不同核酸提取方法用于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測大西洋鮭魚的比較分析

李秋萍，許文杰，崔曉文，操敏，熊曉輝,2，熊雄*

1(南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京，211816)2(江蘇省食品安全快速檢測公共技術(shù)服務(wù)中心，江蘇 南京，211816)

大西洋鮭魚(Salmosalar)是一種洄游性深海魚類，其肉質(zhì)鮮美，口感滑嫩，被譽為“魚中至尊”。其富含二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)等多種生物活性物質(zhì)[1]，對高血壓、肥胖等疾病均有益處，深受消費者的青睞。

大西洋鮭魚常以刺身的形式出現(xiàn)在餐桌上，除此之外，還被加工成煙熏鮭魚、油炸鮭魚等不同風(fēng)味的產(chǎn)品。然而，由于加工導(dǎo)致大西洋鮭魚外形特征受損，以至于無法通過肉眼對魚肉加工制品進行物種判別。在這種情況下，一些不法商販利用低價的淡水虹鱒魚等其他魚類假冒替代高價的大西洋鮭魚[2]。這種以假亂真、摻假造假的行為不僅嚴(yán)重?fù)p害了消費者的經(jīng)濟利益，更可能引發(fā)食品安全問題。因此，建立快速有效的大西洋鮭魚鑒定方法迫在眉睫。

基于DNA的檢測方法已經(jīng)成為水產(chǎn)品中魚類品種鑒定的重要手段[3]。常見的方法有DNA條形碼[4]、熒光PCR(real-time PCR)[5]、多重PCR(multiplex PCR)[6]和環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)[7]。其中，LAMP技術(shù)具有特異性強、靈敏度高等特點，且不需要昂貴的設(shè)備，僅需1臺水浴鍋即可在1 h內(nèi)完成擴增[8]，可以滿足現(xiàn)場檢測的需要。目前，LAMP技術(shù)已被用于歐洲鰻魚[9]、金槍魚[10]、美洲大赤魷[11]等多種水產(chǎn)品的真?zhèn)舞b定研究。

高效快速的DNA提取有助于現(xiàn)場檢測，而獲得高質(zhì)量的DNA更是保證LAMP反應(yīng)順利進行的關(guān)鍵。十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfonate，SDS)法是從動物肌肉組織中提取DNA的常用方法，聯(lián)合利用蛋白酶K對細(xì)胞進行消化，可獲得高純度的DNA[12]。但提取過程操作繁瑣、耗時長。為此，許多研究致力于研發(fā)更簡便高效的提取方法。ANDREA等[13]在含有SDS的魚肉組織裂解液中加入玻璃珠，通過振蕩研磨加速細(xì)胞裂解，同時降低了成本。XIONG等[14]通過煮沸裂解液，加速了十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammonium bromide，CTAB)對魚肉組織的消化，將整個提取耗時縮短至15 min。TAGLIAVIA等[15]提出的堿裂解法簡化了提取的步驟，通過使用氯化鉀裂解細(xì)胞，同時加入TritonX-100以增強裂解效果，最終獲得的DNA滿足PCR擴增及后續(xù)分析。此外，使用商品試劑盒也能獲得高純度的DNA，但DNA損失量大，得率相對較低。

本研究以大西洋鮭魚為對象，模擬設(shè)計了4種前處理方式，并用SDS、市售試劑盒等5種常見提取方法進行DNA提取(圖1)。通過對比DNA得率及純度，分析不同提取方法的優(yōu)劣。同時，對5種提取方法所得DNA進行LAMP，結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳及熒光可視化檢測，進一步驗證這5種提取方法對LAMP技術(shù)的適用性。

a-Takara；b-Tiangen；c-SDS；d-Tagliavia；e-Heating； n-無菌水；m-DL 100 marker圖1 不同DNA提取方法的比較研究示意圖Fig.1 Schematic procedure for the comparative study of different DNA extraction methods

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 樣品采集

從南京市浦口區(qū)永輝超市采購1份新鮮的大西洋鮭魚，樣品抵達(dá)實驗室后進行標(biāo)記和拍照，按照樣品制備方案進行處理。

1.1.2 實驗試劑

細(xì)胞/血液/組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)、100 bp DNA Ladder，天根生化科技(北京)有限公司；Takara細(xì)胞/血液/組織基因組DNA提取試劑盒，寶生物工程(大連)有限公司；2×Lamp PCR Master Mix(Universal)、引物合成、蛋白酶K、TritonX-100，生工生物工程(上海)股份有限公司；6×Loading Buffer，寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；瓊脂糖凝膠，西班牙Biowest公司；GelRedTM核酸凝膠染料，美國Biotium公司；SYTOTM9 green fluorescent nucleic acid stain，賽默飛世爾科技公司；SYBR Green Ⅰ 染料(10 000×)，北京索萊寶科技有限公司；NaCl、NaH2PO4、Na2EDTA、異丙醇，西隴科學(xué)股份有限公司；SDS、Tris、KOH、CH3COONa，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；乙醇，無錫市亞盛化工有限公司；Tris-HCl，阿拉丁試劑(上海)有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

BioPhotometer D30核酸蛋白測定儀，德國艾本德股份有限公司；Sigma 1-14小型臺式高速離心機，北京維欣儀奧科技發(fā)展有限公司；Tannon-1600凝膠成像儀，上海天能科技有限公司；JY300C凝膠電泳儀、JY-SPFT電泳槽，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；GWA-UNI-F40純水/超純水器，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；MS-100恒溫混勻儀，杭州奧盛儀器有限公司；全自動醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)(Gentier 96E)，西安天隆科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備

將待測魚肉組織樣本清洗后進行以下4種前處理：

(1)新鮮處理(Ax)為清洗后直接進行DNA提??；(2)凍藏處理(Bd)為-20 ℃貯藏6個月；(3)冷凍處理(Cl)為-20 ℃貯藏1周；(4)煎炸處理(Dy)為30 min鹽腌后，煎炸5 min。

1.2.2 DNA提取

稱取50 mg樣本至1.5 mL離心管中，將樣品剪碎后采用以下5種方法進行DNA提取。

1.2.2.1 Takara細(xì)胞/血液/組織基因組DNA提取試劑盒

按照試劑盒說明書提取DNA，最后移取200 μL上層清液至新的離心管并保存于-20 ℃。

1.2.2.2 細(xì)胞/血液/組織基因組DNA提取試劑盒

按照試劑盒說明書提取總DNA，最后用100 μL TE洗脫液洗脫DNA，室溫放置5 min后以12 000 r/min 離心2 min，將溶液收集到離心管中并置于-20 ℃保存。

1.2.2.3 SDS法提取

根據(jù)ANDREA等[13]的提取方法并加以改進。在裝有樣品的離心管中加入200 μL裂解液I 20 g/L SDS，0.1 mol/L NaCl，0.1 mol/L EDTA，0.5 mol/L Tris，pH=8.0)、200 μL磷酸緩沖液(0.3 mol/L NaH2PO4，pH=8.0)和20 μL蛋白酶K(20 mg/mL)，將其置于恒溫混勻儀中，60 ℃處理60 min。14 000 r/min離心5 min后移取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管，并加入0.5倍體積CH3COONa溶液(4 mol/L，pH=8.2)?；靹蚝?4 000 r/min離心5 min。移取上層清液至新管，并加入0.6倍體積異丙醇，靜置10 min。14 000 r/min離心10 min后，用800 μL 70%乙醇和無水乙醇分別對DNA清洗2次和1次。將裝有DNA的離心管置于65 ℃烘箱中干燥20 min。最后，加入50 μL無菌水溶解DNA，置于-20 ℃保存。

1.2.2.4 Tagliavia法提取

參照TAGLIAVIA等[15]的提取方法。在裝有樣品的離心管中加入100 μL裂解液Ⅱ(200 mmol/L KOH，2 mmol/L Na2EDTA，2 g/L TritonX-100)，置于恒溫混勻儀中，60 ℃處理10 min。加入3倍體積的100 mmol/L Tris-HCl溶液，振蕩混勻后置于恒溫混勻儀中，85 ℃處理10 min。最后，移取200 μL上層清液至新管，置于-20 ℃保存。

1.2.2.5 Heating法提取

根據(jù)XIONG等[16]的提取方法并加以改進。加入200 μL裂解液Ⅲ(20 g/L SDS，2 mol/L NaCl，200 mmol/L KOH，0.5 mol/L Tris，pH=8，使用前需置于56 ℃烘箱加熱至澄清)、200 μL磷酸緩沖液(0.3 mol/L NaH2PO4，pH=8.0)，置于恒溫混勻儀中，100 ℃ 處理10 min。14 000 r/min離心5 min后小心吸取200 μL上層水相至新管。隨后加入等體積CH3COONa溶液(4 mol/L，pH=8.2)，振蕩混勻。14 000 r/min離心5 min，取200 μL上清液至新管，置于-20 ℃保存。

1.2.3 DNA濃度及純度測定

采用BioPhotometer D30核酸蛋白測定儀檢測DNA濃度、A260/A280和A260/A230的比值，以評估提取的DNA的質(zhì)量和雜質(zhì)去除情況。

1.2.4 LAMP反應(yīng)體系的建立

本研究所用的大西洋鮭魚特異性引物為本課題組前期研究成果[16]。

LAMP反應(yīng)體系共計25 μL，各成分含量為：內(nèi)引物Sal1-FIP、Sal1-BIP各0.8 μmol/L，外引物Sal1-F3、Sal1-B3各0.2 μmol/L，12.5 μL的2×Lamp PCR Master Mix，0.16 U/μL DNA聚合酶，0.2 μmol/L SYTO 9染料，50 ng模板DNA，無菌水補足至25 μL。LAMP擴增條件為65 ℃恒溫擴增60 min，80 ℃保溫10 min進行DNA聚合酶滅活，1 min收集1次熒光信號進行實時熒光觀察。以10倍的濃度將DNA進行濃度梯度稀釋(50 ng～5 pg)，通過LAMP反應(yīng)進行靈敏度評估。

LAMP擴增反應(yīng)產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。此外，通過添加0.1 μL SYBR Green Ⅰ(10 000×)在紫外下進行可視化檢測。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

DNA的得率及純度的結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。所有數(shù)據(jù)使用SPSS統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析，并采用單因素方差分析(one way analysis of variance)對DNA得率、純度及Ct值進行顯著性檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA的濃度與純度

2.1.1 DNA得率

5種不同提取方法的DNA得率如表1和圖2所示。5種提取方法的DNA得率為(0.08±0.0.1)～(3.26±0.98) ng/g。在相同的前處理方式下，采用5種提取方法所得DNA得率均存在著極顯著的差異(P<0.01)。其中，Tagliavia的得率最高[(3.26±0.98)ng/g]，其次是Takara、Heating、SDS、Tiangen。而采用同一提取方法對不同前處理的樣品進行DNA提取，除了Takara外，其他4種提取方法的DNA得率均存在著極顯著的差異。

總體來看，Tiangen、SDS以及Heating這3種提取方法的DNA得率較低，這主要歸因于它們都具備一定的DNA純化步驟。純化洗脫次數(shù)越多，DNA的損失越大。研究發(fā)現(xiàn)，DNA得率受樣品加工處理的影響。對于煎炸處理的樣品，DNA得率從為(0.10±0.03)～(3.26±0.98) ng/g，得率相差近30倍。導(dǎo)致該現(xiàn)象的原因主要有2個，一是高溫處理導(dǎo)致DNA降解，從而對含量測定造成誤差[17]；二是鹽腌及煎炸過程中殘留的有機物對含量測定造成影響[18]。

表1 五種提取方法的DNA得率 單位：ng/g

A-DNA得率；B-A260/A230；C-A260/A280；D-Ct值圖2 五種提取方法的DNA得率、純度及LAMP反應(yīng)的Ct值Fig.2 Yield and purity of DNA with five extraction methods and Ct value of LAMP amplification

2.1.2 DNA純度

5種不同提取方法的純度測定結(jié)果如表2、表3和圖2所示。在相同的前處理方式下，各種提取方法所得A260/A280值均存在著極顯著的差異(P<0.01)；而在5種提取方法中，僅有Tiangen提取DNA的A260/A280值在不同前處理間無顯著差異。

已有研究表明，A260/A280為1.6～1.9的DNA粗提取液可被用于肉制品鑒定[19]。由表2可知，Tiangen、SDS等具有純化步驟的提取方法所得DNA的A260/A280值在該范圍內(nèi)，由此說明了這2種提取方法均可獲得高質(zhì)量的DNA，更適合用于后期的檢驗工作。Heating及Tagliavia提取所得DNA的A260/A280值超出該范圍，表明這2種方法導(dǎo)致殘留較多的游離核苷酸、單鏈DNA和RNA，這些物質(zhì)在260 nm處產(chǎn)生較高的吸收值。Takara的A260/A280值最小，表明了提取混合物中可能殘留大量的蛋白質(zhì)及其他雜質(zhì)。

表2 五種提取方法所得DNA的A260/A280值Table 2 A260/A280 values of DNA extracted by fiver methods

表3 五種提取方法所得DNA的A260/A230值Table 3 A260/A230 values of DNA extracted by fiver methods

A260/A230比值(一般范圍在2.0～2.2)被用來反映DNA樣品中是否存在碳水化合物、多肽或鹽類等物質(zhì)[20]。由圖2可知，僅有SDS提取的樣本DNA的A260/A230值接近該范圍。這說明了SDS方法可消除大量的碳水化合物。而其他4種提取方法，不論采用何種前處理方式，所得DNA的A260/A230值都遠(yuǎn)低于正常范圍，最高只有0.8±0.06。由此可知，加工程度及提取方法對DNA的A260/A230值都具有較大影響。

2.2 LAMP擴增

由圖3可知，所有提取方法得到的DNA均能用于LAMP擴增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果均呈現(xiàn)出典型的梯形條帶，熒光可視化檢測結(jié)果也證實了LAMP反應(yīng)成功地擴增了靶標(biāo)。對于不具有純化步驟的提取方法(Takara和Tagliavia)，所得DNA同樣可以通過LAMP反應(yīng)進行擴增。這可能與DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性以及LAMP技術(shù)對反應(yīng)抑制物有著更高耐受性有關(guān)[21]。

在LAMP反應(yīng)中添加SYTO 9染料可實現(xiàn)實時熒光檢測。LAMP擴增曲線直觀地展示出了純化類及非純化類的提取方法的差異，通過分析各樣本的Ct值，發(fā)現(xiàn)該值在4種前處理及5種提取方法間均存在著極顯著的差異(表4、圖2)。

表4 五種提取方法的Ct值Table 4 Ct value extracted by five methods

a-Takara；b-Tiangen；c-SDS；d-Tagliavia；e-Heating；n-無菌水；m-DL 100 marker A-新鮮處理(Ax)；B-凍藏(6個月)處理(Bd)；C-冷凍(1周)處理(Cl)；D-煎炸處理(Dy)圖3 用5種方法提取4種不同前處理樣品的DNA進行LAMP擴增、瓊脂糖凝膠電泳及可視化檢測的結(jié)果Fig.3 Results of LAMP amplification, agarose gel electrophoresis and visual detection of DNA form four different pretreatment samples extracted by five methods

在多數(shù)提取方法中，新鮮程度越高的樣品可獲得較小的Ct值。其中，Tiangen和SDS獲得的DNA在LAMP反應(yīng)中的Ct值最小。即這2種方法所得的DNA在LAMP反應(yīng)中最早出現(xiàn)擴增信號，印證了這2種提取方法具有較好的純化效果。其他3種提取方法的擴增曲線后移可能是DNA提取中使用的化學(xué)物質(zhì)殘留導(dǎo)致信號延遲。

2.3 不同提取方法的靈敏度測定

選擇前處理為凍藏的DNA樣品進行濃度梯度稀釋，通過LAMP反應(yīng)測定靈敏度。已有研究表明，熔解曲線分析可被用于物種鑒定分析[22]。因此，可結(jié)合實時熒光曲線和熔解峰曲線對不同提取方法用于LAMP反應(yīng)的適用性進行評價。

由圖4可知，Tiangen和SDS提取所得DNA最低檢測可達(dá)5 pg；Heating可達(dá)0.05 ng；Tagliava可達(dá)0.5 ng；Takara可達(dá)5 ng。Tiangen和SDS的靈敏度高，熔解峰趨于重合，進一步展現(xiàn)了這2種提取方法的優(yōu)勢。同時，由圖4可得大部分的熔解峰峰值在84.5～85 ℃。Heating、Tagliavia和Takara所得的熔解曲線出現(xiàn)偏離的峰，這很有可能是發(fā)生了非特異性擴增[23]。

Ⅰ：50 ng/μL，Ⅱ：5 ng/μL，Ⅲ：0.5 ng/μL，Ⅳ：0.05 ng/μL，Ⅴ：5 pg/μL A-Takara；B-Tiangen；C-SDS；D-Tagliavia；E-Heating圖4 用LAMP反應(yīng)對5種方法提取的凍藏處理樣品的DNA進行靈敏度測定Fig.4 Sensitivity determination of frozen sample DNA extracted by five methods using LAMP reaction 注：熔解曲線分析中，僅標(biāo)注出84.5～85℃以外的峰

3 結(jié)論

本研究從DNA得率、純度及LAMP反應(yīng)等方面綜合評價了5種核酸提取方法?？偟膩砜?，提取效果為Tiangen/SDS>Tagliavia>Takara>Heating。這5種提取方法從不同前處理的樣品中獲得的DNA均可用于LAMP反應(yīng)，采用瓊脂糖凝膠電泳及熒光可視化檢測都可觀測到陽性結(jié)果。根據(jù)Ct值進行比較分析，不同提取方法和不同的樣品前處理會造成Ct值的顯著性差異。Tiangen和SDS雖然DNA得率較低，但可為LAMP反應(yīng)提供更高純度和靈敏度的DNA，在LAMP反應(yīng)中最早出現(xiàn)擴增信號。