螺蟲乙酯單克隆抗體的制備及酶聯(lián)免疫分析方法的建立

趙靜，趙其陽，張耀海，何悅，焦必寧*，崔永亮*

1(西南大學(xué) 柑桔研究所，重慶，400712)2(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部柑桔及苗木質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)測(cè)試中心，重慶，400712)

螺蟲乙酯是德國(guó)拜耳公司開發(fā)的一種新型螺環(huán)季酮酸類殺蟲殺螨劑，它通過抑制乙酰輔酶A羧化酶活性，干擾脂肪生物合成，阻斷害蟲正常的能量代謝，最終致其死亡[1]。由于其作用高效，被廣泛應(yīng)用于防治果蔬中的刺吸口器類害蟲和害螨，如蚜蟲(甘藍(lán)蚜蟲和蘋果樹棉蚜)、木虱(梨樹梨木虱)、粉虱(番茄煙粉虱)和全爪螨(柑橘樹紅蜘蛛)等[2-3]。然而，螺蟲乙酯對(duì)人的皮膚有輕微致敏性[3]，對(duì)其他動(dòng)物有毒性，如螺蟲乙酯對(duì)蚯蚓有潛在遺傳毒性[4]，它能夠誘導(dǎo)斑馬魚肌肉組織的氧化應(yīng)激效應(yīng)，進(jìn)而引起氧化損傷[5]，也會(huì)對(duì)斑馬魚產(chǎn)生內(nèi)分泌干擾效應(yīng)[6]，此外，螺蟲乙酯對(duì)兩棲類生物如蟾蜍也有潛在毒性[7]。螺蟲乙酯在施用后主要產(chǎn)生4種代謝物，分別為B-enol，B-glu，B-keto和B-mono[8]，其中B-enol的毒性與螺蟲乙酯相當(dāng)，對(duì)雄性大鼠有生殖毒性[3]。因此，螺蟲乙酯及其代謝物的殘留檢測(cè)對(duì)人類健康和環(huán)境保護(hù)具有重要意義。

目前，植物中螺蟲乙酯及其代謝物的殘留檢測(cè)方法主要包括HPLC[9]，LC-MS/MS[1, 10]和GC-MS[11]，盡管這些方法靈敏度和準(zhǔn)確性高，但它們受限于熟練的操作人員和昂貴的儀器，而免疫分析方法具有檢測(cè)迅速、操作簡(jiǎn)便和成本低廉等優(yōu)點(diǎn)[12]。CEVALLOS-CEDEO等[13-14]設(shè)計(jì)合成了多種螺蟲乙酯的半抗原，得到了特異性識(shí)別螺蟲乙酯及B-enol的多克隆抗體和單克隆抗體，基于單克隆抗體建立了直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析方法，對(duì)葡萄、葡萄汁和葡萄酒基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，并且該課題組還以免疫原BSA-SPh為檢測(cè)線，羊抗鼠多克隆抗體為控制線，金納米顆粒標(biāo)記的單克隆抗體SPm#23為流動(dòng)相，建立螺蟲乙酯膠體金免疫層析分析方法，對(duì)葡萄酒樣品中螺蟲乙酯及B-enol殘留進(jìn)行半定量測(cè)定，其可視化最低檢測(cè)限為1 000 μg/L，滿足歐洲對(duì)葡萄酒中螺蟲乙酯殘留的半定量快速分析的要求。雖然國(guó)外已經(jīng)建立了螺蟲乙酯的免疫分析方法，但這種方法在蔬菜、水果和環(huán)境樣品中的應(yīng)用還尚待研究，同時(shí)我國(guó)在這方面的研究也比較匱乏。因此，本研究設(shè)計(jì)合成了一種新型的螺蟲乙酯半抗原，篩選出特異性識(shí)別螺蟲乙酯及B-enol的單克隆抗體，并對(duì)蔬菜、水果及環(huán)境基質(zhì)進(jìn)行螺蟲乙酯加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，同時(shí)測(cè)定了柑橘實(shí)際樣品中的螺蟲乙酯殘留，旨在提供一種快速檢測(cè)果蔬中螺蟲乙酯殘留的新方法，并為螺蟲乙酯免疫試紙條的開發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試品種：本研究中所用的土壤、河水、番茄和柑橘(溫州蜜柑)在重慶市北碚區(qū)收集，其中番茄和柑橘為市售。

藥劑與試劑：螺蟲乙酯、B-enol、B-glu、B-keto、B-mono、螺螨酯、乙螨唑、唑螨酯、噠螨靈標(biāo)準(zhǔn)品，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷(hypoxanthine-aminopterin-thymine nucleoside，HAT)培養(yǎng)基添加劑、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑和辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記羊抗鼠IgG、聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯(Tween-20),美國(guó)Sigma-Aldrich公司；卵清蛋白(ovalbumin，OVA)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、溴乙酸乙酯、N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)、N,N′-二環(huán)己基碳二亞胺(dicyclohexylcarbodiimide，DCC)、N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide，DMF)、3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine，TMB)顯色液，上海Aladdin公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)BS)，蘇格蘭Gibco BRL公司；蛋白膠、2×考馬斯亮藍(lán)R-250緩沖液、Real Band 3-color High range protein Marker，上海BBI生命科學(xué)有限公司。

電泳脫色液(30%的無水乙醇和10%的冰醋酸混合液)；包被緩沖液[碳酸鹽緩沖液(carbonate buffer solution，CBS)，pH 9.6，0.05 mol/L]：稱取2.93 g NaHCO3，1.5 g Na2CO3，用去離子水溶解并定容至1 000 mL；磷酸鹽緩沖液[(phosphate buffer solution，PBS)，pH 7.4，0.01 mol/L]：稱取0.2 g KH2PO4，2.96 g Na2HPO4·12H2O，8.0 g NaCl，用去離子水溶解并定容至1 000 mL；洗滌緩沖液(PBST，含體積分?jǐn)?shù)0.1% Tween-20的PBS，pH 7.4)；封閉液(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%脫脂奶粉的PBS)；樣品稀釋緩沖液(PBSTG，含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%明膠的PBST，pH 7.4)；終止液(2 mol/L H2SO4)。

1.2 儀器與設(shè)備

細(xì)胞培養(yǎng)板和96孔酶標(biāo)板，美國(guó)Corning Costar公司；Varioskan LUX型多功能微孔板檢測(cè)儀、IEC CL31R型臺(tái)式冷凍離心機(jī)，芬蘭賽默飛世爾科技公司；INC153型二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，德國(guó)Memmert公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司；Milli-Q型超純水器，美國(guó)Millipore公司；XS204型電子天平、PB8001-S/FACT型分析天平，瑞士METTLER TOLEDO公司；SB-5200D型超聲波清洗器，寧波新芝公司；0.22 μm有機(jī)相針式濾器，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；核磁共振波譜儀，德國(guó)Bruker公司；X500R QTOF高分辨質(zhì)譜儀(用于半抗原鑒定)，美國(guó)AB SCIEX公司；Agilent 1290-6495液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(用于方法確證)，美國(guó)Agilent公司。

1.3 螺蟲乙酯人工抗原的合成及單克隆抗體的制備

1.3.1 螺蟲乙酯半抗原的合成

螺蟲乙酯半抗原的合成路線如圖1所示。準(zhǔn)確稱取226 mg B-enol、200 mg NaOH和250 mg溴乙酸乙酯于圓底燒瓶中，加入5 mL DCC溶解，回流12 h，期間通過薄層色譜法(thin layer chromatography，TLC)監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)度，待原料點(diǎn)消失，將反應(yīng)的混合物倒入25 g冰中，攪拌4 h，并用2 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH至2～3，隨即用25 mL的乙酸乙酯萃取3次，并用飽和食鹽水進(jìn)行洗滌，收集上清液置于具塞錐形瓶中，加入適量的無水硫酸鎂干燥過夜。將干燥后的溶液過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后柱層析梯度洗脫純化產(chǎn)物。之后通過核磁共振波譜儀和X500R QTOF高分辨質(zhì)譜儀對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。

圖1 螺蟲乙酯半抗原的合成路線Fig.1 The synthetic route of spirotetramat hapten

1.3.2 螺蟲乙酯人工抗原的制備

螺蟲乙酯人工抗原的制備過程參照文獻(xiàn)[15]，合成路線如附圖1所示(https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20211011.1812.006.html)。將純化后的螺蟲乙酯人工抗原通過SDS-PAGE鑒定，并置于-20 ℃保存。

1.3.3 動(dòng)物免疫及血清效價(jià)測(cè)定

本研究采用的動(dòng)物免疫方案參考文獻(xiàn)[16]，具體操作見附表1(https://kns.cnki.net/kcms/detail/911.1802.TS.20211011.1812.006.html)。選取6只6～7 周齡的雌性Balb/c小鼠，將免疫原螺蟲乙酯-BSA與等體積弗氏佐劑乳化后進(jìn)行免疫，4次免疫后1周，眼眶取血，室溫靜置1 h，4 ℃放置2 h，4 000 r/min 離心10 min，收集血清，進(jìn)行血清效價(jià)測(cè)定。

血清效價(jià)的測(cè)定采用間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析方法(indirect homologous competitive enzyme-linked immunosorbent assay，icELISA)，通過棋盤格法進(jìn)行。具體操作步驟參考文獻(xiàn)[15, 17]：(1)包被：用CBS將1 g/L 的螺蟲乙酯-OVA稀釋至1∶1 000，1∶2 000，1∶4 000，1∶8 000，酶標(biāo)板每孔加入100 μL，37 ℃孵育3 h，棄包被液，用PBST洗板4次；(2)封閉：每孔加入200 μL封閉液，37 ℃封閉孵育1 h，棄封閉液，用PBST洗板4次；(3)加標(biāo)準(zhǔn)品和血清：將血清用PBSTG稀釋至1∶1 000，1∶2 000，1∶4 000，1∶8 000，每孔先加入50 μL螺蟲乙酯標(biāo)準(zhǔn)品(1 000 μg/L和0)，再加入50 μL稀釋后的血清，37 ℃孵育30 min，洗板4次；(4)加二抗：將HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG用PBSTG 稀釋至1∶10 000，每孔加入100 μL，37 ℃孵育30 min，洗板4次；(5)顯色：每孔加入100 μL TMB單組分顯色液，室溫下避光顯色10 min；(6)終止與檢測(cè)：每孔加入50 μL終止液，終止反應(yīng)，在450 nm處檢測(cè)吸光度OD450nm值；(7)效價(jià)確定[18]：取吸光度為1.0時(shí)的血清的最大稀釋倍數(shù)為血清效價(jià)；(8)特異性確定：根據(jù)抑制率來判斷血清的特異性，抑制率計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

1.3.4 抗螺蟲乙酯單克隆抗體的制備

第4次免疫后，選擇血清效價(jià)高，特異性好的小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫用于細(xì)胞融合。使用促融劑PEG-2000將脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞SP2/0按10∶1質(zhì)量比進(jìn)行融合，融合后每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)，在第9天采用icELISA篩選特異性強(qiáng)，效價(jià)高的雜交瘤細(xì)胞株。將篩選到的細(xì)胞株采用有限稀釋法進(jìn)行克隆化，最終得到單克隆細(xì)胞株(mAb 3D11G7)。制備腹水前，向5只6～7周的Balb/c雌性健康小鼠中注射液體石蠟(0.4 mL/只)。1周后，向小鼠腹腔中注射細(xì)胞株(mAb 3D11G7)進(jìn)行擴(kuò)繁，7～10 d后收集腹水于4 ℃下靜置約3～4 h后，10 000 r/min離心10 min，棄去脂肪層和細(xì)胞層，吸取中間澄清部分保存在-20 ℃用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 螺蟲乙酯人工抗原的合成及單克隆抗體的制備

1.4.1 抗螺蟲乙酯單克隆抗體與包被抗原的最佳工作濃度

利用icELISA和棋盤格法確定抗螺蟲乙酯單克隆抗體與包被抗原的最佳工作濃度，具體操作步驟參考文獻(xiàn)[15, 17]，其中，抗螺蟲乙酯單克隆抗體為腹水，選擇對(duì)照孔吸光度>1.0，抑制率較高的包被抗原和單克隆抗體的最大稀釋倍數(shù)為最佳工作濃度。

1.4.2 螺蟲乙酯icELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以螺蟲乙酯-OVA的最佳工作濃度進(jìn)行包被，37 ℃孵育3 h，洗板4次，接著每孔加入200 μL封閉液，37 ℃ 孵育封閉1 h，棄封閉液，用PBST洗板4次，然后將螺蟲乙酯標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋，每孔加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)品和50 μL最佳工作濃度下的抗螺蟲乙酯單克隆抗體，37 ℃孵育30 min，洗板4次，之后加入100 μL稀釋至1∶10 000的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37 ℃孵育30 min，洗板4次。隨即進(jìn)行顯色，每孔加入100 μL TMB單組分顯色液，室溫下避光顯色10 min后加入50 μL終止液，終止反應(yīng)，在450 nm處檢測(cè)吸光度OD450nm值。以螺蟲乙酯標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)濃度下的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制間接競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線如圖2所示。根據(jù)公式(2)[19]計(jì)算抗螺蟲乙酯單克隆抗體的靈敏度即半數(shù)抑制質(zhì)量濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)和最佳工作濃度范圍(IC20～I(xiàn)C80)。

(2)

式中：B0為未加標(biāo)準(zhǔn)品溶液組的OD450nm值，B為加入梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液組OD450nm值。

1.4.3 抗螺蟲乙酯單克隆抗體特異性分析

(3)

1.4.4 緩沖液中有機(jī)溶劑對(duì)icELISA的影響

為了評(píng)估緩沖液中有機(jī)溶劑對(duì)icELISA的影響，選擇農(nóng)藥前處理過程中常用的有機(jī)溶劑甲醇和乙腈，并配制含不同體積分?jǐn)?shù)的有機(jī)溶劑(5%、10%、20%和40%)的樣品稀釋液PBSTG，隨后通過icELISA測(cè)定不同濃度溶劑條件下的B0值和IC50值。

1.4.5 緩沖液的pH對(duì)icELISA的影響

為了評(píng)估緩沖液的pH對(duì)icELISA的影響，配制含不同pH值(4.5、5.5、6.5、7.4和8.5)的樣品稀釋液PBSTG，隨后通過icELISA測(cè)定不同pH條件下的B0值和IC50值。

1.4.6 加標(biāo)回收及實(shí)際樣品檢測(cè)

將采集到的溫州蜜柑和番茄用紗布擦拭干凈，按四分法取全果進(jìn)行勻漿，土壤樣品剔除其中的碎石等雜物，將處理好的樣品置于-20 ℃的冰箱保存。

樣品的提取方法為：稱取2.0 g的樣品于15 mL的離心管中，加入2 mL的甲醇超聲輔助提取20 min(25 ℃，200 W)，隨后于6 000×g離心10 min，提取3次，合并3次的上清液，于40 ℃條件下氮吹干燥，用2 mL的PBSTG復(fù)溶，稀釋至適當(dāng)濃度后通過icELISA進(jìn)行測(cè)定。

向河水中添加不同水平的螺蟲乙酯(20、50、100、500 μg/L)，用PBSTG稀釋至適當(dāng)濃度后通過icELISA進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算加標(biāo)回收率。向空白基質(zhì)土壤、番茄和溫州蜜柑中添加不同水平的螺蟲乙酯(50、100、500、1 000 μg/L)，4 ℃條件下，靜置吸附1 h，然后按照樣品的提取方法進(jìn)行提取，通過icELISA進(jìn)行測(cè)定，加標(biāo)回收率計(jì)算如公式(4)所示：

加標(biāo)回收率/%

(4)

本研究選用的實(shí)際樣品1～3號(hào)為未噴灑螺蟲乙酯的樣品，4～9號(hào)為隨機(jī)浸泡不同濃度的柑橘盲樣。

1.4.7 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)法驗(yàn)證

UPLC-MS/MS法的檢測(cè)條件參考文獻(xiàn)[20]，具體條件如下：

色譜條件：色譜柱為Agilent eclipse plus C18column(50 mm×2.1 mm,1.8 μm)；流動(dòng)相A為0.1%甲酸-水溶液，B為甲醇。柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為3 μL，流速為0.3 mL/min，洗脫梯度見附表2(https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20211011.1812.006.html)。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源；正離子掃描模式，毛細(xì)管電壓3 kV，離子源溫度120 ℃，鞘氣溫度300 ℃；通過動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 螺蟲乙酯半抗原鑒定結(jié)果

從附圖2(https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20211011.1812.006.html)半抗原的氫譜中可以看到，δ 12.86 (s, 1H, COOH) 和4.29 (dd, 2H, CH2COOH)兩處峰為引入的CH2COOH基團(tuán)的氫譜信息。碳譜中δ 12.86 (s, 1H, COOH)和66.87 (CH2COOH)2處峰也表明CH2COOH基團(tuán)被成功引入。螺蟲乙酯半抗原的分子式為C20H25NO5，相對(duì)分子質(zhì)量為359.173 3，其在質(zhì)譜中的母離子[M+H]+質(zhì)荷比(為360.180 5)與X500R QTOF高分辨質(zhì)譜儀測(cè)得質(zhì)荷比(為360.181 0)相吻合[附圖3(https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20211011.1812.006.html)]。核磁圖譜和質(zhì)譜結(jié)果表明，成功合成了螺蟲乙酯的半抗原。

1H NMR [600 MHz, 二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)] δ 12.86 (s, 1H, COOH), 8.41 (s, 1H, NH), 7.07 (d, 1H,J=7.5 Hz, H-5 Ph), 7.04 (d, 1H,J=18.4, 7.5 Hz, H-6 Ph), 6.85 (s, 1H, H-2 Ph), 4.29 (dd, 2H,J=45.1, 16.3 Hz, CH2COOH), 3.26 (s, 3H, OCH3), 3.15 (m, 1H, H-8’), 2.24 (s, 3H, OCH3), 2.05 (s, 3H, OCH3), 1.99 (m, 2H, H-7’/H-9’), 1.89 (m, 2H, H-6’/H-10’), 1.53 (m, 4H, H-6’/H-7’/H-9’/H-10’)。

13C NMR (151 MHz, DMSO) δ 171.19 (COOH), 171.12 (C-2’), 169.02 (C-4’), 135.05 (C-1 Ph), 134.46 (C-3 Ph), 131.97 (C-4 Ph), 131.27 (C-5 Ph), 129.72 (C-6 Ph), 128.89 (C-2 Ph), 106.95 (C-3’), 77.93 (C-8’), 66.87 (CH2COOH), 60.15 (C-5’), 55.36 (OCH3), 33.31and 32.63 (C-6’和C-10’), 27.89 (C-7’和C-9’), 20.89 (CH3-Ph), 19.47 (CH3-Ph)。

2.2 螺蟲乙酯人工抗原鑒定結(jié)果

SDS-PAGE中相對(duì)分子質(zhì)量小的化合物的電泳速度大于相對(duì)分子質(zhì)量大的化合物，故由附圖4(https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20211011.1812.006.html)可以看出，OVA和BSA的電泳速度大于螺蟲乙酯偶聯(lián)物，表明螺蟲乙酯偶聯(lián)物的相對(duì)分子質(zhì)量大于OVA和BSA的相對(duì)分子質(zhì)量，OVA和BSA的相對(duì)分子質(zhì)量分別約為44、66 kDa，螺蟲乙酯偶聯(lián)物的條帶也在44、66 kDa附近，證明螺蟲乙酯半抗原與OVA或BSA偶聯(lián)成功。

2.3 融合小鼠血清效價(jià)

融合前3 d對(duì)免疫的小鼠血清效價(jià)進(jìn)行檢測(cè)，選擇血清效價(jià)和抑制率高的小鼠加強(qiáng)免疫以備后續(xù)融合。其中，附表3(https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20211011.1812.006.html)顯示的是融合小鼠的血清效價(jià)，篩選出抗原抗體的組合為：包被抗原螺蟲乙酯-OVA 1∶16 000，血清1:8 000，此時(shí)該融合小鼠血清對(duì)1 000 μg/L螺蟲乙酯的抑制效率最高(92.7%)，該組合用于篩選細(xì)胞。以對(duì)照孔OD值與抑制孔之間的差值至少>1.0為標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)包被原稀釋1∶8 000時(shí)，融合小鼠的血清效價(jià)為16 000。

2.4 最佳抗原抗體工作濃度的確定

由附表4(https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20211011.1812.006.html)可知，當(dāng)包被原螺蟲乙酯-OVA稀釋16 000 倍(0.062 5 mg/L)、腹水(mAb 3D11G7)稀釋16 000倍時(shí)，對(duì)照孔的OD450nm值在1.00左右，且抑制孔的抑制率>90%，故該組合為建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的最佳抗原抗體工作濃度組合。

2.5 icELISA檢測(cè)螺蟲乙酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線

在最佳抗原抗體的工作濃度下，以一定濃度梯度的螺蟲乙酯為橫坐標(biāo)，其在450 nm處的OD值為縱坐標(biāo)，通過Logistic函數(shù)進(jìn)行擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示，抗體mAb 3D11G7的IC50值為2.1 μg/L，檢測(cè)范圍IC20～I(xiàn)C80為0.5～8.6 μg/L，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7。這表明，利用本研究設(shè)計(jì)合成的螺蟲乙酯半抗原偶聯(lián)大分子蛋白進(jìn)行免疫能夠制備出特異性識(shí)別螺蟲乙酯的單克隆抗體。

圖2 icELISA檢測(cè)螺蟲乙酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Inhibition curve of the icELISA for spirotetramat

2.6 抗螺蟲乙酯單克隆抗體特異性分析

為了評(píng)估抗螺蟲乙酯單克隆抗體mAb 3D11G7的特異性，選擇與螺蟲乙酯結(jié)構(gòu)類似的化合物進(jìn)行交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。單克隆抗體mAb 3D11G7與螺蟲乙酯的代謝物B-enol、B-glu的CR分別為72.4%和15.2%，與B-keto和B-mono幾乎沒有交叉反應(yīng)(CR< 0.01%)。螺蟲乙酯的完全抗原是通過B-enol的羥基與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)的，與羥基相對(duì)的B-enol另一部分暴露在載體蛋白表面，這就導(dǎo)致抗體mAb 3D11G7可以區(qū)分B-mono和B-keto中的吡咯烷環(huán)，但不能區(qū)分螺蟲乙酯中的碳酸乙酯基團(tuán)和B-glu中的糖苷基團(tuán)。由于螺蟲乙酯與其他的殺螨劑螺螨酯、乙螨唑、唑螨酯和噠螨靈的結(jié)構(gòu)差異相對(duì)較大，mAb 3D11G7與它們幾乎沒有交叉反應(yīng)(CR<0.01%)。

表1 螺蟲乙酯單克隆抗體的交叉反應(yīng)率Table 1 Cross-reactivity of the monoclonal antibodies against spirotetramat structural analogs

2.7 緩沖液中有機(jī)溶劑對(duì)icELISA的影響

為了評(píng)估緩沖液中的有機(jī)溶劑對(duì)icELISA的影響，選擇農(nóng)藥提取過程中最常用的兩種有機(jī)溶劑甲醇和乙腈，配制含不同濃度有機(jī)溶劑的PBSTG溶液，通過icELISA測(cè)定抗原抗體結(jié)合情況并計(jì)算IC50。如附圖5-A(https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20211011.1812.006.html)所示，當(dāng)甲醇的體積分?jǐn)?shù)為5%時(shí)，測(cè)得的IC50值為2.88 μg/L大于不含有機(jī)溶劑測(cè)得的IC50(2.1 μg/L)，且隨著甲醇濃度的增加，B0值變化不大，但I(xiàn)C50值逐漸增大，當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)，IC50為55.12 μg/L，這表明甲醇對(duì)mAb 3D11G7與包被原的結(jié)合能力有影響，且高濃度的甲醇使icELISA的靈敏度下降。如附圖5-B(https：//kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20211011.1812.006.html)所示，當(dāng)乙腈體積分?jǐn)?shù)為5%時(shí)，測(cè)得的IC50值為3.75 μg/L大于不含有機(jī)溶劑測(cè)得的IC50值(2.1 μg/L)，當(dāng)乙腈體積分?jǐn)?shù)由5%升高至10%，B0值變化不大，但I(xiàn)C50值由3.75 μg/L上升至6.84 μg/L，當(dāng)乙腈體積分?jǐn)?shù)由5%升高至20%，B0值由1.08降至0.55，IC50值由3.75 μg/L上升至14.73 μg/L，這表明乙腈對(duì)mAb 3D11G7與包被原的結(jié)合能力有影響，且高濃度的乙腈使icELISA的靈敏度下降。因此在使用icELISA測(cè)定樣品中的螺蟲乙酯時(shí)，應(yīng)將樣品提取液中的有機(jī)溶劑除去，再使用樣品稀釋液PBSTG復(fù)溶。

2.8 緩沖液的pH對(duì)icELISA的影響

為了評(píng)估緩沖液的pH對(duì)icELISA的影響，配制不同pH值的PBSTG溶液，通過icELISA測(cè)定抗原抗體結(jié)合情況并計(jì)算IC50值。如附圖6(https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20211011.1812.006.html)所示，不同pH值條件下的IC50值差異不大，但pH值為7.4時(shí)的B0值最大，即在該pH值條件下mAb 3D11G7與包被原的結(jié)合能力最強(qiáng)且靈敏度最高，故在測(cè)定實(shí)際樣品時(shí)，直接使用PBSTG溶液進(jìn)行復(fù)溶而無需調(diào)節(jié)稀釋液的pH值。

2.9 加標(biāo)回收率

采用加標(biāo)回收的方法評(píng)估基于抗螺蟲乙酯單克隆抗體建立的icELISA的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。根據(jù)GB 2763—2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》可知，我國(guó)蔬菜和水果中螺蟲乙酯的最大殘留限量(maximum residues limits，MRLs)為100～10 000 μg/L，獼猴桃除外(20 μg/L)。在河水中添加的螺蟲乙酯的水平分別為20、50、100、500 μg/L，用PBSTG稀釋后直接通過icELISA測(cè)定，結(jié)果如表2所示。在土壤、番茄和柑橘樣品中添加的螺蟲乙酯的水平分別為50、100、500、1 000 μg/L。由于有機(jī)溶劑對(duì)icELISA有影響，故使用甲醇提取后，需氮吹干燥以除去甲醇再進(jìn)行測(cè)定。在河水、土壤、番茄和柑橘基質(zhì)中，螺蟲乙酯的平均加標(biāo)回收率變幅為72.9%～110.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)的變幅為0.7%～12.6%，符合NY/T 788—2018《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》中不同添加水平對(duì)回收率和RSD的要求(表3)。

表2 icELISA 測(cè)定樣品中螺蟲乙酯的平均加標(biāo)回收率(n=3)Table 2 Recovery of spirotetramat determined by icELISA in spiked different samples (n=3)

2.10 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

為了進(jìn)一步驗(yàn)證基于抗螺蟲乙酯單克隆抗體開發(fā)的icELISA的可靠性，選擇UPLC-MS/MS進(jìn)行驗(yàn)證。使用icELISA和UPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定陰性柑橘樣品(不含螺蟲乙酯)和陽性柑橘樣品(隨機(jī)浸泡的盲樣)。如附圖7(https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20211011.1812.006.html)所示，icELISA與UPLC-MS/MS測(cè)定柑橘樣品結(jié)果的相關(guān)性R2=0.965 2，表明兩種方法的檢測(cè)結(jié)果具有一致性。如表3所示，icELISA和UPLC-MS/MS在3個(gè)陰性柑橘樣品中均未檢出螺蟲乙酯殘留。而icELISA測(cè)得柑橘陽性樣品中螺蟲乙酯的殘留量為38.10～454.49 μg/L。除獼猴桃外，我國(guó)蔬菜和水果中螺蟲乙酯的MRLs為100～10 000 μg/L(GB 2763—2021)，本研究開發(fā)的icELISA檢測(cè)范圍為0.5～8.6 μg/L，能夠滿足蔬菜和水果中螺蟲乙酯檢測(cè)的要求。

表3 icELISA和UPLC-MS/MS測(cè)定柑桔樣品中的螺蟲乙酯Table 3 Analysis of spirotetramat in different citrus samples by icELISA and UPLC-MS/MS

3 結(jié)論與討論

在我國(guó)，螺蟲乙酯的殘留定義是螺蟲乙酯和B-enol的總和，以螺蟲乙酯表示(GB/T 2763—2021)。因此，為了開發(fā)檢測(cè)螺蟲乙酯殘留的免疫方法，抗體應(yīng)該同時(shí)識(shí)別螺蟲乙酯和B-enol。CEVALLOS-CEDEO等[13-14]從螺蟲乙酯不同位點(diǎn)引入相似的連接臂，設(shè)計(jì)合成了2種半抗原，篩選出主要識(shí)別B-enol的單克隆抗體，建立相應(yīng)的免疫分析方法，但其僅測(cè)定了葡萄、葡萄汁和葡萄酒中的螺蟲乙酯，未測(cè)定其他基質(zhì)。在本研究中，半抗原是通過B-enol的羥基進(jìn)行衍生，合成步驟簡(jiǎn)單。雖然半抗原的結(jié)構(gòu)在酯基部分與螺蟲乙酯不同，但在與BSA或OVA偶聯(lián)后，螺蟲乙酯和B-enol的共同結(jié)構(gòu)暴露在載體蛋白表面，故篩選出的抗體mAb 3D11G7能夠同時(shí)識(shí)別螺蟲乙酯和B-enol?；诤Y選到的單克隆抗體，建立了icELISA，其IC50值為2.1 μg/L，最佳工作范圍為0.5～8.6 μg/L。在河水、土壤、番茄和柑橘樣品基質(zhì)中的平均加標(biāo)回收率為72.9%～110.1%。此外，icELISA還成功應(yīng)用于檢測(cè)陽性柑橘樣品中的螺蟲乙酯殘留，其結(jié)果與UPLC-MS/MS方法的檢測(cè)結(jié)果具有一致性。因此，本研究基于抗螺蟲乙酯單克隆抗體建立的icELISA是快速檢測(cè)蔬菜、水果和環(huán)境基質(zhì)中螺蟲乙酯殘留的良好選擇。