巖白菜素治療特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化的研究

魏 祎，齊 鳴，黃麗羽，劉 超

0 引 言

巖白菜素是一種從多種藥用植物中提取的化合物，具有抗炎[4]、抗腫瘤[5]、抗氧化[6]和抗菌[7]的作用。此外，巖白菜素還具有顯著的鎮(zhèn)咳、祛痰的特性。巖白菜素作為天然植物源產(chǎn)品，其來(lái)源廣闊，價(jià)格低廉，具有極好的開發(fā)前景。已有研究表明，巖白菜素在博來(lái)霉素(Bleomycin，BLM)誘導(dǎo)的IPF小鼠模型中可以通過(guò)抑制IκBα磷酸化和p65核移位來(lái)阻斷NF-κB信號(hào)傳遞[8]。巖白菜素還可以激活Nrf2抗氧化應(yīng)激通路。上調(diào)E-鈣黏蛋白，下調(diào)纖維連接蛋白、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá)，減弱IPF小鼠模型中成纖維細(xì)胞的積累，抑制肺上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition, EMT)樣改變[9]。然而，目前對(duì)于巖白菜素治療IPF的作用尚未進(jìn)行更多深入的研究。本研究采用BLM構(gòu)建IPF小鼠模型，給予巖白菜素灌胃給藥28 d，研究巖白菜素通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK/ATF4/CHOP信號(hào)通路進(jìn)而治療IPF的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠50只，6～8周齡，體重(20±2)g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2021-0006。所有動(dòng)物飼養(yǎng)于室溫23～25 ℃、相對(duì)濕度(40±10)%、暗/光循環(huán)12 h的環(huán)境中。自由飲食飲水。

1.2藥物和試劑BLM(貨號(hào)M2100)購(gòu)自美國(guó)Abmole公司；地塞米松(純度 99%，B25793)、巖白菜素(純度≥98%，B21429)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；HE 染色試劑盒(C0105)、Masson三色染色試劑盒(G1340)購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；Collagen III抗體(22734-1-AP)、CHOP抗體(15204-1-AP)、ATF4抗體(10835-1-AP)、PERK抗體(24390-1-AP)購(gòu)于美國(guó)Proteintech公司。

1.3儀器H1850-R型冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)，QL-866型混勻儀(Vortex Mixer公司)，光學(xué)顯微鏡(日本Nikon公司)，蛋白電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，凝膠成像儀(杭州米歐儀器有限公司)。

1.4方法

1.4.1 分組、造模與給藥小鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組(不作任何處理)、模型組(BLM 5 mg/kg氣管內(nèi)滴注制作模型)、陽(yáng)性藥組(造模后給予地塞米松5 mg/kg灌胃)、巖白菜素高劑量組(造模后給予巖白菜素100 mg/kg灌胃)、巖白菜素低劑量組(造模后給予巖白菜素50 mg/kg灌胃)，每組10只。模型組于第0天氣管內(nèi)滴注BLM，劑量為5 mg/kg，構(gòu)建小鼠IPF模型，造模次日開始藥物干預(yù)，巖白菜素使用DMSO溶液溶解，每日分別給予陽(yáng)性藥組、巖白菜素低劑量組、巖白菜素高劑量組5 mg/kg地塞米松、50 mg/kg、100 mg/kg巖白菜素灌胃，對(duì)照組每天給予等滲鹽水0.2 mL灌胃，持續(xù)給藥28 d。

1.4.2生物樣本收集與處理取小鼠右側(cè)肺組織，稱小鼠肺濕重，計(jì)算肺指數(shù)公式如下：

肺指數(shù)=肺濕重(mg)/體重(g)×100%

劉崐辭世后，家里一貧如洗，家人對(duì)他的安葬成了最大的問(wèn)題。他的弟子門生感其為人，湊足一萬(wàn)兩銀子，合力把他的遺體埋葬在岳麓區(qū)的一處山丘，并置下墓地墓廬，墓名為“皇清誥授光祿大夫湖南巡撫劉公韞齋府君之墓”。 2010年6月，長(zhǎng)沙市文物局在第三次全國(guó)文物普查中，在岳麓區(qū)含浦鎮(zhèn)玉江村羅家灣發(fā)現(xiàn)了劉崐的墓,由此揭開了該地“學(xué)士”名稱的來(lái)歷之謎。后人因?qū)λ膽涯?，將其墓地附近的一條路命名為學(xué)士路。當(dāng)今，在含浦鎮(zhèn)有一個(gè)村落叫學(xué)士村，有一個(gè)收費(fèi)站叫學(xué)士收費(fèi)站，有一條大道叫學(xué)士路,有一所學(xué)校叫周南學(xué)士實(shí)驗(yàn)學(xué)校。人們自發(fā)地緬懷著紀(jì)念著劉崐,他已永遠(yuǎn)活在湖南人民心中。

然后用10%多聚甲醛固定48 h，石蠟包埋切片后切成厚度約0.4 cm厚的組織薄片，進(jìn)行HE染色、Masson染色，之后于100倍光學(xué)顯微鏡下觀察切片，并根據(jù)Ashcroft標(biāo)準(zhǔn)[10]評(píng)分量化肺纖維化程度，得分越高說(shuō)明纖維化程度越嚴(yán)重。最后在顯微鏡下觀察切片并拍照。

1.4.3免疫熒光檢測(cè)肺組織中Collagen III將石蠟切片放入二甲苯中浸泡脫蠟后再水洗，放于SSC溶液中進(jìn)行抗原修復(fù)，與5%山羊血清孵育1 h，4 ℃溫度下與一抗孵育過(guò)夜。第2天用PBS沖洗掉一抗后，將載玻片與二抗在室溫下孵育1 h。再用PBS沖洗掉二抗后，加入DAPI進(jìn)行核染色。

1.4.4q-PCR檢測(cè)肺組織中PERK、ATF4、CHOPmRNA表達(dá)水平取適量肺組織，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA作為模板，按照試劑盒說(shuō)明分別加入引物和qPCR Mix等，PCR反應(yīng)條件：95 ℃15 min，95 ℃20 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。熔解曲線分析：溫度65～95 ℃，每升溫0.5 ℃采集一次熒光信號(hào)。引物設(shè)計(jì)見表1。

表 1 q-PCR引物序列

1.4.5Western-blot 法檢測(cè)肺組織中PERK、ATF4、CHOP蛋白表達(dá)水平提取肺組織勻漿中的總蛋白，BCA 法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度，SDS-PAGE 電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，使用 5%脫脂奶粉封閉，2 h后孵PERK、ATF4、CHOP一抗(稀釋比1∶2000)，4 ℃過(guò)夜，洗膜后孵二抗，室溫孵育2 h，顯色曝光，凝膠成像系統(tǒng)觀察，分析蛋白水平變化，其中，以β-actin為內(nèi)參蛋白。使用Image J軟件對(duì)條帶灰度值進(jìn)行量化分析。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠體重和肺指數(shù)變化模型組小鼠體重減輕和肺指數(shù)較對(duì)照組增加(P<0.05)。陽(yáng)性藥組、巖白菜素高劑量組、巖白菜素低劑量組小鼠體重較模型組上升，肺指數(shù)下降(P<0.05)。見圖1、圖2。

圖 1 小鼠體重變化曲線比較

與對(duì)照組比較， *P<0.01；與模型組比較， #P<0.01

2.2巖白菜素對(duì)小鼠肺組織形態(tài)學(xué)的影響與對(duì)照組比較，模型組小鼠肺組織的Ashcroft評(píng)分增加(P<0.05)；經(jīng)過(guò)給藥干預(yù)后，陽(yáng)性藥組、巖白菜素高劑量組、巖白菜素低劑量組的Ashcroft評(píng)分較模型組降低(P<0.05)。見圖3。與對(duì)照組比較，模型組小鼠肺泡間隔塌陷，肺組織正常結(jié)構(gòu)喪失，膠原纖維沉積過(guò)多，視野內(nèi)可見成團(tuán)的纖維組織。巖白菜素低劑量組仍可見連續(xù)的纖維化組織，巖白菜素高劑量組、陽(yáng)性藥組肺組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不同程度的修復(fù)，可見到正常的肺泡結(jié)構(gòu)，融合成團(tuán)的纖維化灶明顯減少。見圖4。

與對(duì)照組比較， *P<0.01；與模型組比較， #P<0.01

圖 4 巖白菜素對(duì)BLM誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠肺組織的影響

2.3巖白菜素對(duì)IPF模型小鼠中Collagen III表達(dá)的影響與對(duì)照組比較，模型組小鼠中Collagen III的熒光強(qiáng)度明顯升高；與模型組比較，陽(yáng)性藥組、巖白菜素高劑量組、巖白菜素低劑量組干預(yù)的熒光強(qiáng)度降低。見圖5。

圖 5 巖白菜素對(duì)BLM誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型中Collagen III免疫熒光的結(jié)果

2.4巖白菜素對(duì)IPF小鼠肺組織中PERK、ATF4、CHOPmRNA表達(dá)水平的影響與對(duì)照組比較，模型組IPF小鼠肺組織中PERK、ATF4、CHOPmRNA表達(dá)升高(P<0.05)；與模型組比較，巖白菜素各劑量組和陽(yáng)性藥組肺組織PERK、ATF4、CHOPmRNA表達(dá)下降(P<0.05)。見表2。

表 2 巖白菜素對(duì)IPF小鼠肺組織ATF4、CHOP、PERK mRNA表達(dá)的影響

2.5巖白菜素對(duì)IPF小鼠肺組織PERK、ATF4、CHOP蛋白表達(dá)水平的影響與對(duì)照組相比，模型組小鼠肺PERK、ATF4、CHOP蛋白表達(dá)水平升高；陽(yáng)性藥組、巖白菜素高劑量組、巖白菜素低劑量組肺組織的PERK、ATF4、CHOP蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。見圖6，表3。

1:對(duì)照組; 2:模型組; 3:陽(yáng)性藥組; 4:巖白菜素高劑量組; 5:巖白菜素低劑量組

表 3 巖白菜素對(duì)各組小鼠ATF4、CHOP、PERK蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

IPF是一種特殊形式的間質(zhì)性肺炎，可導(dǎo)致進(jìn)行性、不可逆的肺瘢痕化，在5年內(nèi)約有50%的患者因呼吸衰竭而死亡[11]。目前，越來(lái)越多的證據(jù)表明，中藥有助于改善IPF癥狀[12-14]。巖白菜素因其多種藥理活性而受到廣泛關(guān)注，本研究證實(shí)巖白菜素抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK/ATF4/CHOP信號(hào)通路，起到緩解IPF的作用。

BLM是一種用于多種腫瘤化療的常用藥物，因其能誘導(dǎo)建立IPF小鼠模型而被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科研中[15-16]。本次研究中，利用BLM氣管內(nèi)滴注造模，與對(duì)照組相比，模型組小鼠體重下降，肺臟指數(shù)明顯上升。肺組織病理分析發(fā)現(xiàn)肺泡細(xì)胞變性，炎癥浸潤(rùn)，大量膠原纖維沉積，肺泡間隔被破壞，可見成團(tuán)的纖維化灶，這些表明造模是成功的。經(jīng)過(guò)巖白菜素干預(yù)后，小鼠體重上升，肺指數(shù)下降，肺組織病變改善，提示巖白菜素可以緩解BLM誘導(dǎo)的IPF模型。

IPF的主要特征是成纖維細(xì)胞增殖、激活和ECM的過(guò)度沉積[17-18]。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是指上皮細(xì)胞失去細(xì)胞粘附特性，獲得遷移、侵襲、產(chǎn)生ECM組分等間充質(zhì)特性的生物學(xué)過(guò)程[19]，EMT在IPF中起著關(guān)鍵作用[20]。有研究表明，肺泡上皮細(xì)胞，特別是II型肺泡上皮細(xì)胞，通過(guò)EMT獲得成纖維細(xì)胞表型，促進(jìn)IPF的進(jìn)展[21]。Collagen III參與構(gòu)成ECM的骨架，在細(xì)胞的遷移和發(fā)育中起作用[22]。本研究通過(guò)免疫熒光檢測(cè)Collagen III的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在IPF模型中Collagen III表達(dá)明顯升高，經(jīng)地塞米松、巖白菜素干預(yù)后，表達(dá)下降，這與預(yù)期是相符合的。

本研究基于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK/ATF4/CHOP信號(hào)通路進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。PERK/ATF4/CHOP信號(hào)通路是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的重要通路，激活該條通路可以加重IPF程度。本研究也證實(shí)，模型組小鼠肺組織PERK、ATF4、CHOPmRNA表達(dá)以及PERK、ATF4、CHOP蛋白表達(dá)均明顯上升，經(jīng)巖白菜素治療后其表達(dá)量降低。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)是一種特殊的細(xì)胞器，負(fù)責(zé)維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)。任何干擾蛋白質(zhì)加工的因素都可能導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累，這種情況被稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[23]。研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物在IPF患者的肺組織中很常見，在IPF進(jìn)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[24]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激影響成纖維化細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的分化，肌成纖維細(xì)胞是成纖維細(xì)胞的激活亞群，可以產(chǎn)生大量的膠原纖維和細(xì)胞外基質(zhì)成分[25]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以進(jìn)一步介導(dǎo)細(xì)胞凋亡、EMT、炎癥反應(yīng)參與IPF的進(jìn)展[26]。細(xì)胞凋亡是包括IPF在內(nèi)許多器官纖維化疾病的關(guān)鍵機(jī)制[27]。其中CHOP誘導(dǎo)凋亡的研究最為深入，CHOP通過(guò)激活促凋亡基因和下調(diào)抗凋亡基因以調(diào)控細(xì)胞凋亡通路[28]。炎癥與IPF關(guān)系密切，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑已經(jīng)被證明可以調(diào)節(jié)炎癥信號(hào)通路，包括核因子κB(NF-κB)和激活蛋白-1(AP-1)。此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能會(huì)使巨噬細(xì)胞向M1或M2表型傾斜。研究發(fā)現(xiàn)，在IPF模型小鼠中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過(guò)CHOP促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2方向發(fā)生極化，從而促進(jìn)纖維化的進(jìn)展[29-30]。

綜上所述，本研究證實(shí)了巖白菜素可能通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK/ATF4/CHOP信號(hào)通路，以此起到緩解IPF的作用，為巖白菜素臨床治療IPF提供了新的證據(jù)。