增香酵母對高鹽稀態(tài)薏仁碎米醬油風(fēng)味成分的影響

牟燦燦，盧紅梅，陳莉，常冬妹，張麗

（貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實驗室，貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽 550025）

薏仁米（Coix lachryma-jobiL.var.ma-yuenStapf），別名川谷、慧苡仁、苡仁米，俗稱“藥王米”、“回回米”等[1,2]，其為禾本科植物薏苡的干燥成熟種仁[3]，是一種藥食同源的優(yōu)質(zhì)禾谷物[4,5]，被譽(yù)為“世界禾本科植物之王”。薏仁米不僅富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、脂肪、淀粉、粗纖維、礦物質(zhì)和維生素等營養(yǎng)成分，還含有酯類、甾醇類、苯并唑酮類、酚類、多糖類和生物堿類等藥效成分[6]。經(jīng)現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，薏仁米具有抗氧化、抗炎癥、抗癌、降血糖和鎮(zhèn)痛止血等生理功效[7～11]。目前，大多數(shù)企業(yè)對薏仁米的加工仍處于粗放型加工模式，整米加工過程中會產(chǎn)生大量薏仁碎米，且碎米率高達(dá)30%以上，薏仁碎米與整米的營養(yǎng)價值相當(dāng)，而價格僅為整米的 1/6[12～14]。隨著對薏仁米開發(fā)利用的進(jìn)一步研究，將薏仁米豐富的營養(yǎng)成分和藥用價值引入日常調(diào)味品已成趨勢，旨在為人們提供一款藥食兼用的醬油。

醬油風(fēng)味成分復(fù)雜，種類豐富，主要有醇類、酯類、酚類、羧酸類、羰基化合物和呋喃類等多種成分，其間相互平衡制約、襯托助長，構(gòu)成醬油特有的醬香和酯香[15]。醬油香味與酵母有直接關(guān)系，酵母可利用醬醪中的還原糖進(jìn)行酒精發(fā)酵，發(fā)酵己糖生成醇，從而賦予醬油醇的香氣。在傳統(tǒng)釀造工藝中，酵母主要從環(huán)境中進(jìn)入醬油的后酵體系中參與醬油風(fēng)味物質(zhì)的形成[16]，但其數(shù)量和種類隨季節(jié)與環(huán)境而變，不利于醬油的規(guī)范生產(chǎn)。因此，向醬醪中添加增香酵母已成為提高醬油風(fēng)味的主要手段[17]。增香酵母是一類能合成具有芳香氣味的酯類物質(zhì)[18]，可改善用米曲霉釀造醬油的風(fēng)味單一及不飽和性，全面提高醬油的風(fēng)味及檔次[19～21]。目前，用于提高和加快醬油風(fēng)味成分形成的增香酵母主要有T酵母和S酵母[22]。在醬油釀造過程中添加增香酵母不僅能改善醬油的香味，提高其品質(zhì)，還能在一定程度上縮短醬油釀造所需時間，有利于控制醬油的釀造進(jìn)程。

在高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵過程中，增香酵母的添加時期及順序?qū)︶u油風(fēng)味具有重要影響。本試驗在薏仁碎米醬醪發(fā)酵過程中在不同時間和順序添加T酵母和S酵母，并對比分析醬油生香發(fā)酵前后主要的理化指標(biāo)、氨基酸組分及含量、風(fēng)味物質(zhì)成分的變化差異等，旨在為薏仁碎米醬醪增香酵母的添加工藝提供指導(dǎo)，為改善高鹽稀態(tài)薏仁碎米醬油風(fēng)味成分的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料

薏仁醬醪，來源于高鹽稀態(tài)發(fā)酵薏仁碎米醬油發(fā)酵過程樣品,（豆粕：薏仁碎米=3：2、米曲霉接種量0.20%、制曲溫度34.5 ℃、制曲時間49.5 h、每16 h翻曲一次、鹽水濃度為18 °Bé，其添加量為原料的2倍，于 250 mL三角瓶中進(jìn)行發(fā)酵）；魯氏酵母 AS 2.182，來源于中科院微生物研究所；球擬酵母 AS 2.222，來源于中科院微生物研究所。

1.1.2 主要試劑

重鉻酸鉀，天津市大茂化學(xué)試劑廠；硫酸，天津化學(xué)試劑三廠；硫酸鉀，天津市大茂化學(xué)試劑廠；硫酸銅，天津市北聯(lián)精細(xì)化工開發(fā)有限公司；氫氧化鈉，重慶茂業(yè)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖，天津市協(xié)和昊鵬色譜科技有限公司；乳酸，重慶川江化學(xué)試劑廠；甲醛，成都金山化學(xué)試劑有限公司；硼酸，天津市瑞金特化學(xué)品有限公司等，以上試劑均為分析純（AR）。

1.2 主要儀器

CJJ-781磁力攪拌器，城西曉陽電子儀器廠；101-1電熱恒溫干燥箱，北京科偉永興儀器有限公司；pHS-3C數(shù)顯酸度儀，上海虹益儀器儀表有限公司；FA2004N電子分析天平，上海菁海儀器有限公司；722S可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；HP6890/5975C GC/MS聯(lián)用儀，安捷倫科技有限公司；HH-b型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州奧華儀器有限公司；220V.AC 1000W萬用電爐，天津市泰斯特儀器有限公司等。

1.3 試驗方法

1.3.1 酵母的添加及發(fā)酵過程管理

將剛制得的高鹽稀態(tài)醬醪進(jìn)行淋油并充分?jǐn)嚢瑁匀帐礁啕}稀態(tài)醬油的發(fā)酵工藝進(jìn)行發(fā)酵，先將其混勻并分裝至9個容器中，置于15 ℃的生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行醬油前期發(fā)酵，每天攪拌1次至第15 d，按表1添加 2×106個/g(醬醪)酵母，隨后每天升高發(fā)酵溫度1 ℃，直至30 ℃并保持，持續(xù)發(fā)酵到第45 d；再按表1添加酵母2×106個/g(醬醪)，以9號樣品為空白對照；發(fā)酵約90 d時，控制醬醪發(fā)酵溫度于35 ℃到發(fā)酵結(jié)束，整個發(fā)酵周期為180 d[23]。

醬醪取樣：在無菌條件下將醬醪攪拌均勻，各稱取10.00 g，用100 mL容量瓶定容，靜置過濾，待測。

表1 酵母的添加方式Table 1 The way of yeast addition

1.3.2 醬醪中各理化指標(biāo)的測定

包括總酸、氨基酸態(tài)氮和還原糖含量的測定，測定方法具體參照標(biāo)準(zhǔn)《GB18186-2000釀造醬油》[24]。

1.3.3 氨基酸的測定

采用日立 L-8800氨基酸自動分析儀對醬醪中氨基酸進(jìn)行測定，測定過程委托貴州大學(xué)南區(qū)分析測試中心，樣品預(yù)處理采用GB/T 5009.124-2003進(jìn)行處理。儀器進(jìn)樣時泵1壓力為2～15 Mpa，流速為0.4 mL/min，儀器進(jìn)樣時泵 2壓力為 0.5～2 MPa，流速為 0.35 mL/min。

1.3.4 揮發(fā)性成分分析

頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用（HS-SPME-GC-MS）。

1.3.4.1 固相微萃取

取研碎樣品1 g，置于10 mL固相微萃取儀采樣瓶中，插入裝有纖維頭的手動進(jìn)樣器，于100 ℃條件下頂空萃取40 min，快速移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進(jìn)樣口(溫度250 ℃)中，熱解析5 min進(jìn)樣。

1.3.4.2 氣相條件

毛細(xì)管色譜柱：ZB-5MSI 5%苯基二甲聚硅氧烷毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；柱溫40 ℃（保留2 min），以5 ℃/min程序升溫至255 ℃，運(yùn)行時間45 min，汽化室溫度250 ℃，載氣為高純He（99.999%），柱前壓7.62 psi，載氣流量1.0 mL/min，不分流進(jìn)樣，溶劑延遲時間為1 min。

1.3.4.3 質(zhì)譜條件

GC-MS接口溫度280 ℃，EI離子源，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，電子能量70 eV，發(fā)射電流34.6 μA；倍增器電壓1624 V，質(zhì)量范圍29～500 u，對總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜計算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對Nist 2005和Wiley 275標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖，初步鑒定出42種揮發(fā)性化學(xué)成分，用峰面積歸一化法測定了各化學(xué)成分的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

用Origin 8.6、Excel 2016等軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，每組進(jìn)行3次平行試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 還原糖含量

圖1 醬醪中還原糖含量Fig.1 The content of reducing sugar in soy sauce

還原糖含量對醬油風(fēng)味的形成至關(guān)重要，由淀粉質(zhì)原料分解產(chǎn)生，不僅有助于生色，還能被酵母利用生成醇、酸、酯等香氣成分[25]，是評價醬油品質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo)。由圖1可知，樣品1～9所含還原糖含量相差甚小，僅樣品7中還原糖含量最高，其含量與空白組相比僅增長了2.8%，結(jié)果表明，添加增香酵母對醬油中所含還原糖含量并無顯著影響。與資料報道的添加增香酵母僅加速了還原糖的消耗速率，而對發(fā)酵后醬醪中還原糖的含量影響并不明顯[26]一致。

2.2 總酸含量

總酸含量是反映醬油品質(zhì)的主要指標(biāo)之一，各有機(jī)酸與相應(yīng)醇類經(jīng)酯化反應(yīng)可生成具有芳香氣味的各種酯，從而賦予醬油特殊的風(fēng)味[27]，但過高的總酸能使醬油酸味突出，降低醬油的品質(zhì)?！禛B2717-2003醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》[28]中嚴(yán)格規(guī)定總酸含量不得超過 2.5 g/100 mL，本試驗所檢出的總酸含量均在標(biāo)準(zhǔn)限值之下，如圖2。

圖2中，醬油中總酸按含量從多到少進(jìn)行排序分別為在發(fā)酵前后期分別添加兩種增香酵母＞單一添加增香酵母＞不添加增香酵母＞在同一發(fā)酵時期同時添加兩種增香酵母，且樣品7中總酸含量最高，比空白組增長了14.63%，在標(biāo)準(zhǔn)限值下對醬油風(fēng)味的形成貢獻(xiàn)最大。

圖2 醬油中總酸含量Fig.2 The content of total acid in soy sauce

2.3 氨基酸態(tài)氮含量

氨基酸態(tài)氮是指以氨基酸形式存在的氮元素含量，主要由游離氨基酸和小分子低聚肽中的氮元素組成[29]，氨基酸態(tài)氮是醬油呈鮮味成分的特征指標(biāo)，其含量高低可表示醬油的鮮味程度，氨基酸態(tài)氮含量越高，蛋白質(zhì)分解越充分，醬油風(fēng)味越好，是評價釀造醬油品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。如圖3所示，所有樣品中氨基酸態(tài)氮含量高達(dá)0.8 g/100 mL，均達(dá)到國家一級醬油標(biāo)準(zhǔn)。

圖3 醬油中氨基酸態(tài)氮含量Fig.3 The content of amino niteogen in soy sauce

圖3中，樣品1～4、7～8與空白組中氨基酸態(tài)氮含量相近，表明在同等發(fā)酵方式發(fā)酵條件下，添加增香酵母不會對薏仁碎米醬油中氨基酸態(tài)氮的含量造成很大影響，而同時添加兩種增香酵母的樣品5、6中氨基酸態(tài)氮含量則明顯低于空白組，分析可能是總酸含量降低所致；由圖3所示，樣品7、8與樣品1～4相比，其氨基酸態(tài)氮含量相對較高，表明分別在不同發(fā)酵時期添加兩種增香酵母時氨基酸態(tài)氮含量較高，樣品7中氨基酸態(tài)氮含量高達(dá)0.872 g/100 mL，略高于樣品8，其含量與未添加增香酵母的樣品9相比增長了2.41%，因此，為提高醬油風(fēng)味，樣品7是較好的添加方式。

2.4 酵母的不同添加方式對氨基酸種類以及含量的影響

采用氨基酸自動分析儀對添加增香酵母的薏仁碎米醬醪中氨基酸的組成并進(jìn)行定量分析，結(jié)果如表 2所示。

表2 醬醪中氨基酸組成Table 2 Free amino acid composition of soy sauce moromi

氨基酸是醬油中最重要的營養(yǎng)物質(zhì)及質(zhì)量評價指標(biāo)，其含量越高，醬油品質(zhì)越高[30]。本試驗主要檢出谷氨酸、天冬氨酸、纈氨酸、脯氨酸、絲氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸等18種氨基酸，賦予了醬油酸、甜、苦、鮮等風(fēng)味，其中呈苦味氨基酸種類占總氨基酸50%，且其含量占總含量 34.32%～40.09%，適量的苦味能賦予醬油更多醇厚風(fēng)味；谷氨酸是醬油鮮味的主要成分，表2中，谷氨酸占總氨基酸含量比例最高，且樣品7中其含量最高，因而對醬油鮮味貢獻(xiàn)最大；由表2可知，酵母的添加均能有效提高醬油中氨基酸含量，其中樣品7中總氨基酸含量高達(dá)13.08 g/100 g，其含量與空白組相比增加了60.88%，且與樣品8相比增加了4.64%。因此，在發(fā)酵第15 d和45 d分別添加T酵母和S酵母能明顯提高醬油中氨基酸的種類和含量，從而提高醬油品質(zhì)。

2.5 酵母的不同添加方式對薏仁碎米醬油揮發(fā)性成分的影響

利用GC-MS對所得醬油的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，其結(jié)果如表3所示。

表3 揮發(fā)性成分的百分含量Table 3 The percentage of volatile components

注：ND表示未檢出。

如表3，已添加增香酵母的樣品7、8均含有42種風(fēng)味成分，其總相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 79.619%和71.75%，而空白組中僅含 33種風(fēng)味成分，且其總相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為 36.063%，表明添加增香酵母不僅能賦予醬油某些特有的風(fēng)味成分，還能提高醬油中某些風(fēng)味成分的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

酯類化合物是構(gòu)成醬油風(fēng)味的主體物質(zhì)，在醬油中起著香甜、濃郁而柔和的基底作用。如表3所示，本試驗共檢出 12種酯類，其中乙酸乙酯所占比例最高，其相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)3.359%，具有強(qiáng)烈的水果香氣，能使醬油香味更為醇厚，對醬油的咸味也有一定緩沖作用，還能平衡醬油的風(fēng)味[31]；不同酯類混合能賦予醬油豐厚濃郁的風(fēng)味，如月桂酸乙酯具有花生香味，棕櫚酸乙酯能產(chǎn)生微弱的果香和奶油香氣等，與空白組相比其相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大幅度提升，對醬油繁雜的風(fēng)味具有很大貢獻(xiàn)。

醇類化合物在醬油風(fēng)味成分中含量最多[32]，對醬油的香氣貢獻(xiàn)較大。由表3所示，本試驗所檢出的醇類化合物有7種，且樣品7中相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，高達(dá)28.73%，以苯乙醇為代表，樣品7中其相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)13.954%，明顯高于空白組，苯乙醇具有獨(dú)特的紫羅蘭香、丁香、茴香味、蜂蜜味及青甜玫瑰等多種香氣，是醬油中關(guān)鍵的風(fēng)味化合物，添加增香酵母使其相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)大幅度提升，對醬油風(fēng)味的形成具有很大影響；3-甲基丁醇具有蘋果白蘭地的香氣和辛辣味，1-辛烯-3-醇具有愉快的壤香香氣，有類似于甘草、薰衣草及玫瑰的香氣[33]。表3中，3-甲基丁醇、1-辛烯-3-醇及戊醇的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)與空白組相比也顯著增加，賦予了醬油獨(dú)特的風(fēng)味。

醛類具有辛辣刺激氣味，微量的醛對醬油的香氣具有調(diào)和功效，其主要來源于微生物的轉(zhuǎn)化和氨基酸降解[34]，能與酵母代謝產(chǎn)生的醇類或硫化物反應(yīng)，形成新的香氣，使醬油的風(fēng)味更繁雜。表3中，7、8號樣品中檢出6種醛類化合物，其中苯乙醛、3-甲基丁醛和2-甲基丁醛的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯提高，對醬油香氣貢獻(xiàn)很大，且樣品7中相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高；酮類化合物具有果香和甜香的焦糖氣味，如表3，樣品7中苯乙酮相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，且具有令人愉悅的香氣，對醬油特有的風(fēng)味具有一定的貢獻(xiàn)。

醬油中酸類以乙酸為代表，其具有獨(dú)特的香味，能與醬油中醇類發(fā)生酯化反應(yīng)而產(chǎn)生酯類物質(zhì)，增加醬油的酯香味，因此，乙酸對醬油風(fēng)味具有關(guān)鍵作用，表3中，樣品7中乙酸相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.105%。

酚類以4-乙基愈創(chuàng)木酚為代表，其具有典型的醬香和煙熏氣味，其香氣特征明顯，香氣活性強(qiáng)，是提高醬油香氣的關(guān)鍵[35]，雖然檢出的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)很少，但對醬油風(fēng)味的改善具有重大影響。由表3所示，空白組中并未檢出4-乙烯基愈創(chuàng)木酚，添加增香酵母的樣品7、8中其相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高達(dá)0.7%以上，對提高醬油的醬香氣起著舉足輕重的作用。

吡嗪類具有堅果和焙烤等香氣，是醬油醬香味的來源。本試驗所檢出吡嗪類化合物的相對含量較高，以樣品7最為顯著，以該種方式添加產(chǎn)香對醬油的醬香味貢獻(xiàn)最大。

綜上，添加增香酵母的7、8號樣品中的風(fēng)味物質(zhì)種類和相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯高于空白組，尤其是醇類和酯類，而樣品7風(fēng)味物質(zhì)的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)略高于樣品8，使醬油香氣更繁雜，醬味更突出。因此，以7號樣品添加酵母的方式最為適宜，可改善和提高薏仁碎米醬油的風(fēng)味和品質(zhì)。

3 結(jié)論

為探討增香酵母的不同添加方式對薏仁碎米醬油各指標(biāo)及風(fēng)味的影響，通過對薏仁碎米醬醪中還原糖、總酸、氨基酸態(tài)氮及氨基酸的含量進(jìn)行測定，并采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析了醬油風(fēng)味成分種類及含量。結(jié)果表明：在醬醪發(fā)酵第15 d和45 d分別添加T酵母和S酵母2×106個/g(醬醪)時，醬醪中還原糖、總酸、氨基酸態(tài)氮及總氨基酸含量與空白組相比分別增加了2.8%、14.63%、2.41%及37.84%，且醬油中酯類和醇類的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)也顯著提高，與未添加增香酵母的9號空白組相比分別由原來的4.586%和7.120%提高至15.604%和28.733%。表明在高鹽稀態(tài)薏仁碎米醬油發(fā)酵過程中添加增香酵母至關(guān)重要，直接影響醬油中典型風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生及其相互間的協(xié)調(diào)作用，使醬油酯香和醇香濃郁，香氣柔和，極大改善了醬油的風(fēng)味。