茶皂素對(duì)食源性腐敗酵母的抑菌能力及作用機(jī)理

杜金婷，張雁，李雁，王佳佳，廖娜，鐘立煌，駱碧群，林江

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510640）（2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510610） （3.廣東星匯生物科技有限公司，廣東龍川 517323）

食品是微生物生長(zhǎng)的理想基質(zhì)，在制造、分銷(xiāo)和儲(chǔ)存階段食品易受多種微生物污染，導(dǎo)致外觀、質(zhì)地、味道和香氣成分的改變，甚至?xí)a(chǎn)生過(guò)量發(fā)酵氣體以及真菌毒素，引起食品包裝炸裂、損害人體健康。食品工業(yè)多采用高溫滅菌和添加防腐劑的方式控制腐敗微生物生長(zhǎng)，然而少數(shù)食源性腐敗酵母因其耐酸[1]、耐高滲[2]、耐弱酸抑菌劑[3]和適應(yīng)高溫等特性，處理后仍可能對(duì)食品品質(zhì)造成嚴(yán)重影響。

研究表明，引起食品中酵母污染的菌種多為假絲酵母、釀酒酵母、畢赤氏酵母等[4]，現(xiàn)已有報(bào)道從濃縮蘋(píng)果汁（糖度70 °Brix，pH值3.5）中分離出導(dǎo)致脹罐、果汁營(yíng)養(yǎng)價(jià)值降低和外觀惡化等質(zhì)量問(wèn)題的魯氏接合酵母[5]，因此對(duì)腐敗酵母進(jìn)行污染控制就顯得尤為重要。為延長(zhǎng)食品儲(chǔ)藏期限，添加防腐劑抑制腐敗酵母生長(zhǎng)，是一種方便高效的控制措施。目前常見(jiàn)的防腐劑包括化學(xué)合成防腐劑和天然防腐劑，化學(xué)合成防腐劑是食品工業(yè)中使用劑量最大，應(yīng)用范圍最廣泛的一類(lèi)防腐劑，其擁有廣譜、高效和穩(wěn)定的抑菌效果。然而，已有研究表明有機(jī)酸類(lèi)化學(xué)合成防腐劑需在高劑量下才可有效控制酵母菌生長(zhǎng)[6]，但這會(huì)影響產(chǎn)品味道和質(zhì)量。此外，有相關(guān)報(bào)道表明可有效抑制腐敗酵母生長(zhǎng)的苯甲酸鈉在人體腸道酸環(huán)境下可轉(zhuǎn)化為毒性較強(qiáng)的苯甲酸，進(jìn)而導(dǎo)致體重下降、腹瀉、出血、癱瘓甚至死亡[7]。隨著食品安全問(wèn)題受重視程度的提高，人們逐步將目光轉(zhuǎn)向可替代合成防腐劑的天然安全食品防腐劑。

油茶是中國(guó)特有的木本油料作物，被譽(yù)為“東方油橄欖”，其加工副產(chǎn)物油茶粕中富含天然抑菌活性成分茶皂素[8]，然而目前綜合利用程度仍然較低。茶皂素是一類(lèi)齊墩果烷型五環(huán)三萜類(lèi)皂苷混合物，是一種廣譜天然抑菌劑，Ju等[6]發(fā)現(xiàn)在醬油釀造中，茶皂素提取物比食品工業(yè)常用化學(xué)合成防腐劑苯甲酸鈉有更強(qiáng)的抗腐敗酵母活性，有望作為一種比苯甲酸鈉更安全的食品防腐劑運(yùn)用于食品加工，但天然抑菌劑活性成分復(fù)雜，抑菌機(jī)制尚不明確，特別是對(duì)食源性腐敗酵母的研究尚處于起步階段。本文測(cè)定茶皂素對(duì)釀酒酵母、魯氏接合酵母和白色假絲酵母等三種腐敗酵母的抑菌圈直徑、MIC和MBC以評(píng)價(jià)其抑菌能力，并通過(guò)考察茶皂素對(duì)菌體時(shí)間-殺傷曲線(xiàn)、生物膜抑制率、菌體細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞膜通透性、細(xì)胞膜完整性、遺傳物質(zhì)和蛋白質(zhì)泄露與合成干擾的影響對(duì)抑菌機(jī)理進(jìn)行研究，旨在探明油茶皂素的抑菌作用，為其更好運(yùn)用于食品產(chǎn)業(yè)和提升油茶副產(chǎn)物高值化利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母ATCC 9080（Saccharomyces cerevisiae）、魯氏接合酵母CDMCC 2.173（Zygosaccharomyces rouxii(Saito)Lodd）、白色假絲酵母ATCC 10231（Candida albicans）由廣東省微生物菌種保藏中心提供菌種。

茶皂素（自制）；戊二醛、無(wú)水乙醇，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Bicinchoninic acid（BCA）蛋白定量測(cè)定試劑盒、真菌基因組（DNA）提取試劑盒、DNA marker、瓊脂糖，上海源葉生物科技有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS），北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

S-3400N-II掃描電子顯微鏡，日立高新技術(shù)公司；Synergy 2多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)博騰儀器有限公司；Zeiss LSM710激光共聚焦掃描顯微鏡，Zeiss光學(xué)儀器（上海）國(guó)際貿(mào)易有限公司；MJQ-23L-B全自動(dòng)高壓滅菌鍋，杭州諾丁科學(xué)器材有限公司；JY99-IIDN超聲破碎儀，上海希言科學(xué)儀器有限公司；UV-1800紫外分光光度計(jì)，日本島津科技有限公司；ICTHI-250恒溫恒濕培養(yǎng)箱，施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司；ZF-288全自動(dòng)凝膠成像儀，上海嘉鵬科技有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)，華威科創(chuàng)（武漢）科技有限公司；Beckman冷凍高速離心機(jī)，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司。

1.3 方法

1.3.1 茶皂素的制備

茶皂素提取物[9]經(jīng)AB-8大孔樹(shù)脂純化得到純度為92.07%茶皂素。

1.3.2 抑菌能力評(píng)價(jià)

1.3.2.1 測(cè)定抑菌直徑

采用牛津杯（內(nèi)徑6 mm，外徑8 mm，高度10 mm）測(cè)定抑菌直徑大小。向培養(yǎng)皿（90 mm）中倒入20 mL已滅菌PDA培養(yǎng)基，待其凝聚后，加入100 μL菌液（濃度約為106cfu/mL），均勻涂布，靜置5 min。放置相應(yīng)數(shù)量的牛津杯于培養(yǎng)皿中，加入100 μL不同濃度的茶皂素溶液，置于4 ℃冰箱靜置3 h后，將培養(yǎng)皿于27 ℃培養(yǎng)24 h后用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌直徑，無(wú)菌水作為對(duì)照組[10]。

1.3.2.2 測(cè)定MIC和MBC

吸取馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基100 μL，于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。再將100 μL 200 mg/mL茶皂素溶液加到孔內(nèi)，對(duì)200 mg/mL茶皂素溶液進(jìn)行二倍稀釋?zhuān)来稳?00 μL加入孔中，稀釋至最低濃度為0.05 mg/mL；隨后向上述各孔加入100 μL培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液。以?xún)H加液體培養(yǎng)基不加菌液為陰性對(duì)照，加菌液不加茶皂素溶液為陽(yáng)性對(duì)照，將96孔細(xì)胞板放置于27 ℃恒溫培養(yǎng)箱24 h，孔板中肉眼不可見(jiàn)渾濁的濃度即為MIC。取50 μL混合菌液于PDA培養(yǎng)皿上，均勻涂布，于27 ℃培養(yǎng)48 h，無(wú)菌體生長(zhǎng)的最低濃度即為MBC。

1.3.3 抑菌機(jī)理

1.3.3.1 茶皂素對(duì)釀酒酵母的時(shí)間-殺傷曲線(xiàn)

吸取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的釀酒酵母菌液100 μL于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，再將溶于無(wú)菌水的茶皂素加到上述孔中，使茶皂素的終濃度分別為0、1/4、1/2、1和2 MIC，以等體積的無(wú)菌水為陰性對(duì)照。將96孔細(xì)胞板放置于27 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每小時(shí)測(cè)定600 nm波長(zhǎng)下吸光值，對(duì)照組吸光度為OD0，實(shí)驗(yàn)組吸光度為OD1，以O(shè)D1/OD0為指標(biāo)繪制茶皂素對(duì)釀酒酵母抑制作用的時(shí)間-殺傷曲線(xiàn)[11]。

1.3.3.2 茶皂素對(duì)釀酒酵母生物膜的抑制率

參照1.3.3.1方法在96孔板內(nèi)接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期釀酒酵母菌液后，將其放置于27 ℃下培養(yǎng)24 h，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，用PBS洗掉多余染色劑后，加入含有0.1%乙酸的95%乙醇溶液將粘附的染色劑重新溶解，使用酶標(biāo)儀在595 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度[12]。生物膜抑制率計(jì)算公式如下：

式中：

A0——對(duì)照組吸光度；

A1——實(shí)驗(yàn)組吸光度。

1.3.3.3 茶皂素對(duì)釀酒酵母細(xì)胞形態(tài)的影響

吸取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的50 mL菌液加入錐形瓶，再加入茶皂素使茶皂素終濃度為0、1、2和4 MIC，將錐形瓶放置于27 ℃培養(yǎng)6 h，取出用PBS沖洗2次，加入戊二醛溶液4 ℃過(guò)夜固定。使用濃度梯度的酒精溶液（30%、50%、70%、90%、100%、100%）逐級(jí)脫水，烘箱45 ℃烘12 h，鍍膜后用掃描電子顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.3.4 茶皂素對(duì)釀酒酵母細(xì)胞膜通透性的影響

吸取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液50 mL，平均分裝在2個(gè)離心管，離心收集菌體，用PBS洗滌2次，加入茶皂素使茶皂素終濃度為0 MIC和1 MIC，離心管放置于27 ℃搖床培養(yǎng)，分別在0、2、4、6、8 h后取出2 mL菌液，6000 r/min離心5 min，用紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)分別檢測(cè)其上清液在260 nm、280 nm處的吸光度并繪制曲線(xiàn)[13]。

1.3.3.5 茶皂素對(duì)釀酒酵母細(xì)胞膜完整性的影響

吸取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的50 mL菌液加入錐形瓶，再加入茶皂素使茶皂素終濃度為0、1/4、1/2和1 MIC，將錐形瓶放置于27 ℃培養(yǎng)24 h后，10000 r/min離心5 min，用無(wú)菌生理鹽水清洗2次后重懸于PBS。用吖啶橙（Acridine Orange，AO）和溴乙錠（Ethidium Bromide，EB）染色劑染色10 min，采用激光共聚焦顯微鏡觀察酵母細(xì)胞情況[14]。

1.3.3.6 茶皂素對(duì)釀酒酵母基因組DNA的影響

吸取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的50 mL菌液加入離心管，10000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)基，用無(wú)菌生理鹽水清洗2次，加入50 mL濃度為0、1、2和4 MIC的茶皂素溶液，并將其放置于27 ℃培養(yǎng)8 h。10000 r/min離心10 min去除上清液，保留菌體沉淀，按照DNA提取試劑盒步驟提取DNA，將提取的3 μL DNA樣品分別于1 μL Loading buffer混合后進(jìn)行凝膠阻滯電泳，電泳完成后，將凝膠放置于全自動(dòng)凝膠成像裝置，拍照并分析結(jié)果。

1.3.3.7 茶皂素對(duì)釀酒酵母蛋白泄露及合成的影響

吸取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的50 mL菌液加入離心管，10000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)基，用無(wú)菌生理鹽水清洗2次，加入50 mL濃度為1 MIC的茶皂素溶液，27 ℃下培養(yǎng)8 h，以無(wú)菌去離子水作為陰性對(duì)照組，茶皂素處理0 h作為陽(yáng)性對(duì)照組。每2 h吸取5 mL菌懸液，在5000 r/min離心10 min，收集上清液使用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白含量，即為胞外蛋白質(zhì)含量。茶皂素處理后酵母細(xì)胞蛋白質(zhì)泄露量計(jì)算公式為：

式中：

λ0——陽(yáng)性對(duì)照組蛋白質(zhì)含量，μg/mL；

λ1——胞外蛋白質(zhì)含量，μg/mL。

取5 mL處理8 h的菌液，以10000 r/min離心10 min獲取沉淀物，將沉淀物懸浮在無(wú)菌水中，然后用超聲破碎儀在功率800 W，間隔3 s的條件下破壞細(xì)胞30 min，最后收集上清液，使用BCA蛋白定量測(cè)定試劑盒測(cè)定細(xì)胞總蛋白含量，為胞內(nèi)總蛋白質(zhì)含量[15]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 22.0分析處理數(shù)據(jù)，Origin 2018繪制圖表，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次取其平均值，p<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌能力評(píng)價(jià)

由表1和表2的抑菌直徑、MIC和MBC結(jié)果可以看出，茶皂素對(duì)不同食源性腐敗酵母均有良好的抑菌效果，茶皂素濃度為0.20 mg/mL時(shí)，對(duì)釀酒酵母和白色假絲酵母有較強(qiáng)的抑菌作用，而釀酒酵母的抑菌直徑約為白色假絲酵母2.5倍，然而茶皂素濃度增加到0.40 mg/mL時(shí)，對(duì)魯氏接合酵母仍未出現(xiàn)抑菌圈，繼續(xù)增加到0.80 mg/mL時(shí)，出現(xiàn)抑制效果，由此可知茶皂素對(duì)食源性腐敗酵母抑菌效果為釀酒酵母>白色假絲酵母>魯氏接合酵母。并且，茶皂素抑菌效果與濃度呈現(xiàn)依賴(lài)性，抑菌直徑隨茶皂素濃度的升高而增大，當(dāng)濃度達(dá)到3.20 mg/mL時(shí)，釀酒酵母抑菌直徑達(dá)到27.75 mm，具有較強(qiáng)的抑菌作用。另外，茶皂素對(duì)釀酒酵母和白色假絲酵母的最低抑菌濃度皆為0.05 mg/mL，對(duì)魯氏接合酵母的最低抑菌濃度則為0.19 mg/mL。由此可見(jiàn)，茶皂素對(duì)食源性腐敗酵母具有廣譜抑菌作用，但對(duì)釀酒酵母抑菌效果最為顯著。因此，選取釀酒酵母為研究茶皂素對(duì)食源性腐敗酵母抑菌機(jī)理的指示菌。

表1 茶皂素對(duì)食源性腐敗酵母的抑菌直徑Table 1 Inhibitory effect of tea saponin on foodborne spoilage yeasts

表2 茶皂素對(duì)食源性腐敗酵母的MIC和MBCTable 2 MIC and MBC of tea saponin on foodborne spoilage yeasts

2.2 抑菌機(jī)理

2.2.1 茶皂素對(duì)釀酒酵母的時(shí)間-殺傷曲線(xiàn)

天然活性物質(zhì)對(duì)菌體的抑制作用在菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期才可顯現(xiàn)出來(lái)[16]，由圖1可知，培養(yǎng)4 h后，釀酒酵母進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，未經(jīng)茶皂素處理的釀酒酵母OD1/OD0迅速上升，呈現(xiàn)正常的增殖和生長(zhǎng)狀態(tài)，而經(jīng)過(guò)茶皂素處理的釀酒酵母OD1/OD0增長(zhǎng)緩慢。抑菌作用多與天然活性物質(zhì)的濃度有關(guān)，釀酒酵母菌體細(xì)胞經(jīng)茶皂素處理后生長(zhǎng)受到不同程度抑制，且抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性，茶皂素濃度在1/4 MIC～1 MIC范圍內(nèi)，抑菌作用隨濃度升高而增大，濃度超過(guò)MIC后OD1/OD0基本無(wú)變化，這與郭麗麗等[17]研究黃芪莖葉皂苷提取物對(duì)大腸桿菌的抗菌機(jī)理的結(jié)果類(lèi)似，兩者研究結(jié)果皆表明高濃度抑菌活性成分可完全抑制菌體生長(zhǎng)，使其無(wú)形成正常生長(zhǎng)周期，直接進(jìn)入衰竭期。

2.2.2 茶皂素對(duì)釀酒酵母生物膜抑制率

生物膜是一種包裹在菌體自身周?chē)木奂ぃ啥喾N自產(chǎn)基質(zhì)形成[12]，臨床上認(rèn)為生物膜的形成可以顯著降低真菌對(duì)抗真菌藥物的敏感性[18,19]，也因此抑制真菌生物膜的形成被認(rèn)為是控制食源性腐敗酵母的重要措施。通過(guò)結(jié)晶紫染色試驗(yàn)表明，茶皂素對(duì)釀酒酵母生物膜形成的抑制作用呈劑量依賴(lài)性，Li等[20]研究也證實(shí)生物膜抑制率與抑菌物質(zhì)濃度呈正相關(guān)。如圖2所示，茶皂素在1/2 MIC～2 MIC測(cè)試濃度下可有效抑制釀酒酵母的生物膜形成（p<0.05），且隨著濃度升高，茶皂素的生物膜抑制率也相應(yīng)提高，當(dāng)茶皂素濃度達(dá)到2 MIC時(shí)，可有效抑制84.69%的生物膜形成。

2.2.3 茶皂素對(duì)釀酒酵母形態(tài)的改變

釀酒酵母的掃描電鏡圖如圖3所示，可較為直觀地看出茶皂素對(duì)菌體形態(tài)的影響。對(duì)照組中酵母菌體細(xì)胞平滑完整（圖3a），加入1MIC濃度的茶皂素（圖3b）后釀酒酵母菌體細(xì)胞出現(xiàn)少量塌陷，細(xì)胞膜表面不平整。然而當(dāng)更大濃度（2 MIC和4 MIC）的茶皂素作用于釀酒酵母時(shí)（圖3c、3d），菌體出現(xiàn)大量塌陷、形態(tài)扭曲和細(xì)胞膜褶皺，形態(tài)遭到嚴(yán)重破壞，這種情況可能是由于茶皂素破壞或損傷了釀酒酵母細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)大量溢出，使其失去原有能夠維持細(xì)胞正常生命活動(dòng)的功能和對(duì)細(xì)胞內(nèi)容物的支撐和保護(hù)作用，從而導(dǎo)致菌體的細(xì)胞形態(tài)改變[21]。

2.2.4 茶皂素對(duì)釀酒酵母細(xì)胞膜通透性的影響

核酸和蛋白質(zhì)在細(xì)胞的生命活動(dòng)中有著不可缺少的重要作用，蛋白質(zhì)是細(xì)胞重要的結(jié)構(gòu)組成成分，而核酸具有編碼合成蛋白質(zhì)的功能，因此核酸和蛋白質(zhì)生理功能對(duì)于釀酒酵母生長(zhǎng)繁殖有著不可或缺的作用。核酸和蛋白質(zhì)在260 nm和280 nm有最大吸收峰，因此可通過(guò)OD260和OD280來(lái)表征細(xì)胞外的核酸和蛋白質(zhì)的泄露情況[13]。

細(xì)胞膜是外界環(huán)境刺激對(duì)細(xì)胞不可滲透的屏障，而細(xì)胞通透性是菌體正常生長(zhǎng)代謝的重要指標(biāo)[22]，通透性可通過(guò)菌體核酸、蛋白質(zhì)等內(nèi)容物的釋放表征，菌體內(nèi)容物釋放量增大可表明細(xì)胞膜通透性遭到破壞，內(nèi)容物釋放量越大，細(xì)胞膜通透性破壞程度越大。如圖4、5所示，茶皂素可誘導(dǎo)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸物質(zhì)大量泄露，經(jīng)1 MIC濃度茶皂素處理8 h后，處理組OD260由0.08增加至0.21，OD280由0.06增加至0.12，而對(duì)照組260 nm和280 nm波長(zhǎng)下吸光度均無(wú)顯著差異（p>0.05）。此外，Zhao等[12]也利用OD260和胞外蛋白質(zhì)濃度的試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了胞內(nèi)大分子物質(zhì)的釋放是由抑菌活性成分對(duì)菌體細(xì)胞膜造成不可修復(fù)損傷引起的。由此可見(jiàn)，茶皂素是通過(guò)增加細(xì)胞膜通透性，致使核酸和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)大量泄露，進(jìn)而影響細(xì)胞正常生長(zhǎng)，達(dá)到抑菌的目的。

2.2.5 茶皂素對(duì)釀酒酵母細(xì)胞膜完整性的影響

采用AO和EB標(biāo)記細(xì)胞，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡考察茶皂素對(duì)釀酒酵母細(xì)胞膜完整性的影響如圖6所示，其中，AO核酸染料可標(biāo)記正常細(xì)胞并顯示綠色或黃綠色熒光，EB核酸染料僅能標(biāo)記細(xì)胞膜受損菌體使其顯示紅色熒光。在激光共聚焦顯微鏡下觀察到未做任何處理的釀酒酵母細(xì)胞多呈綠色熒光反應(yīng)，僅有極少數(shù)呈紅色的細(xì)胞；1 MIC茶皂素濃度處理釀酒酵母8 h后，發(fā)現(xiàn)大部分細(xì)胞都發(fā)出紅色熒光，表明茶皂素對(duì)釀酒酵母的細(xì)胞膜損傷率較高；此外，當(dāng)茶皂素濃度在1/4 MIC～1 MIC范圍內(nèi)時(shí)，激光共聚焦顯微鏡可明顯觀察到呈現(xiàn)綠色熒光的無(wú)損傷細(xì)胞數(shù)量隨著茶皂素濃度的增大而減少，相反的發(fā)紅色熒光的損傷細(xì)胞數(shù)量逐漸增多。Sung等[23]研究表明，天然活性物質(zhì)的抗真菌作用可能是通過(guò)增加真菌細(xì)胞膜通透性來(lái)破壞細(xì)胞膜完整性，進(jìn)而滲透到細(xì)胞內(nèi)部發(fā)揮抑菌效果，同時(shí)激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果也表明茶皂素可能通過(guò)破壞細(xì)胞膜完整性的方式抑制食源性腐敗酵母正常生長(zhǎng)。

2.2.6 茶皂素對(duì)釀酒酵母基因組DNA的影響

DNA是生物體內(nèi)重要的遺傳物質(zhì)，DNA的損傷會(huì)影響遺傳信息的表達(dá)，導(dǎo)致代謝合成過(guò)程的紊亂，最終使細(xì)胞死亡[24]。采用凝膠阻滯電泳考察茶皂素對(duì)釀酒酵母DNA的影響，從圖7可以看出在分子質(zhì)量15000 bp處，泳道3～5相對(duì)與泳道2發(fā)生條帶減弱消失的現(xiàn)象，說(shuō)明經(jīng)過(guò)茶皂素處理后釀酒酵母DNA含量減少，且隨著質(zhì)量濃度的增加，胞內(nèi)DNA含量降低程度加大，這在其他抗菌化合物中也觀察到類(lèi)似現(xiàn)象，如Sieniawska等[22]利用熒光染色法對(duì)丹參油處理后大腸桿菌DNA進(jìn)行精準(zhǔn)定量，熒光染色DNA定量結(jié)果與熒光顯微圖都顯示丹參油處理后可顯著降低DNA含量。結(jié)合文獻(xiàn)與圖4結(jié)果可推測(cè)，茶皂素使釀酒酵母DNA含量降低的原因，可能有以下兩點(diǎn)：(1)茶皂素可引起胞內(nèi)大分子物質(zhì)核酸的泄露，從而減低內(nèi)部DNA含量；(2)其可能干擾了DNA的正常合成代謝，進(jìn)而影響復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和表達(dá)等過(guò)程，導(dǎo)致代謝合成過(guò)程紊亂，從而達(dá)到抑菌的目的[25]。

2.2.7 茶皂素對(duì)釀酒酵母蛋白泄露及合成的影響

采用1 MIC濃度茶皂素處理釀酒酵母以觀察茶皂素對(duì)細(xì)胞蛋白質(zhì)泄露的影響，結(jié)果如圖8所示，茶皂素處理2 h后胞外蛋白質(zhì)含量即達(dá)到55.11 μg/mL，且胞外蛋白質(zhì)含量隨著茶皂素處理時(shí)間的增加迅速增大，當(dāng)經(jīng)過(guò)8 h處理后蛋白含量為68.21 μg/mL，胞外蛋白質(zhì)含量顯著增加（p<0.05），是陰性對(duì)照組胞外蛋白質(zhì)含量的3.4倍，而陰性對(duì)照組胞外蛋白質(zhì)含量隨時(shí)間增加無(wú)顯著變化（p>0.05）。此外，如表3所示，茶皂素處理8 h后釀酒酵母胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量為901.66 μg/mL，與陰性對(duì)照組（1677.22 μg/mL）相比，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量降低了46.24%，胞外蛋白質(zhì)含量的增加以及胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量的降低說(shuō)明1 MIC濃度茶皂素處理引起了釀酒酵母細(xì)胞蛋白質(zhì)的泄露，原因可能是其破壞了細(xì)胞膜對(duì)菌體的支撐保護(hù)功能[26]。

另一方面，圖8和表3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，8 h茶皂素處理后釀酒酵母胞外蛋白質(zhì)泄露量48.06 μg/mL遠(yuǎn)小于細(xì)胞中蛋白質(zhì)減少量775.56 μg/mL。同時(shí)，Zhao等[12]研究發(fā)現(xiàn)從黑加侖果皮中提取的多酚提取物C3G也可使金黃色葡萄球菌胞內(nèi)蛋白質(zhì)和DNA發(fā)生顯著泄露，且胞內(nèi)蛋白質(zhì)減少量遠(yuǎn)小于胞外蛋白質(zhì)泄露量，這與本文結(jié)論一致。因此，推斷造成這種現(xiàn)象的原因可能是茶皂素通過(guò)增大細(xì)胞膜通透性進(jìn)入細(xì)胞，在胞內(nèi)干擾細(xì)菌DNA合成以及相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而干擾蛋白質(zhì)合成[27,28]，直接導(dǎo)致蛋白含量降低。

表3 釀酒酵母胞內(nèi)總蛋白含量Table 3 Total intracellular protein content of Saccharomyces cerevisiae

綜上所述，茶皂素對(duì)釀酒酵母的抑制作用可能是一方面通過(guò)增大細(xì)胞膜通透性，導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)泄露到胞外，另一方面直接進(jìn)入胞內(nèi)干擾蛋白質(zhì)合成，進(jìn)而擾亂細(xì)胞正常生長(zhǎng)代謝，通過(guò)上述兩方面協(xié)同作用，達(dá)到抑制釀酒酵母的效果。

3 結(jié)論

茶皂素對(duì)釀酒酵母、魯氏接合酵母及白色假絲酵母三種食源性腐敗酵母均有抑菌作用，其中對(duì)釀酒酵母的抑菌效果最為顯著。以釀酒酵母為指示菌的抑菌機(jī)理表明，茶皂素可阻滯菌體細(xì)胞正常生長(zhǎng)增殖，且能顯著抑制生物膜形成，避免了茶皂素對(duì)釀酒酵母的抑菌作用的降低；同時(shí)，茶皂素可使腐敗酵母表面塌陷和皺縮，失去原有形狀，進(jìn)而破壞細(xì)胞膜完整性，增大細(xì)胞膜通透性，導(dǎo)致胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)泄漏，影響菌體正常物質(zhì)代謝；此外，茶皂素可通過(guò)細(xì)胞膜滲透進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，干擾DNA和蛋白質(zhì)合成，使細(xì)胞無(wú)法正常進(jìn)行遺傳信息表達(dá)，擾亂代謝合成進(jìn)程，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，從而達(dá)到抑菌的目的。研究結(jié)果表明茶皂素是一種極具潛力的針對(duì)食源性腐敗酵母的天然防腐劑，尤其在高滲食品防腐方面具有良好的應(yīng)用前景。