不同品種大米發(fā)酵紫色紅曲霉產(chǎn)色素的特性分析

夏欣欣，陳迪，姜凌，劉曼麗，孫晶晶，郭明偉，吳興泉

（河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南鄭州 450001）

紅曲霉屬是一個(gè)多功能的絲狀真菌類群，包括從毛紅曲菌（Monascus pilosus）、紫色紅曲菌（Monascus purpureus）、紅色紅曲菌（Monascus ruber）、煙色紅曲霉（M. fuliginosusSato）、發(fā)白紅曲霉（M. albidus）、銹色紅曲霉（M. rubiginosus）、變紅紅曲霉（M. rubropuncatatus Sato）、橙色紅曲霉（M. aurantiacus）等。紅曲菌屬真菌門，子囊菌亞門，真核菌綱，散囊菌目，紅曲科[1]。在亞洲國(guó)家，如中國(guó)、日本、泰國(guó)等，紅曲絲狀真菌被用于天然色素、食品成分和食品添加劑的生產(chǎn)。其中最著名的就是紅曲米，又稱紅槽、赤曲等[2]。傳統(tǒng)上紅曲霉以大米為固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)，發(fā)酵后成為我國(guó)傳統(tǒng)食用著色劑紅曲米[3]。紅曲米外觀呈磚紅色或紫紅色，質(zhì)脆且斷面為紅色或粉紅色[4]。

中國(guó)食品自古講究色、香、味俱全，著色劑更是自古以來(lái)就被用于食品中，以改善食品的外觀、風(fēng)味、口感和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)[5]。食品著色劑根據(jù)來(lái)源不同可分為植物著色劑、動(dòng)物著色劑、微生物著色劑及化學(xué)合成著色劑[6]。合成色素具有潛在的毒性和致癌性，天然食用色素則更具安全性、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，因此天然食用色素更受大眾認(rèn)可[7-9]。微生物以農(nóng)業(yè)和食物廢棄物為基質(zhì)，在細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生色素，具有生產(chǎn)力高、可持續(xù)發(fā)展、成本低廉的特點(diǎn)，是最有前途的食用色素來(lái)源[10,11]。紅曲色素作為微生物來(lái)源的天然食用色素，是紅曲霉的重要次生代謝產(chǎn)物，具有生產(chǎn)方便、底物廉價(jià)、在酸性水和乙醇中溶解性好、存在大量生物活性代謝物、在一定條件下生產(chǎn)安全等優(yōu)點(diǎn)，具有很好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[12]。紅曲色素可以用作食品著色劑，改善食品風(fēng)味，且具有抗菌性能[13]。紅曲色素是聚酮類和氮雜類化合物，含氧雙環(huán)核和四元中心，是紅曲霉代謝中多種聚酮類化合物的混合物，由紅、黃、橙三類化學(xué)結(jié)構(gòu)相近的色素構(gòu)成，其中既有醇溶性色素又有水溶性色素[14-17]。最常見(jiàn)的紅曲色素是紅色的紅曲紅胺素（Monascorubramine）與紅斑胺素（Rubropunctamine），橙色的紅曲紅素（Monascorubrin）與紅斑素（Rubropunctatin），黃色的紅曲素（Monascin）與紅曲黃素（Ankaflavin）[18]。

目前，在我國(guó)國(guó)標(biāo)規(guī)定的天然色素中，紅曲色素已經(jīng)根據(jù)不同色調(diào)被分別列出：紅曲紅色素、紅曲黃色素、紅曲米粉，生產(chǎn)不同色調(diào)的紅曲色素已成為適應(yīng)市場(chǎng)需求的發(fā)展趨勢(shì)。大米作為一種淀粉質(zhì)營(yíng)養(yǎng)源，自古以來(lái)就是紅曲菌的培養(yǎng)基，在中國(guó)有長(zhǎng)達(dá)近兩千年的應(yīng)用歷史。當(dāng)前研究中常以粳米為基質(zhì)發(fā)酵紅曲霉，而對(duì)比不同大米品種發(fā)酵紅曲霉的研究報(bào)道并不多見(jiàn)。本研究分別以粳米粉、秈米粉、糯米粉為基質(zhì)進(jìn)行紅曲菌的液態(tài)發(fā)酵，探究大米品種對(duì)紅曲霉生長(zhǎng)、紅曲色素顏色特性以及安全性的影響，以期為生產(chǎn)多色調(diào)紅曲色素提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

市售糯米、秈米、粳米，購(gòu)于河南省鄭州市永輝超市，打粉后過(guò)100目篩；紅曲菌種為實(shí)驗(yàn)室保藏菌種Monascus purpureusM9（strain NO. CGMCC 3.19586）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大米成分的測(cè)定

參照GB 5009.268-2016食品中多元素的測(cè)定第一法：電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）測(cè)定粳米、秈米、糯米的微量元素。水分測(cè)定則將大米粉（粳米粉、秈米粉、糯米粉）放入烘箱烘干至恒重，稱量烘干前后質(zhì)量。參照GB 5009.6-2016第一法：索氏抽提法，測(cè)定大米粉中的脂肪。參照GB 5009.5-2016第一法：凱氏定氮法，測(cè)定大米粉中的蛋白質(zhì)。

采用雙波長(zhǎng)的方法測(cè)定直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量，具體方法參照張雪梅等[19]的方法，分別測(cè)定樣品溶液在631、437、542、763 nm波長(zhǎng)下的吸光度值，根據(jù)直鏈淀粉和支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線分別算出樣品的直鏈、支鏈淀粉和總淀粉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.2 培養(yǎng)基配方

斜面培養(yǎng)基：將麥芽汁糖化液稀釋至10度，加入3%瓊脂，于121 ℃滅菌20 min，取出后擺斜面。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖6 g，蛋白胨2 g，NaNO31 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41 g，用水定容至100 mL，121 ℃滅菌20 min。

液體培養(yǎng)基：大米粉（粳米粉、秈米粉、糯米粉）2.5 g，NaNO30.15 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，KH2PO40.075 g，用水定容至50 mL，121 ℃滅菌20 min。

1.2.3 液態(tài)發(fā)酵紅曲霉M9

向活化好的菌株中加入5 mL無(wú)菌水，用孢子鏟刮下孢子，使孢子充分溶入水中。將此孢子液移入無(wú)菌種子培養(yǎng)基中搖勻，八層紗布包裹瓶口，于28 ℃、180 r/min的搖床中培養(yǎng)36 h～48 h得到種子液。將種子液用八層紗布過(guò)濾得到孢子懸液，用移液槍吸取3 mL孢子懸液接種于50 mL液體培養(yǎng)基上，放置在28 ℃、180 r/min的搖床中，發(fā)酵3～7 d。

1.2.4 生物量的測(cè)定

將發(fā)酵后的菌絲移入離心管中，以4000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，沉淀的菌絲體用蒸餾水沖洗后再次離心，反復(fù)沖洗三次。得到的菌絲體于60 ℃烘箱中干燥至恒重后準(zhǔn)確稱量，獲得的紅曲霉菌絲體干重即為生物量。

1.2.5 二硝基水楊酸法（DNS）測(cè)葡萄糖含量

葡萄糖含量的測(cè)定采用二硝基水楊酸法（DNS），具體參照黃濤[20]的方法進(jìn)行葡萄糖測(cè)定。

1.2.6 色素提取液的制備

將上述干燥后的樣品用研缽磨成粉末并過(guò)100目篩。準(zhǔn)確稱取0.5000 g紅曲樣品粉末，加入75%乙醇，超聲波處理30 min后離心，此過(guò)程反復(fù)3次，合并三次上清液，用75%乙醇定容至10 mL。

1.2.7 胞內(nèi)及胞外色價(jià)的測(cè)定

分別取1 mL發(fā)酵液（胞外）及適量色素提取液（胞內(nèi)）用75%乙醇稀釋到合適的倍數(shù)，用75%乙醇做空白，使用分光光度計(jì)410、470、505 nm處分別測(cè)定吸光度值A(chǔ)410、A470、A505，并代入下列公式計(jì)算：

式中：

S——樣品的色價(jià)，(U/mL)/(U/g)；

A——稀釋液的吸光度；

n——稀釋倍數(shù)；

G——菌絲干重，g；

V——發(fā)酵液取樣體積。

1.2.8 TLC法初步分離紅曲色素

參照屈炯[21]的方法進(jìn)行薄層色譜初步分離發(fā)酵所產(chǎn)紅曲色素，75%乙醇色素提取液適當(dāng)濃縮后，用毛細(xì)管點(diǎn)樣于硅膠G板上，用吹風(fēng)機(jī)吹干后放入展開(kāi)劑中展開(kāi)得到紅色及黃色組分，展開(kāi)劑體積配比甲苯:乙酸乙酯:甲酸=7:3:1。將乙酸乙酯濃縮液點(diǎn)樣于硅膠H板上，吹干后放入展開(kāi)劑中展開(kāi)，展開(kāi)劑配比（V/V）正己烷:乙酸乙酯:石油醚=30:17:5。展開(kāi)得到帶有橙色硅膠用小刀刮下，收集硅膠并用乙酸乙酯再次提取，適當(dāng)濃縮后點(diǎn)樣于硅膠H板上，吹風(fēng)機(jī)吹干后于展開(kāi)缸中展開(kāi)，展開(kāi)劑體積比甲苯:乙酸乙酯:甲酸=7:3:2，得到各橙色組分。

1.2.9 高效液相色譜法測(cè)定紅曲色素組分

樣品處理：上述溶液用0.45 μm的膜過(guò)濾后，再進(jìn)行HPLC分析。色譜柱：XDB-C18（5 μm，4.6×250 mm）；流動(dòng)相選乙腈和水（加0.1%色譜級(jí)甲酸）；按照梯度洗脫方法洗脫（如下表）；檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器（DAD），檢測(cè)波長(zhǎng)410 nm；柱溫25 ℃；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。

表1 HPLC洗脫方法Table 1 HPLC elution method

1.2.10 高效液相色譜法測(cè)定桔霉素

具體參照薛原[22]的桔霉素檢測(cè)方法設(shè)置高效液相色譜條件。

1.2.11 色差的測(cè)定

參照Chen等[23]的色差分析方法，使用DC-P3全自動(dòng)測(cè)色色差計(jì)對(duì)不同培養(yǎng)條件下獲得的紅曲紅色素色調(diào)做出分析。采用CIE推薦的D65標(biāo)準(zhǔn)光源，o/d條件及10 °視場(chǎng)。測(cè)定色素液（適當(dāng)稀釋倍數(shù)）的明度L*，色澤a*、b*，色調(diào)彩度Cab和色相角Hab。CIELAB顏色空間是三維直角坐標(biāo)系統(tǒng)，以明度L*和色度坐標(biāo)a*、b*來(lái)表示顏色在色空間中的位置。L*表示顏色的明度即深淺，a*正值表示偏紅，負(fù)值表示偏綠；b*正值表示偏黃，負(fù)值表示偏藍(lán)。色相角Hab 0 °為紅色，90 °時(shí)為黃色，180 °時(shí)為綠色。色調(diào)彩度Cab和色相角Hab按下列公式計(jì)算：

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用SAS 9.2軟件進(jìn)行顯著性差異分析（p<0.05），字母不同表示差異顯著（p<0.05），字母相同表示差異不顯著（p>0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 大米成分分析

表2為大米中淀粉含量，表3為大米成分，與汪建國(guó)等[24]的成分結(jié)果相似。如表2所示粳米的總淀粉含量及直鏈淀粉含量最高，分別可達(dá)72.87%、10.69%，支鏈淀粉含量（62.19%）也與糯米中支鏈淀粉（63.47%）含量相當(dāng)。糯米中支鏈淀粉含量最高，可達(dá)63.47%，直鏈淀粉含量幾乎沒(méi)有（0.80%），支鏈淀粉與總淀粉之比為98.76%，近100%。秈米總淀粉含量最低（58.30%），支鏈淀粉含量最低（54.04%），支鏈淀粉與總淀粉之比比粳米高7.36%。較高的支鏈淀粉與總淀粉之比可能是導(dǎo)致秈米和糯米發(fā)酵產(chǎn)橙色素較多的原因。其余大米成分包括粗脂肪、水分、蛋白質(zhì)含量三種大米品種都接近，約為7.72%、9.51%、6.99%，只有微量元素有較大差異。三種大米中銅元素含量接近（2.01 mg/kg），粳米中鎂元素、錳元素、鐵元素含量較高，分別可達(dá)635.45、15.86、26.44 mg/kg，其中鎂元素是秈米中的2.56倍，是糯米的4.57倍；錳元素是秈米的1.83倍，糯米的2.45倍；鐵元素是秈米的1.31倍，糯米與之接近，僅差2.28 mg/kg。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，Mg2+、Mn2+的適當(dāng)添加對(duì)紫色紅曲霉產(chǎn)紅曲色素有促進(jìn)作用[22]。據(jù)楊曉君[25]的研究，Zn2+、Mn2+對(duì)紅曲霉的色價(jià)和色調(diào)都有促進(jìn)作用，可使所產(chǎn)紅曲色素色調(diào)偏黃。結(jié)合文獻(xiàn)和大米成分差異，推測(cè)Zn2+、Mg2+、Mn2+及支鏈淀粉與總淀粉之比是不同品種大米發(fā)酵所產(chǎn)色素組分差異的原因。

表2 各品種大米淀粉含量（%）Table 2 Starch content of various varieties of rice (%)

表3 各品種大米成分Table 3 Various varieties of rice ingredients

2.2 大米品種對(duì)M9液態(tài)發(fā)酵生物量及葡萄糖含量的影響

如圖1，各品種大米發(fā)酵后的生物量隨時(shí)間的變化趨勢(shì)大體都相同，紅曲菌M9在粳米、秈米、糯米上發(fā)酵后的生物量隨時(shí)間的增長(zhǎng)先升高，粳米、秈米、糯米的生物量分別從0.94、0.94、0.85 g（3 d），上升至1.01、1.03、1.02 g（5 d生物量最高值），隨后下降，落回0.94、0.94、0.92 g（7 d）。這種生物量增長(zhǎng)趨勢(shì)與薛原[21]的紫色紅曲霉的生物量研究結(jié)果基本一致。各品種大米本質(zhì)上都為淀粉質(zhì)營(yíng)養(yǎng)源，紅曲霉發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生初級(jí)代謝產(chǎn)物淀粉酶，淀粉酶催化淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖。結(jié)合葡萄糖含量結(jié)果，第3天存在大量葡萄糖（238.29、202.07、245.40 mg），菌體在發(fā)酵第5天生長(zhǎng)達(dá)最高峰，同時(shí)葡萄糖含量大量減少（3.75、12.86、11.68 mg），說(shuō)明此時(shí)的淀粉及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被大量消耗，菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期；第5天以后菌體有所衰減，葡萄糖含量也大量減少，菌體開(kāi)始進(jìn)入衰亡期[22]。第3天及第7天的粳米生物量最大且與秈米的生物量基本持平，第4天到第6天秈米的生物量在各品種中最高，糯米的生物量一直處于較低水平。葡萄糖含量總體一直呈下降趨勢(shì)，與Tao Huang等[26]的殘余葡萄量結(jié)果基本相似。粳米內(nèi)的淀粉及葡萄糖在第4天（10.88 mg）就基本被消耗殆盡，而糯米和秈米第5天葡萄糖才迅速消耗直到發(fā)酵結(jié)束。粳米內(nèi)的淀粉消耗較快，在前期（3～4 d）促使菌體生長(zhǎng)累積生物量，秈米和糯米內(nèi)的淀粉消耗速率相對(duì)較慢，則在后期（5～6 d）積累生物量。這種現(xiàn)象可能和淀粉種類有關(guān)，糯米中的淀粉由支鏈淀粉組成，秈米和粳米中的淀粉都是由直鏈淀粉及支鏈淀粉構(gòu)成（秈米中的支鏈淀粉更多），后續(xù)還需驗(yàn)證。

2.3 大米品種對(duì)胞內(nèi)及胞外色價(jià)的影響

紅曲菌M9以各品種（粳、秈、糯）為基質(zhì)的液態(tài)發(fā)酵的胞外色價(jià)如圖2所示，胞內(nèi)色價(jià)如圖3所示，分別于410 nm（黃色素最大吸收峰）、470 nm（橙色素最大吸收峰）、505 nm（紅色素最大吸收峰）處測(cè)得胞外及胞內(nèi)色價(jià)。其中粳米和秈米的胞外色價(jià)隨時(shí)間變化趨勢(shì)一致，在第3天到第7天一直呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，第3天粳米的胞外色價(jià)為9.11、5.93、7.63 U/mL（依次為410、470、505 nm處的色價(jià)值，下同），秈米的胞外色價(jià)為4.79、2.10、1.98 U/mL，兩者都于第7天達(dá)胞外色價(jià)最大值（粳米可達(dá)24.95、14.17、19.07 U/mL，秈米可達(dá)14.08、7.77、8.38 U/mL）。這種增長(zhǎng)趨勢(shì)與Gong Chen[27]的胞外色價(jià)研究結(jié)果相似。糯米第3天的胞外色價(jià)為3.42、1.77、1.81 U/mL，且于第5天達(dá)胞外色價(jià)最大值（15.30、7.02、9.79 U/mL），第5天后的色價(jià)呈下降趨勢(shì)。各品種大米相比較而言，粳米的胞外色價(jià)值最高，整體胞外色價(jià)值顯著高于粳米和糯米，可達(dá)到秈米的2.28倍，糯米的2.53倍。糯米和秈米的胞外色價(jià)整體接近，但糯米的最大胞外色價(jià)值高于秈米。

粳米的胞內(nèi)色價(jià)在發(fā)酵過(guò)程中（3～7 d）一直呈顯著上升趨勢(shì)，色價(jià)值從540.18、369.36、540.18 U/g（3 d），上升至1772.16、1158.48、1762.80 U/g（7 d）。粳米胞內(nèi)色價(jià)隨發(fā)酵時(shí)間變化的趨勢(shì)與楊曉君[25]的研究結(jié)果相似。秈米的胞內(nèi)色價(jià)第3～6天的色價(jià)值接近（約為811.20、668.28、826.92 U/g），于第4天（937.80、748.56、947.46 U/g）略有起伏，在第7天達(dá)色價(jià)最高值（1287.60、972.24、1251.36 U/g）。糯米的胞內(nèi)色價(jià)整體呈上升趨勢(shì)，中間略有波動(dòng)，于第6天達(dá)色價(jià)最大值（921.00、759.00、978.36 U/g）。秈米和糯米隨時(shí)間增長(zhǎng)波動(dòng)式的增長(zhǎng)趨勢(shì)與Gong Chen[27]的胞內(nèi)色價(jià)結(jié)果基本一致。整體相比，前期（3～4 d）秈米的胞內(nèi)色價(jià)高于糯米及粳米的胞內(nèi)色價(jià)，可達(dá)糯米的1.24倍，粳米的1.33倍，后期（6～7 d）粳米的胞內(nèi)色價(jià)值較高，色價(jià)值最高可達(dá)秈米的1.41倍，糯米的1.86倍。以粳米為基質(zhì)的發(fā)酵更利于M9的色素累積，就發(fā)酵時(shí)間來(lái)說(shuō)，發(fā)酵進(jìn)行到第7天更有利于紅曲色素的生產(chǎn)。

2.4 TLC法初步分離紅曲色素

圖4為經(jīng)薄層分離后紅曲色素的分布，紅、黃、橙色素的位置分布結(jié)果與Liu等[28]的研究結(jié)果基本一致。左圖得到5個(gè)清晰的紅色素條帶（Rf=0.13、Rf=0.16、Rf=0.19、Rf=0.25、Rf=0.29），2個(gè)黃色條帶（圖指位置，Rf=0.88、Rf=0.91），右圖得到兩條清晰的橙色條帶（Rf=0.72、Rf=0.77）。根據(jù)條帶可知粳米發(fā)酵所產(chǎn)紅曲色素中紅色素的種類及產(chǎn)量更多，在薄層上呈現(xiàn)出的紅色條帶的顏色也更深更紅。右圖橙色條帶明顯糯米色澤最深，條帶清晰，秈米次之，而粳米的橙色條帶最弱。說(shuō)明糯米及秈米發(fā)酵所得橙色素比粳米發(fā)酵所得橙色素產(chǎn)量更高。就目前薄層結(jié)果來(lái)看，以粳米為基質(zhì)發(fā)酵更利于M9產(chǎn)紅色素，而糯米和秈米更利于紅曲菌M9產(chǎn)橙色素。

2.5 HPLC法測(cè)紅曲色素組分

經(jīng)HPLC分析各品種大米發(fā)酵所產(chǎn)色素基本為紅色素R1、紅色素R2、黃色素Y1、黃色素Y2、橙色素O1、橙色素O2這六種，色素組分與Chen等[23]研究的色素組分基本一致。圖5所示為6種紅曲色素的峰面積圖，圖6為各大米品種發(fā)酵產(chǎn)色素的峰圖，由圖可知粳米所產(chǎn)色素中紅色素（R1、R2）及黃色素（Y1、Y2）最大，而秈米和糯米中橙色素（O1、O2）最大。其中粳米中的紅色素是秈米的5.32倍，糯米的5.50倍；黃色素是秈米的2.29倍，糯米的2.32倍；橙色素則是秈米中橙色素的27.84%，是糯米的29.05%。各品種大米相比較，粳米更利于紅曲菌M9發(fā)酵產(chǎn)紅、黃色素，秈米和糯米則更利于橙色素的增長(zhǎng)。

由圖7～9可知各品種大米的紅色素及粳米、秈米所產(chǎn)黃色素都于發(fā)酵第7天達(dá)最大值，黃色素Y1的最高峰（27041.60）則在發(fā)酵第4天，糯米中紅色素R1、R2在發(fā)酵第7天有最大峰面積（8160.12、8883.31）黃色素Y1、Y2在第3天就到達(dá)最高點(diǎn)（13559.39、5243.64）。粳米橙色素O1、O2于第4天達(dá)最大值（9871.99、10172.10），秈米和糯米所產(chǎn)橙色素O1、O2在發(fā)酵第5天有最大值（13752.70、17319.20、13077.20、16698.60）。隨著發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)，紅色素R1、R2的增加通常伴隨著橙色素O1、O2的減少。橙色素是可以轉(zhuǎn)化為紅色素的，如與氨基酸、肽、蛋白質(zhì)的氨基發(fā)生加氨反應(yīng)生成紅色素[29]。發(fā)酵后期紅色素生成增多，橙色素減少，這種情況可能是由于后期橙色素開(kāi)始向紅色素轉(zhuǎn)化。

2.6 HPLC法測(cè)桔霉素

圖10所示為通過(guò)HPLC分析各品種大米中桔霉素的峰面積圖，桔霉素是與紅曲色素一起產(chǎn)生的腎毒性和肝毒性真菌毒素，威脅食用色素的安全[22]。粳米及糯米的桔霉素含量隨時(shí)間變化的整體趨勢(shì)與陳蘊(yùn)等[30]的研究相似。由圖可知，粳米及糯米的桔霉素產(chǎn)量隨發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)而逐步增長(zhǎng)，發(fā)酵第3天時(shí)峰面積有最低值（88.35、251.18），第7天則有最高值（550.34、1056.41）。秈米的桔霉素峰面積則在第6天增長(zhǎng)至最大值（714.62），第7天略有下降（525.89）呈先上升后下降的趨勢(shì)。整體的桔霉素含量糯米是3種大米中最高的，粳米則是三者中最低的，發(fā)酵第3天兩者相差最大，此時(shí)糯米桔霉素含量是粳米桔霉素含量的2.84倍。整體來(lái)看粳米發(fā)酵所產(chǎn)色素安全性最高，秈米次之。

陳蘊(yùn)等[30]對(duì)紅曲菌所產(chǎn)桔霉素含量隨發(fā)酵時(shí)間的變化規(guī)律進(jìn)行了研究，紅曲色素和桔霉素的含量都隨著時(shí)間的增加而增長(zhǎng)，但兩者的生產(chǎn)水平并不處于一個(gè)數(shù)量級(jí)，相比紅曲色素，桔霉素的產(chǎn)量一般比較微量，其產(chǎn)生的時(shí)間也比紅曲色素慢，桔霉素的合成也主要集中發(fā)酵后期。從安全性和色素總量的角度考慮，粳米更適合長(zhǎng)時(shí)間（7 d）發(fā)酵，秈米和糯米更適合短時(shí)間（4 d），合適的發(fā)酵時(shí)間有利于產(chǎn)生更多的色素及更少的桔霉素。

2.7 色差分析

表4為各品種大米發(fā)酵的顏色特征，其中L*代表顏色的深淺，a*代表紅綠色度值，b*代表黃藍(lán)色度值，Hab是色相角，Cab是色調(diào)彩度。本研究根據(jù)色差儀所測(cè)指標(biāo)結(jié)合視覺(jué)觀察判定樣品顏色。粳米發(fā)酵的色素色差結(jié)果與Chen等[23]的研究結(jié)果相似。由表可知，視覺(jué)上粳米在第3、4天發(fā)酵色素呈淺紅色，從第5天開(kāi)始轉(zhuǎn)為深紅色；秈米第3～6天為橘紅色，第7天則轉(zhuǎn)為深紅色；糯米第3天為淺紅色，而后轉(zhuǎn)為橘紅色直到第7天發(fā)酵結(jié)束，其中第6～7天的色素顏色更深。由色差結(jié)果可知，粳米發(fā)酵偏紅，秈米及糯米發(fā)酵偏橘紅，與高效液相分析色素的結(jié)果相印證。在發(fā)酵第4～5天，這種現(xiàn)象更明顯。

表4 各品種大米發(fā)酵的顏色特征Table 4 Color characteristics of rice fermentation of various varieties

3 結(jié)論

3.1 以實(shí)驗(yàn)室保藏的色素產(chǎn)量穩(wěn)定的紫色紅曲菌M9為試驗(yàn)菌株，分別以粳米、秈米、糯米作為基質(zhì)進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，通過(guò)色價(jià)測(cè)定、高效液相色譜法、薄層色譜法、色差儀分析法分析所產(chǎn)色素產(chǎn)量及色素組分，并借助生物量測(cè)定、葡萄糖含量測(cè)定、大米成分測(cè)定深入研究大米中哪些成分導(dǎo)致了這種組分差異的產(chǎn)生。結(jié)果表明：菌體在發(fā)酵第5天生長(zhǎng)達(dá)最高峰，同時(shí)淀粉及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被大量消耗，菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期。粳米內(nèi)的淀粉消耗較快，在前期（3～4 d）促使菌體生長(zhǎng)累積生物量，秈米和糯米內(nèi)的淀粉消耗速率相對(duì)較慢，則在后期（5～6 d）積累生物量。第5天以后菌體有所衰減，進(jìn)入衰亡期。各品種大米相比較而言，粳米的胞外色價(jià)值最高，整體胞外色價(jià)值顯著高于秈米和糯米。前期秈米的胞內(nèi)色價(jià)高于糯米及粳米的胞內(nèi)色價(jià)，后期粳米的胞內(nèi)色價(jià)值較高，可達(dá)到秈米的1.41倍，糯米的1.86倍，以粳米為基質(zhì)的后期發(fā)酵更利于M9的色素累積。

3.2 視覺(jué)上不同品種大米發(fā)酵也呈現(xiàn)不同的色調(diào)，粳米呈現(xiàn)深紅色，糯米及秈米則呈現(xiàn)橘紅色。不同品種大米發(fā)酵色素組分不同，粳米中紅色素（R1、R2）及黃色素（Y1、Y2）產(chǎn)量較高，橙色素O1、O2則更適合在秈米和糯米中生產(chǎn)。以粳米為基質(zhì)發(fā)酵更利于M9產(chǎn)紅、黃色素，而糯米和秈米更利于紅曲菌M9產(chǎn)橙色素。整體來(lái)看粳米發(fā)酵所產(chǎn)色素安全性最高，桔霉素的產(chǎn)量最低，秈米和糯米的安全性次之，且糯米的安全性最差。結(jié)合文獻(xiàn)和大米成分差異，推測(cè)Zn2+、Mg2+、Mn2+及支鏈淀粉與總淀粉之比是不同品種大米發(fā)酵所產(chǎn)色素組分差異的原因。

3.3 今后，可探究直鏈淀粉、支鏈淀粉及鎂元素對(duì)紫色紅曲霉M9發(fā)酵產(chǎn)紅曲色素色調(diào)的影響，深入研究大米品種調(diào)控紅曲色素色調(diào)變化的機(jī)理。為生產(chǎn)不同色調(diào)的紅曲色素適應(yīng)市場(chǎng)需求提供理論依據(jù)，為進(jìn)一步探究大米品種調(diào)控其他紅曲霉的次級(jí)代謝提供參考。