蝙蝠蛾擬青霉-蛹蟲草復(fù)方的安全性評(píng)價(jià)及調(diào)節(jié)免疫活性研究

焦春偉 梁慧嘉 隨晶晶 陳家明 謝意珍

摘 要：目的：評(píng)價(jià)蝙蝠蛾擬青霉-蛹蟲草復(fù)方安全性與免疫增強(qiáng)活性。方法：采用小鼠急性毒性試驗(yàn)、骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)、精子畸形試驗(yàn)、微粒體酶（Ames）試驗(yàn)、遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)、血清溶血素滴度檢測(cè)和脾細(xì)胞抗體生成細(xì)胞試驗(yàn)，觀察受試物的安全性和免疫功能。結(jié)果：蝙蝠蛾擬青霉-蛹蟲草復(fù)方對(duì)小鼠急性毒性最大耐受量>20.0 g/kg bw，屬無(wú)毒級(jí)物質(zhì)，且小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)、精子畸形試驗(yàn)及Ames試驗(yàn)呈陰性;細(xì)胞免疫試驗(yàn)中，中劑量（0.33 g/kg bw）、高劑量（0.99 g/kg bw）復(fù)方能顯著提高小鼠足跖厚度差值（中劑量：p<0.05;高劑量：p<0.01）;體液免疫試驗(yàn)中，高劑量復(fù)方能極顯著提高小鼠溶血空斑數(shù)與半數(shù)溶血值（p<0.01），說(shuō)明復(fù)方能增強(qiáng)小鼠細(xì)胞免疫與體液免疫。結(jié)論：該復(fù)方在試驗(yàn)劑量?jī)?nèi)安全無(wú)毒，且具有增強(qiáng)免疫功效。

關(guān)鍵詞：蝙蝠蛾擬青霉;蛹蟲草;毒理學(xué);調(diào)節(jié)免疫;安全性評(píng)價(jià)

Safety Evaluation and Immunomodulatory Activity of a Combination of Paecilomyces hepiali and Cordyceps militaris

JIAO Chunwei1，2， LIANG Huijia2， SUI Jingjing2， CHEN Jiaming2， XIE Yizhen1，2*

（1.Guangdong Yuewei Biotechnology Co.， Ltd.， Zhaoqing 526000， China; 2.Guangdong Yuewei Edible Fungi Technology Co.， Ltd.， Guangzhou 510663， China）

Abstract： Objective： To evaluate the safety and immunomodulatory activity of the combination of Paecilomyces hepiali and Cordyceps militaris. Method： Acute toxicity test in mice， bone marrow cell micronucleus test in mice， sperm malformation test in mice， microsomal enzyme（Ames）test， delayed metamorphosis test in mice， serum hemolysin titer detection and spleen cell antibody - producing cell assay were used to observed to determine the toxicity and immune effect. Result： The maximum tolerated oral acute toxicity of the compound in mice was

>20.0 g/kg bw， which was a non-toxic substance， and the mouse bone marrow cell micronucleus test， sperm malformation test and Ames test were negative; in the cellular immunity test， the medium （0.33 g/kg bw） and high

（0.99 g/kg bw） doses of the compound significantly increased the difference in foot and plantar thickness in mice （medium dose： p<0.05. High dose： p<0.01）; In the humoral immunity test， the high dose of the compound significantly increased the number of hemolytic vacuoles and hemolytic values in mice （p<0.01）， indicating that the compound could enhance cellular and humoral immunity in mice. Conclusion： the compound is safe and non-toxic at the doses tested and has immune-enhancing effects.

Keywords： Paecilomyces hepiali; Cordyceps militaris; toxicology; immunomodulatory; safety evaluation

冬蟲夏草（Cordyceps sinensis）是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材之一，因其藥效顯著而被廣泛用于中醫(yī)、藏醫(yī)及其他民族醫(yī)學(xué)[1-2]?，F(xiàn)代藥理研究結(jié)果顯示冬蟲夏草富含多糖、蟲草酸及腺苷等活性成分，可在機(jī)體中發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫[3]、抗腫瘤[4]及降血脂[5]等多種生理活性。然而，由于其生長(zhǎng)環(huán)境苛刻，導(dǎo)致現(xiàn)有資源難以滿足消費(fèi)者的需求[6]。

近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)蝙蝠蛾擬青霉（Paecilomyces hepiali）和蛹蟲草（Cordyceps militaris）具有與冬蟲夏草相似的成分組成，部分活性成分甚至高于冬蟲夏草，是兩種較為理想的替代品[7]。藥理學(xué)研究結(jié)果顯示，蝙蝠蛾擬青霉與蛹蟲草均具有較好的調(diào)節(jié)免疫活性[8-10]。蝙蝠蛾擬青霉含高度分支的甘露聚糖與多種氨基酸，具有誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，增加血清免疫球蛋白的功效，還能改善腫瘤患者因化療藥物帶來(lái)的免疫損傷[11-12]。蛹蟲草含有的雜多糖與多種核苷類物質(zhì)是發(fā)揮該活性的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[13-14]。

本研究所選用的蝙蝠蛾擬青霉與蛹蟲草均為安全且無(wú)明顯毒副作用的原料，但以兩種原料復(fù)配所得的混合物安全性尚不明確，因此本研究先通過(guò)急性毒性實(shí)驗(yàn)、小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)等對(duì)該混合物的安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)。在明確其安全性的基礎(chǔ)上，通過(guò)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)、小鼠脾細(xì)胞抗體生成試驗(yàn)等評(píng)價(jià)其調(diào)節(jié)免疫活性，為相關(guān)保健食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 原料

蝙蝠蛾擬青霉-蛹蟲草復(fù)配物由廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

無(wú)特定病原體（Specific Pathogen Free，SPF）級(jí)昆明小鼠（Kunming Mice，KM）小鼠，體重18～22 g，雌雄過(guò)半;SPF級(jí)斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬祝⊿prague Dawley，SD）大鼠，體重66～76 g;所有動(dòng)物均由廣東省醫(yī)學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2013-0002。試驗(yàn)期間，所有試驗(yàn)動(dòng)物均飼養(yǎng)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的SPF級(jí)環(huán)境中，飼養(yǎng)條件為室溫20～26 ℃，濕度40%～70%，12 h/12 h明暗交替，試驗(yàn)期間自由攝食和飲水。

1.3 主要儀器與試劑

CO2培養(yǎng)箱;CASY DT型細(xì)胞計(jì)數(shù)儀;SOFT

maxPRO酶標(biāo)儀;超凈工作臺(tái);倒置顯微鏡;顯微鏡;溫箱;游標(biāo)卡尺;RPMI1640培養(yǎng)基;綿羊紅細(xì)胞等。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 急性毒性試驗(yàn)

采用最大耐受量法進(jìn)行經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)。將20只KM小鼠（雌雄各半）分為雌雄兩組，禁食不禁水16 h，經(jīng)口灌胃受試物溶液（20.0 g/kg bw）兩次（時(shí)間間隔為4 h），每次灌胃0.2 mL/10 g bw，觀察并記錄小鼠一周內(nèi)的中毒表現(xiàn)及死亡情況。

1.4.2 遺傳毒性試驗(yàn)

（1）Ames試驗(yàn)。選用經(jīng)鑒定符合要求的鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102試驗(yàn)菌株，以多氯聯(lián)苯誘導(dǎo)的大鼠肝臟勻漿S9液為代謝活化系統(tǒng)，設(shè)置5個(gè)樣品組（5 000 μg/皿、

1 000 μg/皿、200 μg/皿、40 μg/皿及8 μg/皿）、未處理對(duì)照組、溶劑對(duì)照組（蒸餾水）及陽(yáng)性對(duì)照組。染毒后置于37 ℃條件下培養(yǎng)48 h，記錄每皿回變菌落數(shù)。

（2）小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)。將50只SPF級(jí)健康KM小鼠隨機(jī)分為5組（每組10只，雌雄各半）：陰性對(duì)照組，受試物低、中、高劑量組，陽(yáng)性對(duì)照組。陰性對(duì)照組每日灌胃純凈水，受試物低、中、高劑量組灌胃2.50 g/kg bw、5.00 g/kg bw、10.00 g/kg bw

劑量溶液，陽(yáng)性對(duì)照組灌胃40 mg/kg bw環(huán)磷酰胺（Cytoxan，CTX）溶液。采用30 h給受試物法進(jìn)行試驗(yàn)，經(jīng)口灌胃，灌胃量均為0.2 mL/10 g bw，第一次染毒24 h后以同樣的劑量進(jìn)行第二次染毒，6 h后，處死小鼠取胸骨骨髓進(jìn)行制片、染色，油鏡下每只小鼠計(jì)數(shù)1 000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞（Polychromatic Erythrocytes，PCE），觀察含有微核的PCE數(shù);若一個(gè)PCE中出現(xiàn)兩個(gè)或兩個(gè)以上微核，仍按一個(gè)有微核細(xì)胞計(jì)數(shù)：計(jì)算各組微核發(fā)生率（‰）。同時(shí)計(jì)數(shù)觀察到200個(gè)PCE時(shí)所見到的成熟紅細(xì)胞（Normochromatic Erythrocyte，NCE）數(shù)，計(jì)算嗜多染紅細(xì)胞數(shù)與成熟紅細(xì)胞數(shù)的比值（PCE/NCE）。

（3）小鼠精子畸形試驗(yàn)。將25只SPF級(jí)健康KM雄性小鼠隨機(jī)分為5組，每組5只，根據(jù)急性毒性試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)受試物最高劑量為10.00 g/kg bw，該劑量以下設(shè)5.00 g/kg bw、2.50 g/kg bw兩個(gè)劑量，陰性對(duì)照組給予等量的純凈水，陽(yáng)性對(duì)照組選用40 mg/kg bw CTX溶液。采用經(jīng)口灌胃方式給予受試物，每天灌胃一次，連續(xù)灌胃5 d，灌胃量均為0.2 mL/10 g bw，首次染毒后第35 d處死動(dòng)物取雙側(cè)附睪制片、染色，高倍鏡下鏡檢觀察，每只小鼠計(jì)數(shù)1 000條完整精子，每組共檢查5 000條精子，求出精子畸形發(fā)生率（‰）。

1.4.3 免疫活性評(píng)價(jià)試驗(yàn)

將小鼠分為4組：低、中、高劑量組和陰性對(duì)照組，低、中、高劑量組分別灌胃0.17 g/kg bw、0.33 g/kg bw、0.99 g/kg bw的受試物，陰性對(duì)照組每天灌胃0.1 mL/10 g bw純凈水，持續(xù)4周。根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》要求進(jìn)行遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)、血清溶血素滴度檢測(cè)和脾細(xì)胞抗體生成細(xì)胞試驗(yàn)。

1.5 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

釆用方差分析，按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，計(jì)算F值，F(xiàn)值>F0.05，各組均數(shù)間差異無(wú)顯著性;F值≥F0.05，p≤0.05，用多個(gè)試驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì);對(duì)非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì);若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性試驗(yàn)

試驗(yàn)期間，各小鼠飲食、行為活動(dòng)及毛色均正常;雌、雄鼠均無(wú)死亡，且生長(zhǎng)良好，雌、雄小鼠的最大耐受量（Maximum Tolerated Dose，MTD）均大于20.0 g/kg bw，屬安全無(wú)毒（見表1）。

2.2 遺傳毒性試驗(yàn)

2.2.1 Ames試驗(yàn)

Ames試驗(yàn)結(jié)果由表2可知，復(fù)方對(duì)4種菌株的試驗(yàn)中，各劑量組回變菌落數(shù)與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異（p>0.05）;4種菌株各劑量回變菌落數(shù)均低于陰性對(duì)照組的2倍，說(shuō)明受試物為非突變物。

2.2.2 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，各組小鼠骨髓細(xì)胞中均存在微核。與陰性對(duì)照組相比，低、中、高3種劑量受試物組小鼠骨髓微核率無(wú)顯著性變化，但陽(yáng)性對(duì)照組與陰性對(duì)照組存在極顯著性差異（p<0.01）;PCE/NCE結(jié)果顯示，受試物各劑量組的PCE/NCE比值與陰性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且不少于陰性對(duì)照組的20%。以上結(jié)果說(shuō)明在2.5～10.0 g/kg bw，受試物對(duì)小鼠骨髓微核細(xì)胞無(wú)毒性，不存在致染色體畸變的可能。

2.2.3 小鼠精子畸形試驗(yàn)

由表4可知，3個(gè)干預(yù)組小鼠精子畸形率與對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差異（p>0.05），說(shuō)明復(fù)方無(wú)精子致畸作用。

2.3 復(fù)方對(duì)免疫功能的影響

由表5可知，與對(duì)照組相比，低、中、高劑量組小鼠足跖厚度差值分別增加16.42%、31.34%、43.28%;其中中劑量組與對(duì)照組差異顯著（p<0.05），高劑量組與對(duì)照組差異極顯著（p<0.01），說(shuō)明3種劑量的復(fù)方均能增強(qiáng)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，且增強(qiáng)效果具有劑量依賴性。復(fù)方高劑量組小鼠脾細(xì)胞抗體生成水平較對(duì)照組增加15.24%，兩組間差異極顯著

（p<0.01）;與SRBC小鼠模型相比，3個(gè)復(fù)方溶液組小鼠血清半數(shù)溶血值HC50明顯升高，其中高劑量組極顯著升高（p<0.01），較對(duì)照組增加12.94%，說(shuō)明高劑量組復(fù)方能夠增強(qiáng)小鼠體液免疫。

3 結(jié)論

毒性試驗(yàn)分急性毒性、亞慢性毒性及特殊毒性試驗(yàn)等[15]。本研究中急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，KM小鼠對(duì)蝙蝠蛾擬青霉-蛹蟲草混合物最大耐受劑量大于20.0 g/kg，相當(dāng)于受試物日推薦劑量的606倍，屬于無(wú)毒級(jí)物質(zhì);小鼠骨髓微核試驗(yàn)、精子畸形試驗(yàn)及Ames試驗(yàn)等特殊毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示，向小鼠灌胃2.50 g/kg、5.00 g/kg、10.00 g/kg混合物不具致突變作用和生殖毒性。

免疫系統(tǒng)由免疫器官、免疫細(xì)胞及免疫分子組成，是機(jī)體對(duì)病原體、傳染病及污染物等的高度防御機(jī)制[16-17]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，中、高劑量復(fù)方組小鼠足跖厚度差值較對(duì)照組顯著增加（中劑量p<0.05，高劑量p<0.01），判定細(xì)胞免疫試驗(yàn)結(jié)果呈陽(yáng)性;復(fù)方高劑量組小鼠溶血空斑數(shù)與半數(shù)溶血值較對(duì)照組顯著增加（p<0.01），判定體液免疫結(jié)果呈陽(yáng)性。

本研究通過(guò)毒理學(xué)試驗(yàn)與免疫活性評(píng)價(jià)試驗(yàn)，證明了蝙蝠蛾擬青霉-蛹蟲草復(fù)方在本試驗(yàn)劑量范圍內(nèi)無(wú)明顯毒副作用，食用安全性較高，且具有一定免疫增強(qiáng)活性。這一結(jié)論為該復(fù)配原料在保健食品領(lǐng)域的合理應(yīng)用與機(jī)制研究奠定了理論基礎(chǔ)。

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