螺蟲乙酯及其代謝產(chǎn)物在獼猴桃中的殘留消解動態(tài)

黃玉南，喬成奎，龐濤，羅靜，龐榮麗，郭琳琳，李君，王瑞萍，謝漢忠

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所，農(nóng)業(yè)部果品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室（鄭州），河南鄭州 450009）（2.中檢溯源江蘇技術(shù)服務(wù)有限公司，江蘇南京 211215）

螺蟲乙酯（Spirotetramat）是2008年由拜耳作物科學(xué)公司開發(fā)的一種新型季酮酸衍生物類殺蟲劑，是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一雙向內(nèi)吸性廣譜殺蟲劑[1]，通過抑制昆蟲脂質(zhì)的合成，使昆蟲中毒死亡[1,2]。螺蟲乙酯為低毒性殺蟲劑，在土壤中易降解，可有效防治木虱、粉虱、介殼蟲、棉盲蝽等害蟲，且持效期長，可提供長達(dá)8周的有效防治[3～6]。螺蟲乙酯一旦進(jìn)入植物體內(nèi)被代謝 4種主要代謝產(chǎn)物，主要有螺蟲乙酯烯醇（B-enol）、螺蟲乙酯羥基（B-mono）、螺蟲乙酯醇酮（B-keto）和螺蟲乙酯烯醇糖苷（B-glu）[7]。文獻(xiàn)研究結(jié)果表明從螺蟲乙酯代謝物的生物活性研究來看，螺蟲乙酯烯醇的活性在4個(gè)代謝物中表現(xiàn)最好，是螺蟲乙酯在生物體內(nèi)起主要作用的活性分子。代謝后產(chǎn)生的螺蟲乙酯烯醇是一種弱酸，由于這種弱酸有著較小的油水分配系數(shù)[8]，使得它可以由木質(zhì)部和韌皮部，甚至對隱匿的害蟲及新出的牙葉進(jìn)行有效的預(yù)防保護(hù)[6]。

圖1 螺蟲乙酯及其4種代謝物的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formulas of spirotetramat and its four metabolites

目前，國內(nèi)關(guān)于螺蟲乙酯降解的研究已有報(bào)道，主要關(guān)注螺蟲乙酯本體的變化規(guī)律，如杜芳[9]、王玨[10]、吳育佳[11]、吳文鑄[12]等分別做了螺蟲乙酯在大豆、番茄、黃瓜、柑橘和土壤中降解研究。但是對螺蟲乙酯代謝產(chǎn)物的研究較少，Li[13]、Biju[14]和 Chahil[15]研究了螺蟲乙酯和3種代謝產(chǎn)物B-keto、B-glu、B-enol在辣椒中的變化規(guī)律，Chen Xiaojun[16]等研究了4種物質(zhì)在菠菜分布規(guī)律及代謝殘留水平。對于螺蟲乙酯及代謝產(chǎn)物在獼猴桃上的代謝均沒有研究。本研究通過采用QuEChERS及固相萃取法，建立了獼猴桃中螺蟲乙酯及4種代謝產(chǎn)物的LC-MSMS檢測方法，對螺蟲乙酯及代謝產(chǎn)物在桃上的消解動態(tài)和殘留規(guī)律進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，研究結(jié)果為該農(nóng)藥使用后果品的安全性評價(jià)，制定獼猴桃上的合理使用濃度、保障果品安全提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1290-6460 超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國Agilent公司；Oasis MAX固相萃取柱（150 mg/6 mL），美國waters公司；臺式高速冷凍離心機(jī)（H2050R），湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；氮?dú)獯蹈蓛x（BF2000），北京八方世紀(jì)科技有限公司；電熱板（EH20B），美國萊伯泰科儀器公司。

螺蟲乙酯（Spirotetramat）、螺蟲乙酯烯醇（B-enol）、螺蟲乙酯羥基（B-mono）、螺蟲乙酯醇酮（B-keto）、螺蟲乙酯烯醇糖苷（B-glu）標(biāo)準(zhǔn)品，均購自德國Dr.E公司；PSA，北京艾杰爾科技有限公司；乙腈、甲醇（均為HPLC級），購自美國Fisher公司；乙酸（分析純），萊陽市雙雙化工有限公司；甲酸（HPLC級），德國CNW公司；氨水（分析純），開封開化（集團(tuán)）有限公司，實(shí)驗(yàn)用水為屈臣氏蒸餾水。

施藥藥劑：22.4%螺蟲乙酯懸浮劑，拜耳股份公司（推薦在蘋果上的使用劑量3000倍～4000倍稀釋液，安全間隔期為21 d）。

1.2 田間試驗(yàn)

1.2.1 獼猴桃消解動態(tài)試驗(yàn)

以螺蟲乙酯試驗(yàn)藥劑，以獼猴桃為試驗(yàn)對象，以推薦高劑量的1.5倍（2000倍液）為施藥濃度，在施藥后0（2 h）、1、2、3、5、7、9、16、23、30、37 d采集樣品，研究施藥后螺蟲乙酯及其降解產(chǎn)物在獼猴桃中的降解變化規(guī)律。

1.2.2 土壤消解動態(tài)試驗(yàn)

選一塊30 m2樣地，單獨(dú)施藥，施藥濃度為2000倍稀釋液。設(shè)置3個(gè)重復(fù)小區(qū)。噴霧后分別于0（2 h）、1、2、5、7、9、16、23、30、37 d隨機(jī)取點(diǎn)5～10個(gè)，采用土鉆采集0～15 cm深度土壤1～2 kg，除去土壤中的碎石、雜草和植物根莖等雜物，過40目篩后保存于-20 ℃待測。

1.2.3 最終殘留試驗(yàn)

最終殘留試驗(yàn)施藥濃度為最高推薦使用量的常量組（3000倍液）和高量組（2000倍液），噴霧量為3000 L/hm2。于果實(shí)長到一半大小時(shí)開始第1次施藥，各施藥2和3次，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)2株獼猴桃樹，施藥間隔為10 d，處理間設(shè)保護(hù)帶。獼猴桃樣本的采樣時(shí)間為距離最后1次施藥后的7、14和21 d。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取樣品10.0 g（精確到0.01 g）于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋10 min，加入3～4 g NaCl（140 ℃，烘烤4 h），渦旋1 min，在5000 r/min下離心5 min；取上清液1.5 mL，加入30 mg PSA和50 mg無水硫酸鎂，振蕩1 min，10000 r/min下離心5 min；取上清液過0.22 μm有機(jī)濾膜，待測。

1.4 檢測條件

色譜條件：Agilent-Pcroshell 120 EC-C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm），柱溫35 ℃；A 為含0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～8 min、30%～90% B，8～9 min、90%～30% B，9～10 min、30%B；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量5 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI）；掃描模式：正離子模式；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；干燥氣溫度 350 ℃；干燥氣流速 8 L/min；鞘流氣溫度350 ℃，流速12 L/min；毛細(xì)管電壓：4000 V。

表1 螺蟲乙酯及4種代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜條件Table 1 Mass spectra of spirotetramat and its four metabolites

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置及基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別準(zhǔn)確稱取0.0100 g（精確至0.0001 g）螺蟲乙酯和 4種代謝產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解并定容至100.00 mL，分別配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，于-20 ℃下避光保存。分別移取各標(biāo)準(zhǔn)儲備液2.5 mL至10 mL容量瓶中，用乙腈定容，配成25.00 mg/L標(biāo)準(zhǔn)工作液，即用即配。

用空白獼猴桃和土壤樣品的提取液稀釋標(biāo)準(zhǔn)工作液，用乙腈稀釋，配置成系列濃度的螺蟲乙酯和4種代謝產(chǎn)物的混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中螺蟲乙酯和B-enol的質(zhì)量濃度為0.005、0.01、0.05、0.10、0.50、1.0、2.0 mg/kg，B-glu、B-keto和B-mono的質(zhì)量濃度為0.005、0.01、0.05、0.10、0.50 mg/kg。按1.4節(jié)條件進(jìn)行檢測。分別以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 添加回收實(shí)驗(yàn)

分別向空白獼猴桃和土壤樣品中添加4個(gè)水平的螺蟲乙酯及其4種代謝產(chǎn)物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加水平分別為0.05、1.0和2.0 mg/kg。按1.3節(jié)方法進(jìn)行前處理，按1.4節(jié)條件檢測，計(jì)算添加回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及作圖采用 Sigma Plot 12.0和Excel 2016處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的線性范圍、準(zhǔn)確度及精密度

從表2可知，在0.01、0.5和2.0 mg/kg的添加水平下，螺蟲乙酯和B-enol在獼猴桃和土壤中的回收率為75.49%～105.54%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.96%～7.91%；在0.01、0.05、0.10 mg/kg的添加水平下，B-glu、B-keto和 B-mono在獼猴桃和土壤中的回收率為73.97%～110.52%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.32%～7.65%。結(jié)果符合農(nóng)藥殘留檢測要求。

表2 螺蟲乙酯及代謝產(chǎn)物在獼猴桃和土壤中的添加回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Average recoveries and relative standard deviation (RSD) for spirotetramat and its metabolites in kiwifruit and soil (n=6)

2.2 螺蟲乙酯及代謝產(chǎn)物在獼猴桃果實(shí)上的消解動態(tài)

表3 螺蟲乙酯和B-enol在獼猴桃中的消解動態(tài)Table 3 Dissipation dynamics of spirotetramat and B-enol in kiwifruit

圖2 螺蟲乙酯和B-enol在獼猴桃中的動態(tài)變化Fig.2 Dynamic curve of spirotetramat and B-enol residue in kiwifriuts

圖3 B-mono和B-keto在獼猴桃中的動態(tài)變化Fig.3 Dynamic curve of B-mono and B-keto residue in kiwifruits

螺蟲乙酯在施藥2 h內(nèi)降解為B-enol、B-keto。之后隨著時(shí)間的延長，螺蟲乙酯、B-enol的含量呈降低趨勢，而 B-keto的含量呈增高趨勢；在施藥后 16 d后代謝產(chǎn)生B-mono，含量為0.001 mg/kg，在隨后的16 d到37 d的時(shí)間里，B-mono在獼猴桃中的含量呈逐漸增高的狀態(tài)。螺蟲乙酯的代謝產(chǎn)物B-glu幾乎未檢出。

施藥后2 h，螺蟲乙酯、B-enol的原始沉積量分別為0.54 mg/kg、1.71 mg/kg。以施藥后時(shí)間、殘留量繪制螺蟲乙酯、B-enol在獼猴桃果實(shí)上的殘留消解動態(tài)曲線。消解動態(tài)符合一級動力學(xué)模型，消解方程分別為ct=0.562e-0.170x（r=0.836）和ct=1.689e-0.108x（r=0.584），消解半衰期分別為4.08 d和6.39 d。施藥后螺蟲乙酯、B-enol 23 d轉(zhuǎn)化率分別為78.38%和62.35%。

2.3 螺蟲乙酯及代謝產(chǎn)物在土中的消解動態(tài)

圖4 螺蟲乙酯、B-enol和B-keto在土壤中的消解動態(tài)Fig.4 Dynamic curve of spirotetramat, B-enol and B-keto residue in soils

在螺蟲乙酯施入土壤后的 2 h內(nèi)，迅速降解為B-enol和B-keto。螺蟲乙酯、B-enol和B-keto的原始沉積量分別為0.40 mg/kg、1.53 mg/kg、0.28 mg/kg，之后隨著時(shí)間的延長螺蟲乙酯、B-enol和B-keto的含量逐漸降低。以施藥后時(shí)間、殘留量繪制螺蟲乙酯、B-enol和B-keto在土中的殘留消解動態(tài)曲線。消解動態(tài)符合一級動力學(xué)模型，消解方程分別為ct=0.285e-0.487x、ct=2.275e-0.348x、ct=0.408e-0.323x，半衰期分別為1.42 d、1.99 d和2.14d。施藥23 d后螺蟲乙酯、B-enol和B-keto的轉(zhuǎn)化率分別為98.48%、91.34%和92.13%。而螺蟲乙酯的代謝產(chǎn)物B-mono和B-glu在樣品中均沒有檢出。

表4 螺蟲乙酯、B-enol和B-keto在土壤中的消解動態(tài)Table 4 Dissipation dynamics of spirotetramat, B-enol and B-keto in soils

2.4 螺蟲乙酯及代謝產(chǎn)物在獼猴桃中的最終殘留

螺蟲乙酯分別按照2000倍和3000倍稀釋液噴施2次和3次，距末次施藥后7 d、14 d、21 d和28 d采樣測定，螺蟲乙酯在獼猴桃中的含量為 0.06～0.52 mg/kg。

獼猴桃中 B-enol的含量為 0.58～3.44 mg/kg，B-mono的含量為 0～0.02 mg/kg，B-keto的含量為0.09～0.35 mg/kg，B-glu在樣品中沒有檢出。

2.5 螺蟲乙酯及代謝產(chǎn)物在土中的最終殘留

螺蟲乙酯分別按照有效成分2000倍和3000倍劑量噴施2～3次，距末次施藥后7 d、14 d和28 d采樣測定，樣品中沒有螺蟲乙酯、B-mono、B-glu檢出，B-enol的含量為0～0.04 mg/kg，B-keto的含量為0～0.04 mg/kg。

表5 螺蟲乙酯及4種代謝產(chǎn)物在獼猴桃中的最終殘留量Table 5 The final residues of spirotetramat and its four metabolites in kiwifruits

表6 B-enol和B-keto在土壤中的最終殘留量Table 6 The final residues of B-enol and B-keto

3 結(jié)論

3.1 本文建立了螺蟲乙酯及其代謝產(chǎn)物在獼猴桃和土壤中的殘留檢測方法，準(zhǔn)確度和精密度較好，方法簡單便捷，能滿足對目標(biāo)物的快速檢測需求。

3.2 本研究測得螺蟲乙酯被施用到獼猴桃和土壤中后迅速降解為B-enol、B-keto，在獼猴桃中螺蟲乙酯、B-enol呈逐漸降低的趨勢，而B-keto和B-mono呈逐漸升高的趨勢；在土壤中螺蟲乙酯、B-enol、B-keto均呈逐漸降低趨勢，B-mono和B-glu在樣品中均沒有檢出。螺蟲乙酯和B-enol在土壤中的降解速度（1.42 d、1.99 d）快于在獼猴桃上的降解速度（4.08 d和6.39 d）。

3.3 目前螺蟲乙酯在蘋果樹、梨樹、柑橘樹和番茄上進(jìn)行了登記，在在獼猴桃上沒有進(jìn)行登記。推薦在蘋果樹上的施藥方式為3000～4000倍液噴施，在梨樹和柑橘樹上的推薦劑量為4000～5000倍液，安全間隔期分別為21 d、21 d和20 d；最多施用次數(shù)均為2次。本實(shí)驗(yàn)以3000倍液稀釋液噴施2次，28 d后，獼猴桃中螺蟲乙酯母體的殘留量為0.06 mg/kg，遠(yuǎn)高于我國制定的0.02 mg/kg的最大殘留限量值。因此螺蟲乙酯在獼猴桃中施用合適劑量還有待進(jìn)一步研究。