巖白菜素在小鼠體內(nèi)的藥動學研究

竇 偉 李英倫肖 瀟 李亨東

(四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院藥學實驗室,四川雅安 625014)

巖白菜素在小鼠體內(nèi)的藥動學研究

竇 偉 李英倫*肖 瀟 李亨東

(四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院藥學實驗室,四川雅安 625014)

目的：研究巖白菜素（bergenin）在血液中的HPLC檢測方法及在健康小鼠體內(nèi)的藥動學。方法：65只健康小鼠，單劑量一次灌胃巖白菜素200 mg.kg-1；采用高效液相色譜法測定血藥濃度，血藥濃度最低檢測質(zhì)量濃度為0.203μg.mL-1，并以DAS 2.0藥動學軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析。結(jié)果：巖白菜素體內(nèi)過程符合一級吸收二室模型（權(quán)重=1），主要動力學參數(shù)如下：t1/2α為（1.363±0.761）h，t1/2β為（2.658±0.182）h，Tmax為（0.833±0.167）h，Cmax為（10.864±1.616）mg.L-1，AUC（0-t）為（44.626±5.497）mg.L-1.h-1，Ka為（2.918±1.643）l.h-1，MRT（0-t）為（3.600±0.210）h。結(jié)論：巖白菜素在健康小鼠體內(nèi)吸收迅速，生物利用度低，分布較廣，消除較快。

巖白菜素 藥動學 高效液相色譜

巖白菜素（C14H16O9），環(huán)合芳香碳苷類化合物，最早從巖白菜屬中植物提取出來而得名[1]。中國藥典收載為鎮(zhèn)咳祛痰藥，可用于慢性支氣管炎的治療，并有護肝、抗心律不齊、免疫增強、抗炎、抗HIV、等方面的藥理作用[2-6]。但由于巖白菜素脂溶性低，對光和熱不穩(wěn)定，其制劑在體內(nèi)不易被吸收，代謝快，生物利用度不高等因素，限制了巖白菜素的廣泛應用。本實驗通過對巖白菜素的藥動學和組織分布研究，建立巖白菜素的藥動學研究方法，為以后的在體藥效研究和劑型設計提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

巖白菜素對照品（中國藥品生物制品檢定所提供，批號：111532-200202），巖白菜素片（云南滇池藥業(yè)，批號：080105），磷酸、甲醇均為色譜級，實驗用水為超純水。

1.2 試驗動物

清潔級昆明小鼠65只，雌性，體重20±2.2g，購于成都生物制品研究所。小鼠購進后常規(guī)飼養(yǎng)，飼料不含任何抗生素，觀察五天無異常后進行實驗。

1.3 儀器

島津LC-2010C高效液相色譜儀、島津CLASS-VP色譜工作站，北京同泰聯(lián)TTL-DC氮吹儀。

2 試驗方法

2.1 供試品制備方法與測定

小鼠眼眶取血，血液收集到肝素抗凝管中，以4 000 r.min-1離心10 min后，將上清液取出，4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。取血漿0.1 ml加入甲醇1.0 ml，旋渦混合1 min，超聲波萃取5 min，4 000 r.min-1離心5min，取上清液，置40℃水浴中氮氣吹干。精密加入甲醇100μl溶解殘渣，旋渦振蕩混合均勻，4 000 r.min-1離心5 min，取上清液過0.45 μm濾膜，取濾液作為供試品溶液。

2.2 標準曲線和檢測限測定

取小鼠空白血漿6份，每份100μl，分別加入不同濃度的巖白菜素對照品溶液，使其在樣品中質(zhì)量濃度分別為0.5 μg.ml-1、2 μg.ml-1、5 μg.ml-1、10 μg.ml-1、15μg.ml-1、20μg.ml-1，旋渦振蕩混勻。進樣20μL，記錄巖白菜素峰面積，以峰面積（A）對濃度（C）作線形回歸。巖白菜素標準曲線回歸方程為Y = 6811C+ 1115.3，R2=0.9991。線性范圍為0.5～20μg/ml。以信噪稀釋法測定信噪比為3∶1時的濃度值，即為檢測限。巖白菜素的最低檢測質(zhì)量濃度為0.203μg.ml-1，最低檢測量為4.06 ng。

2.3 回收率與精密度實驗

表1 絕對回收率，相對回收率及精密度實驗結(jié)果.n=5

2.4 藥液制備和給藥方式

巖白菜素片藥液：2顆巖白菜素片（每片含巖白菜素120mg），加少量水研磨2min，定容至15ml，超聲乳化2 min，制成16mg.ml-1巖白菜素的藥液。

取小鼠65只，隨機分為5個平行組，給藥前禁食12h，自由飲水。按200mg.kg-1灌胃給藥。于給藥前及給藥后10min，20min，30min，40min，50min，1h，2h，4h，6h，8h，10h，12h眼眶取血，血樣直接采集到肝素抗凝管中，按2.1中方法處理待用。

2.5 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)所測的巖白菜素血藥濃度-時間數(shù)據(jù)，利用DAS2.0.1藥動學軟件計算藥動學參數(shù)。

色譜柱：phenomenex C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），流動相甲醇-0.7%磷酸（15：85），流速1.0ml.min-1，檢測波長275nm，柱溫40℃，進樣體積20μl。

在此色譜條件下，內(nèi)源性物質(zhì)和代謝產(chǎn)物不干擾測定，峰形和分離度良好，巖白菜素的保留時間為13.4min，柱效4530，結(jié)果見圖1.

圖1 生物樣品中巖白菜素的色譜圖A-空白血樣；B-給藥后血樣；C-空白血樣加巖白菜素；1-巖白菜素

3 實驗結(jié)果

3.1 色譜條件及適用性研究

3.2 藥動學參數(shù)的測定

小鼠給藥后，巖白菜素在小鼠體內(nèi)不同時間的平均血藥濃度數(shù)據(jù)用DAS2.0程序擬合，結(jié)果符合二室模型，其血藥濃度見表2，血藥濃度-時間曲線見圖3，主要藥動學參數(shù)見表3。

表2 小鼠灌胃巖白菜素后體內(nèi)血藥濃度（n=5）

圖2 小鼠灌胃（200 mg.kg-1）后血液中巖白菜素的血藥濃度-時間曲線（n=5）

4 討論

4.1 給藥劑量

人口服巖白菜素的推薦劑量為375mg/d，按體表面積比例折算小鼠灌胃量為1mg/d，但在此劑量下一次給藥，大部分時間點血藥濃度低于最低檢測限，無法準確檢測，故將一次性口服劑量擴大為4mg.（kg.bw）-1，該劑量下得到了較好的實驗結(jié)果。

4.2 巖白菜素的藥動學

健康小鼠灌服巖白菜素后，各項參數(shù)表明：巖白菜素在小鼠體內(nèi)吸收快，達峰時間短，吸收迅速。在大劑量給藥的情況下血藥濃度能達到一個較高的水平，說明巖白菜素在小鼠體內(nèi)的血藥濃度與給藥劑量呈正相關，提示了巖白菜素的吸收方式有可能為被動擴散，該結(jié)論與秦瑄[7]等以大鼠作為實驗動物的研究結(jié)果相符。導致巖白菜素吸收程度低的可能原因是：一、巖白菜素結(jié)構(gòu)中含有內(nèi)酯環(huán)，在堿性條件下易開環(huán)水解[8]；二、巖白菜素具疏水性，在水中溶解度不高。

另外，小鼠按200 mg.kg-1灌服巖白菜素后，T1/2a為（1.363±0.761）h，表明在小鼠體內(nèi)分布較快；V/F為（6.863±2.515）L.kg-1，說明巖白菜素在小鼠體內(nèi)分布廣泛。大鼠[7]T1/2a為（0.45±0.21）h，V/F（83.66±26.59）L.kg-1，與小鼠相比存在分布差異。

表3 小鼠灌胃（200 mg.kg-1）后血中巖白菜素的藥動學參數(shù)（二室模型）.n=5

小鼠灌服巖白菜素后的T1/2β為（2.658±0.182）h，CL/F為（2.152±0.289）L·kg-1·h-1，說明巖白菜素在小鼠體內(nèi)消除較快，有效血藥濃度維持時間較短。大鼠[7]T1/2β為（8.73±3.67）h，CL/F為（30.48±4.35）L·kg-1·h-1，大小鼠相比較，小鼠對巖白菜素的消除較快。

[1] 李百華，王俊平.巖白菜素的研究概況[J].西北藥學雜志，1990，5（3）：45-47.

[2] Lim H K，Kim H S，Choi H S，et al.Hepatoprotective effects of bergenin，a major constituent of Mallotus japonicus，on carbon tetrachloride-intoxicated rats[J]Journal of thnopharmacology，2000，72（3）：469-474.

[3] Pu HL，Huang X，Zhao JH，et al.Bergenin is the antiarrhythmic principle of Fluggea virosa[J].Planta Medica，2002，68（4）：372-374.

[4] Nighat N，Surrinder K，Mushtaq A，et al.Immunomodulatory effect of bergenin and norbergenin against adjuvant-induced arthritis—A flow cytometric study [J].Journal of Ethnopharmacology，2007，122（2）：401-405.

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[6] Inder P S，Sandip B B，Bhutani K.Anti-HIV natural products [J]. Current Science，2005，89（2）：269-290.

[7] 秦瑄.巖白菜素的生物藥劑學和藥代動力學基礎研究[D].四川大學，2007.

[8] 趙榮春，高志燕.巖白菜素的穩(wěn)定性研究[J].新疆醫(yī)學院學報，1993，16（4）：348-349.

竇偉（1984-），男，碩士研究生，從事新獸藥的開發(fā)。

李英倫（1965-），男，教授，博士，主要從事獸醫(yī)藥理與中獸醫(yī)的研究。