擊萊茵衣藻細胞葉綠體［69］。粒子槍介導的生物轉(zhuǎn)化是利用微粒輸送系統(tǒng)，將含有外源基因的金屬微粒輸送整合到藻類細胞中，從而越過了細胞壁的生理屏障。但這種方法效率低下，獲得的轉(zhuǎn)化體少且需要專門的設(shè)備。玻璃珠核轉(zhuǎn)化是一種借助質(zhì)粒和玻璃珠的存在，攪動細胞壁缺陷的衣藻細胞的方法［70］。玻璃珠方法僅適用于沒有細胞壁的菌株，否則會限制轉(zhuǎn)入細胞核的DNA量。雖然玻璃珠方法操作簡單，不需要專門的設(shè)備，但它的限制性是需要在轉(zhuǎn)化前用自溶素處理以去除菌株的細胞壁，使這種缺陷的衣藻細胞很難雜交，進而增加了遺傳分析的困難。盡管后期改良的玻璃珠技術(shù)（碳化硅代替玻璃珠）可以轉(zhuǎn)化具有細胞壁的微藻［71］，但這種技術(shù)形成的毒副產(chǎn)物仍需謹慎處理。

電穿孔是使用最廣泛的轉(zhuǎn)染方法之一，因為它具有很高的效率和便利性。電穿孔轉(zhuǎn)化方法，可以用一個或幾個DNA分子將具有完整壁的細胞瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，不需要特殊的細胞壁缺陷菌株或去除細胞壁的處理方法［72］，也不會產(chǎn)生有毒的副產(chǎn)物。電脈沖在細胞的質(zhì)膜上形成瞬時孔后，緊鄰質(zhì)膜的帶電分子被嵌入膜中，幾小時后，帶電分子會完全穿過質(zhì)膜并進入細胞，是一種快速簡便的方法。此外，電穿孔技術(shù)也是建立篩選目標表型的突變體文庫的簡便方法，其產(chǎn)生的突變體數(shù)量比玻璃珠方法高100倍左右，這是其他方法無法比擬的。然而，其所需的設(shè)備也比較昂貴。

4 編輯效率的提高

合成生物學時代，依賴于藻類基因工程有望生產(chǎn)如色素、油和脂類、甾醇、淀粉、多糖化合物等新型代謝物，在其中，CRISPR/Cas 系統(tǒng)已逐漸成為主要的基因組編輯工具。目前，提高微藻基因編輯效率可從兩方面入手：（1）合適的轉(zhuǎn)化方法；（2）CRISPR/Cas 系統(tǒng)引入微藻的模式。

在藻類物種中利用 CRISPR/Cas 的主要限制之一是缺乏高效和穩(wěn)健的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。轉(zhuǎn)化方法的選擇極大地影響了目標宿主工程策略的整體有效性。電穿孔是首選方法，其增加了 DNA 傳遞的數(shù)量，缺點在于由于機械損傷導致細胞死亡率較高。除了上述3種傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化方法，另一種克服細胞壁障礙的策略是利用農(nóng)桿菌或者細菌結(jié)合來介導轉(zhuǎn)化使 DNA 轉(zhuǎn)移通過細胞壁。將環(huán)狀自我復制附加型質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到硅藻中，細菌結(jié)合方法顯示出在某些微藻物種中進行染色體整合的前景［73］。此外，藍藻在沒有表面活性劑的情況下可從周圍環(huán)境中自然吸收 DNA［74］。除了這些經(jīng)典方法之外，基于細胞穿透肽、細胞穿透聚合物、金屬有機框架、脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)化已在非藻類宿主中得到證實［75］，這些尚未廣泛應(yīng)用于藻類的新興轉(zhuǎn)化技術(shù)可能為DNA表達構(gòu)建體傳遞到藻類基因組開辟新的途徑?？傮w而言，DNA 遞送和細胞壁透化的方法根據(jù)宿主生物體和目標細胞區(qū)室（細胞器或細胞核）而異，不存在一刀切的轉(zhuǎn)化策略。每個宿主生物都有自己的特性，尤其是細胞壁的存在與否的情況。大多數(shù)藻類系統(tǒng)的主要限制是在轉(zhuǎn)化中提供多組轉(zhuǎn)基因，而這些新型轉(zhuǎn)化技術(shù)是否有助于在單個轉(zhuǎn)化步驟中穩(wěn)定轉(zhuǎn)化包含多基因途徑的較大 DNA 片段還有待觀察。

另一個決定編輯效率的重要因素是 CRISPR/Cas系統(tǒng)引入微藻的模式。最常用的方法是基于載體的傳遞，Cas9 與sgRNA 一起置于啟動子和終止子的控制之下。生物之間缺乏相容性是合成生物學工具擴展受限的原因之一，尤其是密碼子優(yōu)化。盡管外源基因整合到微藻中，但轉(zhuǎn)基因表達通常很弱，根據(jù)目標藻體的密碼子偏好性，對Cas基因進行密碼子優(yōu)化，以確保有效表達。另外，有報道稱Cas9組成型表達對衣藻細胞有毒性，可利用誘導型的啟動子和終止子來解決［43，60］。另一種方法是 Cas9 和 sgRNA 的附加體遞送［76］。附加體，即自我復制且不整合到染色體中的環(huán)狀質(zhì)粒。附加體避免了非目標位置的插入和敲除，并獨立于染色體進行復制，使用附加體表達載體的優(yōu)勢是，一旦去除選擇壓力，轉(zhuǎn)化細胞就會逐漸擺脫附加體。與電穿孔、微粒轟擊和玻璃珠攪拌相比，通過細菌結(jié)合轉(zhuǎn)化方法在遞送更大的 DNA 片段方面具有優(yōu)勢。細菌結(jié)合轉(zhuǎn)化微藻的附加型載體提供了多基因途徑轉(zhuǎn)移的有效手段。第三種Cas遞送方法是通過 Cas9 核酸酶蛋白和 sgRNA 形成的核糖核蛋白復合物（RNP）。將純化的 Cas9 和體外合成的 sgRNA 孵育以促進復合物的形成并引入靶細胞。RNP 復合物執(zhí)行 DNA 切割的功能，并在進入細胞后數(shù)小時內(nèi)降解。由于在細胞內(nèi)的停留時間較短，其具有較小的脫靶率［77］。

5 挑戰(zhàn)與展望

采用 CRISPR/Cas 的編輯系統(tǒng)是一種新興的綠色微藻技術(shù)。對CRISPR/Cas的理解和優(yōu)化使這種生物技術(shù)成為一個有前途的手段，可以操縱一些淡水和海洋微藻的基因組。在兩種不同類別和6種不同類型的 CRISPR 系統(tǒng)中，以Cas9 驅(qū)動的II型系統(tǒng)在微藻的 CRISPR 研究中使用最多。本文除了回顧CRISPR的機制分類、一些經(jīng)典的轉(zhuǎn)化方法外，還重點總結(jié)了CRISPR技術(shù)在藻類的應(yīng)用，以期這些新興的轉(zhuǎn)化方法和不同的遞送方式，為提高轉(zhuǎn)化效率和轉(zhuǎn)基因的表達水平提供一些思路和方法。

從目前的報道來看，雖然CRISPR技術(shù)已經(jīng)在藻類的研究中取得了一定成效，但其在應(yīng)用過程中也存在諸多問題：（1）由于藻類存在細胞壁結(jié)構(gòu)，很難將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)化到微藻中。藻類電穿孔轉(zhuǎn)化應(yīng)用最廣泛，但轉(zhuǎn)化效率還有待進一步的提升。而目前脂質(zhì)轉(zhuǎn)染與電穿孔相結(jié)合是提高轉(zhuǎn)化效率的較好選擇。（2）Cas9 RNP的方法雖比載體驅(qū)動的Cas9更有效率，但高質(zhì)量的無毒的重組Cas9蛋白不容易制備，購買成本也較為高昂。（3）微藻可能存在沉默系統(tǒng)［78］，在轉(zhuǎn)錄之后的水平上對抗遺傳物質(zhì)。沉默組件的暫時關(guān)閉可能會提高轉(zhuǎn)換效率。（4）精確的基因組編輯技術(shù)需要精確的誘變而不會產(chǎn)生脫靶事件，這在微藻類中尚未建立良好的誘變體系?？傮w而言，CRISPR技術(shù)還存在一定的局限性，仍需后期的改進，以在微藻進行精準基因編輯。

與其他基因編輯技術(shù)相比，CRISPR技術(shù)在微藻中的應(yīng)用進展較緩。隨著全基因組測序技術(shù)的更新，CRISPR技術(shù)有望加深我們對微藻基因功能和代謝機制的認識，提高對微藻生物燃料和其化學品的開發(fā)，為解決能源短缺和環(huán)境污染等問題提供了新思路。同時，應(yīng)警惕基因突變帶來不可預知的風險和潛在的生物安全危機［79］，在將CRISPR技術(shù)應(yīng)用于商業(yè)用途之前，須考慮CRISPR轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品對環(huán)境和生物遏制問題的影響。