不同時(shí)期RNA干擾水通道蛋白4對(duì)早期創(chuàng)傷性腦水腫影響的觀察

趙 旭，宋振全，梁國(guó)標(biāo)，李曉明，李 賓，呂 偉，毛振立，雷 偉，劉洪波

在早期腦損傷(early brain injury，EBI)的發(fā)病機(jī)制中腦水腫的發(fā)生和血腦屏障(blood－brain barrier，BBB)的破壞起重要作用［1］。大量研究證實(shí)，腦水腫的發(fā)生與水通道蛋白4(aquaporin4，AQP4)緊密相關(guān)［2－3］。創(chuàng)傷性腦水腫的早期治療十分關(guān)鍵，而由于其復(fù)雜的機(jī)制，人們對(duì)傷后AQP4的調(diào)節(jié)存在爭(zhēng)議，對(duì)于早期腦損傷的機(jī)制也有待進(jìn)一步探索。許多研究證實(shí)應(yīng)用RNA干擾的方法可有效沉默體內(nèi)外AQP4和mRNA的表達(dá)［4］，筆者希望探索在不同時(shí)期抑制AQP4蛋白的表達(dá)對(duì)早期創(chuàng)傷性腦水腫發(fā)生發(fā)展的影響及相關(guān)機(jī)制。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物分組 健康成年雄性Wistar大鼠90只，體質(zhì)量250～300g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)數(shù)字表法分為:假手術(shù)組、單純創(chuàng)傷組、傷前6h給藥組、創(chuàng)傷即刻給藥組和傷后6h給藥組。

1.2 主要試劑及儀器 采用化學(xué)合成法合成的大鼠siRNA(Aqp4-rat-725:5’GCAGUUAUCAUGGGAAACU TT3’，5’AGUUUCCCAUGAUAACUGCTT3’，上海吉瑪生物工程有限公司;實(shí)驗(yàn)證明，腦室給藥后6h可有效降低腦內(nèi)AQP4蛋白和mRNA的含量，驗(yàn)證過程略)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 TBI模型制備 參照改良Feeney’s自由落體硬膜外撞擊法制作局灶性腦挫裂傷模型。采用水合氯醛350mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，將大鼠俯臥位固定于腦立體定向儀上。以囟門后約1mm，旁開2.5mm為中心以磨鉆磨一直徑約5mm的骨窗，暴露硬腦膜。將撞桿頭端(直徑3mm)置于骨窗硬腦膜，其外為垂直聚乙烯套管，用40g打擊棒沿外周套管從25cm高度自由落下沖擊聚乙炔圓錐，下落沖擊力1 000cm×g，造成大腦半球局部腦挫裂傷。

2.2 各實(shí)驗(yàn)組處理 分別于傷前6h、創(chuàng)傷即刻和傷后6h向左側(cè)腦室注入AQP4 siRNA20μl［10μM，將0.25OD AQP4 siRNA溶于20μl焦碳酸二乙酯(DEPC)水中］;單純創(chuàng)傷組在創(chuàng)傷即刻向左側(cè)腦室注入生理鹽水20μl;假手術(shù)組不行創(chuàng)傷，開窗后腦室注入20μl生理鹽水，縫合。然后進(jìn)行腦組織含水量測(cè)定，血腦屏障通透性測(cè)定，灌注、取材及包埋，HE標(biāo)本制作及觀察，AQP4、ZO-1和MMP9蛋白免疫組織化學(xué)觀察，原位雜交方法檢測(cè)AQP4 mRNA的表達(dá)。

2.3 數(shù)據(jù)處理

所測(cè)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 在精神、運(yùn)動(dòng)和行為等方面，各創(chuàng)傷組間未見明顯差異。局灶性腦挫裂傷形成后，大鼠平均呼吸暫停時(shí)間約15s。有9只大鼠在硬膜外撞擊后死亡，死亡率為12.5%(9/72)。

2 顱腦損傷后2d，各損傷組較假手術(shù)組的腦組織含水量均明顯增加(P＜0.05)。與假手術(shù)組相比，單純創(chuàng)傷組和傷后6h給藥組的增幅最大，分別為7.78%和6.47%(P＜0.05)，后兩者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。傷前6h給藥組和創(chuàng)傷即刻給藥組增幅較小，分別為2.95%和3.07%，兩者間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表1)。另外，給予AQP4 siRNA組大鼠于傷后3、5、7d，腦組織含水量較單純創(chuàng)傷組均顯著降低(未加入數(shù)據(jù))。

表1 顱腦損傷2d后各實(shí)驗(yàn)組大鼠腦組織含水量(%，n=6，±s)

表1 顱腦損傷2d后各實(shí)驗(yàn)組大鼠腦組織含水量(%，n=6，±s)

與假手術(shù)組比較:●P＜0.05;與單純創(chuàng)傷組比較:▲P＞0.05，■P＜0.05

實(shí)驗(yàn)分組 損傷側(cè)(左側(cè))含水量假手術(shù)組76.83±0.51單純創(chuàng)傷組 82.81±0.86●傷前6h給藥組 79.10±0.67●■創(chuàng)傷即刻給藥組 79.19±0.70●■傷后6h給藥組 81.80±0.96●▲

3 顱腦損傷2d后，各損傷組單位質(zhì)量腦組織EB含量明顯(P＜0.05)增加。與假手術(shù)組相比，單純創(chuàng)傷組、創(chuàng)傷即刻給藥組和傷后6h給藥組增幅較大，分別為288.83%和243.63%和272.34%;傷前6h給藥組增幅最小，為104.91%(見圖1)。

圖1 顱腦損傷2d后各組大鼠單位質(zhì)量腦組織EB含量(μg)

4 顱腦創(chuàng)傷2d后，傷前6h給藥組和創(chuàng)傷即刻給藥組的星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元水腫的范圍和程度明顯低于傷后6h給藥組。假手術(shù)組未見水腫跡象，單純創(chuàng)傷組水腫程度和范圍最嚴(yán)重(圖2)。

圖2 A～C為單純創(chuàng)傷組TBI2d后，損傷中心腦組織HE染色，D為空白對(duì)照組相同位置HE染色。A.星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞水腫明顯，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核染色變淡，損傷周圍皮質(zhì)可見血細(xì)胞;B.損傷中心可見到明顯的膠質(zhì)細(xì)胞增生，神經(jīng)元數(shù)目減少;C.神經(jīng)元變性、萎縮，細(xì)胞間隙增寬，微血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹;D.未見明顯細(xì)胞水腫和變性

5 顱腦損傷后2d，單純創(chuàng)傷組較假手術(shù)組的AQP4蛋白平均陽(yáng)性細(xì)胞面積明顯升高(P＜0.05)，傷前6h給藥組、創(chuàng)傷即刻給藥組和傷后6h給藥組較假手術(shù)組的AQP4蛋白平均陽(yáng)性細(xì)胞面積明顯下降，降幅分別為78.63%，81.91%和73.37%(P＜0.05)(見圖3);顱腦損傷后2d，單純創(chuàng)傷組較假手術(shù)組的AQP4mRNA平均陽(yáng)性細(xì)胞面積顯著升高(P＜0.05)，傷前6h給藥組、創(chuàng)傷即刻給藥組和傷后6h給藥組較假手術(shù)組降幅分別為82.93%，78.46%和65.09%(P＜0.05)(見圖4)。

圖3 顱腦損傷后2d，各組大鼠腦內(nèi)AQP4免疫熒光組織化學(xué)染色(×400)。A.假手術(shù)組;B.單純創(chuàng)傷組;C.傷前6h給藥組;D.創(chuàng)傷即刻給藥組;E.傷后6h給藥組?？梢夿組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量和熒光強(qiáng)度較其他4組明顯升高。C、D和E組陽(yáng)性細(xì)胞較A組明顯減少，說明藥物在2d后，仍有較高水平的沉默效率，其中，C、D和E組的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量無明顯差異

圖4 顱腦損傷后2d，AQP4mRNA平均陽(yáng)性細(xì)胞面積(μm2)

6 顱腦損傷后2d，各損傷組腦內(nèi)MMP9含量均明顯(P＜0.05)升高。單純創(chuàng)傷組、創(chuàng)傷即刻給藥組和傷后6h給藥組增幅最大，分別為371.10%，306.58%和347.12%(P＜0.01);傷前6h給藥組增幅最小，為136.71%(P＜0.05)(見圖5和表2)。

圖5 顱腦損傷后2d，各組大鼠腦內(nèi)MMP9免疫組織化學(xué)染色(×400)。陽(yáng)性細(xì)胞內(nèi)的陽(yáng)性表達(dá)境界清楚，呈棕黃色或棕褐色顆粒，主要位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，有的細(xì)胞突起內(nèi)也有表達(dá)。A.假手術(shù)組;B.單純創(chuàng)傷組;C.傷前給藥組;D.創(chuàng)傷即刻給藥組;E.傷后給藥組

表2 各組大鼠腦內(nèi)MMP9平均陽(yáng)性細(xì)胞面積(μm2，n=6，±s)

表2 各組大鼠腦內(nèi)MMP9平均陽(yáng)性細(xì)胞面積(μm2，n=6，±s)

與假手術(shù)組比較:▲P＜0.05，■P＜0.05;與單純創(chuàng)傷組比較:▲P＜0.05

實(shí)驗(yàn)分組 MMP9平均陽(yáng)性細(xì)胞面積假手術(shù)組7.30±0.27單純創(chuàng)傷組 34.39±3.71■傷前6h給藥組 17.28±4.05▲創(chuàng)傷即刻給藥組 29.68±4.87■傷后6h給藥組 32.64±5.50■

7 顱腦損傷2d后，各損傷組腦組織中ZO-1蛋白的含量均明顯下降(P＜0.05)。單純創(chuàng)傷組、創(chuàng)傷即刻給藥組和傷后6h給藥組降幅較大，分別為55.51%，47.59%和52.29%;傷前6h給藥組降幅較小，為23.07%(P＜0.05)。傷前6h給藥組較其他創(chuàng)傷組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(見圖6和表3)。

圖6 顱腦損傷后2d，各組大鼠腦內(nèi)ZO-1免疫組織化學(xué)染色，條索狀褐色影為陽(yáng)性表達(dá)。A.假手術(shù)組;B.單純創(chuàng)傷組;C.傷前6h給藥組;D.創(chuàng)傷即刻給藥組;E.傷后6h給藥組

表3 各組大鼠腦內(nèi)ZO-1平均陽(yáng)性面積(μm2，n=6，±s)

表3 各組大鼠腦內(nèi)ZO-1平均陽(yáng)性面積(μm2，n=6，±s)

與假手術(shù)組比較:▲P＜0.05，■P＜0.05;與傷前6h給藥組比較:▲P＜0.05

實(shí)驗(yàn)分組 ZO-1平均陽(yáng)性表達(dá)面積假手術(shù)組24.23±3.72單純創(chuàng)傷組 10.78±4.63▲傷前6h給藥組 18.64±5.18■創(chuàng)傷即刻給藥組 12.70±4.91▲傷后6h給藥組 11.56±4.88▲

討 論

1 AQP4與早期腦水腫

AQP4蛋白是膠質(zhì)細(xì)胞、腦脊液以及血管之間相互調(diào)節(jié)和運(yùn)輸水分的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［5］，而且，水通道蛋白可以使水分子順滲透壓梯度雙向轉(zhuǎn)運(yùn)［6］。Klatzo［7］將腦水腫分為血管源性腦水腫和細(xì)胞毒性腦水腫兩類。研究證實(shí)，腦損傷后大量水分通過AQP4進(jìn)入腦內(nèi)，導(dǎo)致了細(xì)胞毒性腦水腫的形成;AQP4同時(shí)能夠促進(jìn)血管源性腦水腫時(shí)過多水的再吸收，易于腦內(nèi)多余水分清除，從而減輕血管源性腦水腫［8－9］，可見同為腦水腫，由于形成機(jī)制的不同，AQP4所起的作用相反。

研究發(fā)現(xiàn)，大鼠外傷后1、4h腦內(nèi)AQP4表達(dá)無變化［10］，至外傷后6h，AQP4的含量有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義增加［11］。局灶性腦挫裂傷后1～2d，為損傷側(cè)腦組織含水量的高峰期［12］。實(shí)驗(yàn)證明，利用化學(xué)合成法合成的AQP4小干擾RNA可以在腦室給藥6h內(nèi)顯著降低腦內(nèi)AQP4蛋白和mRNA的含量。本實(shí)驗(yàn)于傷前6h、傷后0h、6h給予AQP4siRNA，分別可以自傷后0h、6h、12h起有效沉默AQP4表達(dá)，并可以觀察不同處理組間對(duì)創(chuàng)傷性腦水腫的影響。

傷前6h給藥時(shí)，觀測(cè)發(fā)現(xiàn)腦組織含水量和BBB通透性較單純創(chuàng)傷組均顯著降低，說明這一時(shí)期以細(xì)胞毒性腦水腫為主。本實(shí)驗(yàn)中，創(chuàng)傷即刻給藥組在傷后6h內(nèi)抑制AQP4蛋白，傷后2d腦組織含水量明顯改善，但是BBB通透性未見明顯改善，說明血管內(nèi)皮存在損傷，血管源性腦水腫仍然存在。本實(shí)驗(yàn)傷后6h給藥組中，在傷后12h充分抑制AQP4蛋白，傷后2d腦組織含水量和BBB通透性均顯著升高，較單純創(chuàng)傷組未見明顯差異。說明創(chuàng)傷發(fā)生12h以后抑制AQP4蛋白，無法有效改善腦組織含水量，這一時(shí)期以血管源性腦水腫為主。

2 AQP4與ZO-1、MMP9

在病理情況下，BBB連接復(fù)合體結(jié)構(gòu)的破壞和功能改變，引起B(yǎng)BB調(diào)控失代償，并最終導(dǎo)致腦損傷。ZO-1是緊密連接蛋白的重要構(gòu)成部分，其表達(dá)水平的下降可以作為BBB破壞的標(biāo)志［13］。AQP4和MMP9是腦水腫和BBB機(jī)能障礙病理機(jī)制必不可少的組成部分［14］。本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)傷即刻給藥組、傷后6h給藥組和單純創(chuàng)傷組較傷前6h給藥組的MMP9含量均明顯升高，而ZO-1含量均明顯降低。前三組間MMP9和ZO－1含量無明顯差異。說明抑制AQP4無法影響MMP9和ZO-1含量，AQP4與后兩種蛋白無直接關(guān)聯(lián)。

總之，目前創(chuàng)傷性腦水腫早期的治療仍然很大程度上依靠滲透性藥物和外科手術(shù)治療，以相關(guān)蛋白為靶點(diǎn)的藥物治療常常被人們忽視。頭部撞擊傷后，對(duì)于AQP4蛋白進(jìn)行激活還是抑制取決于腦水腫的形成和清除機(jī)制，也就是該腦水腫是血管源性腦水腫還是細(xì)胞毒性腦水腫占主導(dǎo)地位。本實(shí)驗(yàn)通過不同時(shí)期抑制AQP4蛋白，發(fā)現(xiàn)局灶性腦挫裂傷后0～6h沉默AQP4蛋白表達(dá)，能夠有效抑制傷后早期腦組織含水量，但是無法有效降低BBB的通透性，此時(shí)期以細(xì)胞毒性腦水腫為主導(dǎo);傷后7～12h沉默AQP4蛋白，無法有效抑制早期腦水腫和降低BBB的通透性，說明此時(shí)期以血管源性腦水腫為主導(dǎo)。

顱腦創(chuàng)傷前抑制AQP4蛋白，可明顯抑制早期腦水腫。傷后初期(6h內(nèi))抑制AQP4蛋白，可明顯抑制傷后腦水腫，但無法改善傷后BBB通透性。傷后6～12h抑制AQP4蛋白無法抑制腦水腫和改善BBB的通透性。

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