母乳miRNA對(duì)嬰兒生理功能發(fā)育的影響研究進(jìn)展

王銀妃，曾思潔，盛曉靜綜述，殷 勤審校

0 引 言

母乳(human breast milk，HBM)是嬰兒出生后最佳的營(yíng)養(yǎng)選擇。母乳含有脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、碳水化合物和礦物質(zhì)，利于新生兒及嬰兒消化和吸收，刺激和支持嬰兒不成熟的免疫系統(tǒng)，為嬰兒生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)和能量[1]。世界衛(wèi)生組織推薦在嬰兒生后的6個(gè)月內(nèi)進(jìn)行純母乳喂養(yǎng)，且繼續(xù)母乳喂養(yǎng)直至2歲。

近年來(lái)，人們對(duì)母乳成分的研究越來(lái)越多，尤其是對(duì)其生物活性物質(zhì)的研究，如微小核糖核酸(micro ribonucleic acid，miRNA)、人乳寡糖、乳鐵蛋白等[2]。這些成分促進(jìn)母乳喂養(yǎng)兒的免疫系統(tǒng)和胃腸道功能成熟，促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育。配方奶以母乳為標(biāo)準(zhǔn)，添加乳鐵蛋白、DHA、ARA等活性成分，以更接近母乳成分，得到了許多積極的發(fā)展結(jié)局，包括在認(rèn)知功能，視力發(fā)育和免疫功能發(fā)育等的促進(jìn)作用。然而配方奶不僅含有的miRNA數(shù)量不足，而且其miRNA與母乳的表達(dá)譜完全不同，這一缺陷可能對(duì)嬰兒的長(zhǎng)期免疫和代謝規(guī)劃產(chǎn)生負(fù)面影響。母乳中大量miRNA的發(fā)現(xiàn)，使得越來(lái)越多的研究集中在母乳對(duì)嬰兒健康的潛在作用上[3]。miRNA是許多生物學(xué)過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)控因子。本文在簡(jiǎn)要描述miRNA的生物起源及其轉(zhuǎn)運(yùn)與吸收后，重點(diǎn)就母乳中miRNA對(duì)嬰兒生理功能發(fā)育的影響做一綜述。

1 miRNA的生物起源

微小核糖核酸是一類具有20～25個(gè)核苷酸的非編碼小RNA，在信使RNA轉(zhuǎn)錄后發(fā)揮重要調(diào)控作用[4]。miRNA的生物發(fā)生是由核糖核酸聚合酶Ⅱ啟動(dòng)的，在細(xì)胞核合成，產(chǎn)生初級(jí)微小核糖核酸分子，然后由微處理器復(fù)合體加工成前微小核糖核酸分子，這些分子從細(xì)胞核中輸出到細(xì)胞質(zhì)中，被核糖核酸內(nèi)切酶-Dicer酶進(jìn)一步加工產(chǎn)生成熟的miRNAs。最終在RNA的沉默復(fù)合物的結(jié)合下，miRNA通過(guò)各種方式和機(jī)制如外泌體、微囊泡、核糖體復(fù)合物等轉(zhuǎn)出細(xì)胞[4]。miRNA在不同的組織、細(xì)胞和生物液體中被發(fā)現(xiàn)，如血液、唾液、尿液、淚液和人類乳汁等。越來(lái)越多的研究報(bào)道母乳中含有豐富的miRNAs，已鑒定出約1400種不同的miRNAs，這些miRNAs可能對(duì)具有不同功能的基因進(jìn)行調(diào)控，參與細(xì)胞和組織的分化、增殖和凋亡[5]。

2 母乳中miRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)與吸收

miRNA須克服多種障礙來(lái)實(shí)現(xiàn)其功能，如胃腸道pH值、RNA酶、腸道菌群及腸細(xì)胞間的細(xì)胞連接。從消化道進(jìn)入循環(huán)后，循環(huán)酶、免疫系統(tǒng)、血管內(nèi)皮和膜本身對(duì)miRNA的完整性都有危害[6-7]。外泌體(exosomes)在miRNA的運(yùn)輸與吸收中起著關(guān)鍵作用。外泌體是約30 100納米的雙層脂質(zhì)囊泡，由多種細(xì)胞產(chǎn)生，通過(guò)其內(nèi)容物將信息傳遞給受體細(xì)胞[8]。此外，Charlotte等從人類母乳中分離出外泌體，并且證明它們包含小RNA分子以及參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的膜和胞質(zhì)蛋白質(zhì)[9-10]。Liao等[11]人通過(guò)體外研究展示了母乳外泌體miRNAs在模擬胃/胰腺消化過(guò)程中的生存能力和復(fù)雜性。細(xì)胞通過(guò)多種內(nèi)吞途徑攝取外泌體，包括網(wǎng)格蛋白依賴型和網(wǎng)格蛋白不依賴型內(nèi)吞途徑。母乳外泌體保護(hù)miRNA免受降解，由內(nèi)吞作用介導(dǎo)，依賴于外泌體表面糖蛋白，被腸道細(xì)胞攝取，然后進(jìn)入血液循環(huán)，運(yùn)送到各個(gè)器官[12]。

3 母乳miRNA對(duì)于嬰兒生理功能發(fā)育的影響

人類母乳外泌體中的miRNAs可以通過(guò)多個(gè)方面來(lái)影響嬰兒的生理功能發(fā)育。目前的研究主要集中于糖脂代謝、腸道、神經(jīng)發(fā)育、免疫功能發(fā)育、表觀遺傳學(xué)和嬰兒疾病防治等方面。

3.1母乳miRNA與糖代謝和脂代謝母乳作為嬰兒期最重要的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，是糖、脂代謝性疾病的保護(hù)因素[13]。母乳細(xì)胞外囊泡富含多種miRNAs，例如miR-148a、miR-92a、miR-146a、miR-125b、miR-26a、miR-33、miR-181b等，這些miRNAs對(duì)糖脂代謝有重要的調(diào)節(jié)作用[14]。在糖代謝方面，Melnik等[15]研究發(fā)現(xiàn)母乳來(lái)源的miRNA-148a與胰腺β細(xì)胞分化相關(guān)，由于胰腺β細(xì)胞分化與2型糖尿病的發(fā)生有密切的關(guān)系，因此，研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)母乳喂養(yǎng)對(duì)預(yù)防2型糖尿病的發(fā)生具有潛在的保護(hù)作用。miR-92a通過(guò)靶向KLF2可以抑制高糖環(huán)境誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，增加胰島素的分泌和增殖，從而在糖尿病中保護(hù)胰腺β細(xì)胞的功能，miR-92a可能成為臨床中治療糖尿病的潛在候選藥物[16]。在脂代謝方面，miR-146a通過(guò)TGF-β和AKT/mTORC1信號(hào)通路，通過(guò)靶向SMAD4和TRAF6，從而抑制脂肪生成[17]。miR-125b-5p則可以通過(guò)抑制Map4k4，從而抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成，降低脂代謝對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化的影響[18]。此外，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，miR-26a、miR-33、miR-181b等miRNAs不僅影響糖代謝，同時(shí)也影響脂質(zhì)代謝[19-21]。其中，miR-26a可以調(diào)節(jié)高脂肪飲食的小鼠肝中的葡萄糖和脂質(zhì)代謝，肝miR-26a通過(guò)調(diào)節(jié)關(guān)鍵代謝基因參與葡萄糖代謝、脂質(zhì)代謝和胰島素信號(hào)[20]，miR-26a有可能成為治療肥胖相關(guān)代謝綜合征的潛在治療靶點(diǎn)，有待于進(jìn)一步的探索。miR-33*(miR-33a和miR-33b)位于甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白基因內(nèi)，是調(diào)節(jié)致脂基因表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，miR-33b同時(shí)也可以抑制磷酸烯醇丙酮酸羧基酶和葡萄糖6-磷酸酶的表達(dá)，這是肝葡萄糖生成的2個(gè)關(guān)鍵酶，可以調(diào)節(jié)葡萄糖的生成[21]。另有發(fā)現(xiàn)miR-181b通過(guò)調(diào)節(jié)白色脂肪組織內(nèi)皮功能改善血糖穩(wěn)態(tài)和胰島素敏感性，而miR-181b在HBM的EVs中含量豐富[19]。與配方奶喂養(yǎng)相比，母乳喂養(yǎng)可預(yù)防后期肥胖和2型糖尿病的發(fā)生?？傊?，HBM的miRNAs在糖脂代謝中具有潛在的重要作用，影響嬰兒的代謝發(fā)育及成年期代謝性疾病的發(fā)生與發(fā)展。

3.2母乳miRNA與腸道發(fā)育母乳外泌體微小核糖核酸可能影響腸道的結(jié)構(gòu)和功能，在新生兒、嬰兒期，由于腸道結(jié)構(gòu)和功能發(fā)育的不完全，這種影響尤為重要。腸道上皮細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的選擇性吸收中起著基礎(chǔ)性作用，此外腸道上皮細(xì)胞也是免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的主要來(lái)源和生理性上皮屏障的關(guān)鍵部分[22]。Martin等[23]在過(guò)氧化氫處理過(guò)的腸上皮細(xì)胞中，添加母乳外泌體消除了過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡增加，同時(shí)顯著提高了細(xì)胞活力，母乳外泌體可以保護(hù)腸上皮細(xì)胞免受氧化應(yīng)激。母乳外泌體和腸上皮細(xì)胞之間存在相互作用，受到母乳miRNA調(diào)控[3]。MiR-200家族在母乳外泌體中含量豐富，可以影響上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，EMT在上皮結(jié)構(gòu)中具有關(guān)鍵作用，miR-200和miR-375可增加細(xì)胞遷移和侵襲，miR-200b可在體外抑制腸上皮細(xì)胞緊密連接的中斷[24]。miR-99b在母乳中含量非常豐富，可以增強(qiáng)乳脂肪球表皮生長(zhǎng)因子Ⅷ的表達(dá)和恢復(fù)腸上皮細(xì)胞的遷移[25]。采用脂多糖建立的小鼠腸道炎癥模型中，外泌體miR-4334和miR-219通過(guò)NF-κB途徑減少脂多糖誘導(dǎo)的炎癥，miR-338通過(guò)p53途徑抑制脂多糖誘導(dǎo)的凋亡，而這些抗凋亡和抗炎作用是由外泌體miRNA介導(dǎo)的，miR-4334、miR-219、miR-338在母乳的外泌體中均富含[26]，嬰兒可以通過(guò)母乳的攝入，實(shí)現(xiàn)外泌體miRNA轉(zhuǎn)運(yùn)影響腸道的結(jié)構(gòu)和功能，促進(jìn)腸道發(fā)育，同時(shí)減少新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎(necrotizing enterocolitis，NEC)的發(fā)生。

3.3母乳miRNA與神經(jīng)發(fā)育母乳外泌體中影響神經(jīng)發(fā)育的含量高的miRNAs不多。最富含的miRNAs為let-7家族，因?yàn)閘et-7前體加工活性的增加與細(xì)胞的神經(jīng)分化有關(guān)，有研究報(bào)道let-7在胚胎干細(xì)胞分化和神經(jīng)發(fā)生的早期發(fā)育調(diào)控中起著一定的作用[27]。miR-29b也在母乳外泌體中被發(fā)現(xiàn)，小鼠miR-29b基因的敲除，會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的死亡[28]。在大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞中，miR-574-5p的過(guò)表達(dá)和下調(diào)分別促進(jìn)和抑制神經(jīng)發(fā)生[29]。在母乳中還檢測(cè)到其他3種miRNAs(miR-15b，miR-132和miR-210)。作為let-7家族成員，miR-15b可以促進(jìn)小鼠神經(jīng)元的分化并抑制神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖[30]。miR-132則可以通過(guò)改善記憶，從而促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育[31]。然而，miR-210的抑制則可以增加體外神經(jīng)元存活[32]?？偟膩?lái)說(shuō)，通過(guò)母乳外泌體miRNA的檢測(cè)及其功能的研究，miRNA有益于早期神經(jīng)功能的發(fā)育[33]，未來(lái)需要進(jìn)一步研究更多的母乳外泌體中的miRNA，為促進(jìn)嬰兒神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)展提供更多的理論基礎(chǔ)。

3.4母乳miRNA與免疫功能發(fā)育母乳可以將與免疫相關(guān)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)從母體傳給嬰兒。母乳不僅含有大量的免疫成分，還含有一些非特異性因子，如溶菌酶、乳鐵蛋白、寡糖等。母乳中與免疫相關(guān)的miRNA包括miR-223，miR-146b-5p，miR-181a，miR-150，miR-155，miR-92a和miR-17等[34]。其中，miR-223、miR-146、miR-181a和miR-155在初乳中的表達(dá)量高于成熟乳，miR-181和miR-155則參與了B細(xì)胞的分化，在初乳中，這些表達(dá)量高的miRNA與新生兒母嬰免疫能力的轉(zhuǎn)移作用也是同步的[35]。miR-181a可以靶向IL1a mRNA的3′非翻譯區(qū)，在體外調(diào)節(jié)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，從而提高其免疫功能[36]。miR-17和miR-92也存在于母乳中，與單核細(xì)胞發(fā)育的調(diào)節(jié)以及B和T細(xì)胞的分化和成熟有關(guān)[37]。嬰兒的免疫功能影響著各種感染性疾病的轉(zhuǎn)歸與預(yù)后，Karam等[38]通過(guò)差異表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)血清miR-146a在膿毒癥患兒組的表達(dá)水平低于健康兒童，并且和膿毒癥的嚴(yán)重程度相關(guān)，這提示miR-146a對(duì)兒童膿毒癥具有診斷和預(yù)后價(jià)值。miR-223則與免疫功能相關(guān)的粒細(xì)胞增殖有關(guān)[39]。Kohlhaas等[40]在小鼠miR-155基因缺失模型中發(fā)現(xiàn)胸腺和外周血中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量減少，這表明這種miRNA可能對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的發(fā)育有著重要的影響。母乳喂養(yǎng)可能提高嬰兒體內(nèi)這些miRNA 的水平，從而起到抗感染、抗炎的作用。

3.5母乳miRNA與表觀遺傳調(diào)節(jié)母乳miRNA除了在嬰兒糖脂代謝、腸道、神經(jīng)、免疫等發(fā)育中起著一定的作用，還可以通過(guò)表觀遺傳機(jī)制，對(duì)個(gè)體的全生命周期產(chǎn)生一定的影響[12]。miRNAs可以通過(guò)調(diào)控DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)的表達(dá)，參與DNA甲基化，這對(duì)各種基因的表達(dá)和人類疾病的發(fā)生與發(fā)展有著至關(guān)重要的作用[41]。miR-148a在母乳中含量豐富，能靶向DNMT1，從而分別增強(qiáng)叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子、胰島素、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1、脂肪含量和肥胖相關(guān)蛋白等發(fā)育基因的表達(dá)，來(lái)影響嬰兒的生理功能發(fā)育。乳源性miR-125b可能抑制p53的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)，而p53和DNMT1都是控制轉(zhuǎn)錄和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵基因組，這些關(guān)鍵基因組可以影響全生命周期的發(fā)育與疾病發(fā)生發(fā)展[12]。

3.6母乳miRNA與嬰兒疾病防治大量流行病學(xué)調(diào)查提示母乳能預(yù)防多種嬰兒相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展，如營(yíng)養(yǎng)不良、支氣管肺發(fā)育不良 (broncho-pulmonary dysplasia，BPD) 與NEC等，但具體作用機(jī)制目前仍有待研究[42-43]。而外泌體miRNA在治療BPD、NEC、營(yíng)養(yǎng)不良和過(guò)敏性疾病中也有良好的應(yīng)用前景。

營(yíng)養(yǎng)不良影響著全世界大約5000萬(wàn)兒童，與全球5歲以下兒童死亡率的45% 有關(guān)。嚴(yán)重急性營(yíng)養(yǎng)不良與腸黏膜屏障破壞和上皮萎縮有關(guān)。在飼喂低蛋白飲食誘發(fā)營(yíng)養(yǎng)不良的模型小鼠中，口服牛乳外泌體可以改善腸絨毛萎縮和屏障功能障礙。盡管持續(xù)低蛋白飲食喂養(yǎng)，外泌體治療可改善腸道通透性、改善腸道結(jié)構(gòu)和促進(jìn)腸上皮細(xì)胞生長(zhǎng)[44]。這些數(shù)據(jù)表明，對(duì)于發(fā)病率和死亡率高風(fēng)險(xiǎn)的營(yíng)養(yǎng)不良兒童，外泌體可能作為一種輔助治療手段。

在采用脂多糖建立的小鼠腸道炎癥模型中，母乳外泌體中富含的miR-4334和miR-219可以通過(guò)NF-κB途徑減少脂多糖誘導(dǎo)的炎癥，miR-338通過(guò)p53途徑抑制脂多糖誘導(dǎo)的凋亡[26]，提示母乳來(lái)源外泌體miRNA可作為降低新生兒 NEC 發(fā)生率和嚴(yán)重程度的治療手段。

Braun等[45]通過(guò)間充質(zhì)干細(xì)胞干預(yù)高氧誘導(dǎo)的BPD模型組新生大鼠，發(fā)現(xiàn)外泌體保護(hù)了高氧暴露下肺泡和血管的正常發(fā)育，而母乳外泌體中含有豐富的間充質(zhì)干細(xì)胞。因此，母乳外泌體可能具有防治BPD的作用。

在一項(xiàng)回顧性研究中發(fā)現(xiàn)短期進(jìn)行或不進(jìn)行母乳喂養(yǎng)與兒童哮喘患病風(fēng)險(xiǎn)增高有關(guān)[46]。Rigotti 等[47]報(bào)道過(guò)敏母親的乳汁中分泌的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)較對(duì)照組明顯減少。6個(gè)月后，46% 的過(guò)敏母親喂養(yǎng)的嬰兒出現(xiàn)特異性皮炎，而對(duì)照組未過(guò)敏母親喂養(yǎng)的嬰兒沒(méi)有出現(xiàn)。TGF-β是 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化的關(guān)鍵激活因子。而外泌體 miRNA-148a靶向 DNMT1和轉(zhuǎn)移 TGF-β，可以增加胸腺 FOXP3穩(wěn)定表達(dá)，從而促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的發(fā)育[12,48]。 在純母乳喂養(yǎng)期間，TGF-β 可能阻止特應(yīng)性疾病的發(fā)展。因此，配方奶中缺失外泌體 TGF-β 和 miRNA-148a 信號(hào)，以及過(guò)敏母親的母乳缺乏外泌體TGF-β，可能不利于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞成熟，增加?jì)雰哼^(guò)敏風(fēng)險(xiǎn)。

3.7母乳miRNA的其他生理功能骨骼處于持續(xù)重塑的動(dòng)態(tài)過(guò)程中，這有助于調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)，修復(fù)日常壓力對(duì)骨骼造成的微小損傷，并在生長(zhǎng)過(guò)程中塑造骨骼。在兒童早期，骨形成和骨重建都有發(fā)生。外泌體miRNA可與多種信號(hào)分子相互作用，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活動(dòng)，控制骨重建的過(guò)程[49-50]。

母乳中富含組織特異性的 miRNA，如脂肪組織特異性 miR-642、肝特異性miR-122、 心臟特異性的 miR-1 和 miR-133[34]。有學(xué)者猜想這些miRNA可能與嬰兒心臟、肝等器官和組織發(fā)育及功能保護(hù)有關(guān)，有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

4 結(jié) 語(yǔ)

綜上所述，在國(guó)內(nèi)外母乳喂養(yǎng)的好處已被廣泛認(rèn)可，母乳不僅是一種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，更包含了促進(jìn)嬰兒生理功能發(fā)育的各種生物活性物質(zhì)。母乳是嬰兒早期生長(zhǎng)發(fā)育不可替代的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源。雖然 miRNA在細(xì)胞與組織水平的作用已得到證實(shí)，但從宏觀角度對(duì)機(jī)體的作用仍待進(jìn)一步研究。未來(lái)需要更大樣本的前瞻性隊(duì)列研究，通過(guò)更為先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手段，來(lái)明確母乳外泌體中各種miRNAs對(duì)嬰兒及全生命周期生長(zhǎng)發(fā)育及疾病發(fā)生發(fā)展的影響，為精準(zhǔn)闡明母乳在子代發(fā)展中的作用提供依據(jù)[51]。