苦丁茶總黃酮純化工藝及其黃嘌呤氧化酶抑制活性研究

譚頌嚴(yán)，楊志偉

（廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西 南寧 530004）

苦丁茶（Ilex Kudingcha C.J.Tseng）是冬青科冬青屬苦丁茶種常綠喬木，主要分布于我國華南、西南地區(qū)?？喽〔枋且环N傳統(tǒng)藥用植物，具有清熱解暑、活血化瘀、清肝明目等功效[1]。現(xiàn)代科學(xué)研究的結(jié)果表明，苦丁茶中含有多酚類、黃酮類、三萜類、揮發(fā)油、多糖類等多種化合物[2]。其中黃酮類化合物苦丁茶中含量較高，是苦丁茶的主要生物活性成分之一，在大多數(shù)苦丁茶中發(fā)現(xiàn)存在槲皮素、蘆丁、楊梅酮等多種黃酮化合物[3]。據(jù)報(bào)道，黃酮類化合物在抗腫瘤[4]、抑菌[5]、抗氧化[6]、降尿酸[7]等方面具有生物活性。黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）是人體嘌呤代謝過程中的關(guān)鍵酶，主要功能為將次黃嘌呤催化氧化為黃嘌呤，再進(jìn)一步氧化生成尿酸[8]。人體主要通過兩大途徑獲取尿酸：一是通過食物攝入尿酸；二是由XOD催化次黃嘌呤、黃嘌呤等底物生成尿酸。人體體液中尿酸含量過高可能導(dǎo)致高尿酸血癥和痛風(fēng)，在臨床治療方面，抑制XOD活性是治療高尿酸血癥和痛風(fēng)的良好靶點(diǎn)，其原理為利用黃嘌呤氧化酶抑制劑可逆或不可逆地抑制XOD的活性，減少尿酸的生成進(jìn)而達(dá)到治療高尿酸血癥和痛風(fēng)的目的[9]。目前臨床常見的黃嘌呤氧化酶抑制劑類降尿酸藥物包括別嘌醇、非布司他、托匹司他等，但具有不同程度、類型的毒副作用[10]，因此有必要尋找更高效、低毒副作用的黃嘌呤氧化酶抑制劑。

近年來，大量研究表明，多種黃酮類化合物具有抑制XOD活性、降低人體血尿酸含量的作用。郝悅等[11]以黃嘌呤氧化酶抑制活性為指標(biāo)，研究30種黃酮的降尿酸活性，其中木犀草素、槲皮素、芹菜素、山柰酚可明顯抑制黃嘌呤氧化酶的活性，IC50分別為42.02、120.22、135.98、184.36 μmol/L；李佳川等[12]利用分子對(duì)接技術(shù)，將藤茶總黃酮中的主要活性成分與XOD進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果表明藤茶總黃酮主要活性成分中的二氫楊梅素、楊梅素、槲皮素和藤茶素對(duì)接得分較高，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示藤茶總黃酮能顯著降低高尿酸血癥模型小鼠血清中的XOD的活性和尿酸、肌酐、尿素氮的含量；Zhang等[13]利用分子對(duì)接證實(shí)槲皮素與XOD的結(jié)合位點(diǎn)在XOD的黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD）結(jié)構(gòu)域的異丙嗪環(huán)上，使XOD的構(gòu)象發(fā)生變化，進(jìn)而影響酶的催化功能。

本試驗(yàn)對(duì)大孔樹脂吸附苦丁茶總黃酮的純化工藝進(jìn)行研究，并采用紫外分光光度法檢測(cè)純化前后樣品的XOD體外抑制活性，探究苦丁茶總黃酮抑制XOD的活性能力，為進(jìn)一步開發(fā)苦丁茶中的黃酮類化合物，解析苦丁茶總黃酮抑制XOD活性的機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

苦丁茶：市售；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）、黃嘌呤（純度≥98%）、黃嘌呤氧化酶（10.9 U/mL）：北京索萊寶科技有限公司；別嘌醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、無水乙醇、濃鹽酸、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、二甲基亞砜（均為分析純）：上海源葉生物科技有限公司；D101型大孔樹脂：江蘇常州市長豐化工有限公司；96孔酶標(biāo)板：無錫耐思生命科技股份有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

KQ-600DA型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；722N可見分光光度計(jì)：上海儀器分析器有限公司；AL204分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；PHSJ-4F型pH計(jì)：上海雷磁儀器有限公司；Max Plus 384酶標(biāo)儀：美國Moleaular Devices公司；RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；SCIENTZ-10N型冷凍干燥機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；DHG-9240A恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SHA-B恒溫水浴振蕩器：常州金壇良友儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 苦丁茶中黃酮的提取

苦丁茶粉碎后過80目篩，低溫烘干；精密稱取一定量烘干后的苦丁茶粉進(jìn)行超聲波輔助提取，條件為超聲功率600 W、料液比1∶50（g/mL）、乙醇濃度50%、時(shí)間40 min、溫度60℃。提取結(jié)束后，過濾，取濾液在50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮干乙醇，于冷凍干燥機(jī)中凍干得到苦丁茶粗提物。

1.3.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制參考萬聆[14]的方法，并稍加修改。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品試驗(yàn)前于105℃烘箱中干燥至恒重，精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用70%乙醇定容于10 mL容量瓶中，得到1.0 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于 6 支 10 mL 具刻度試管中，加入3 mL 70%乙醇，加入1 mL 5%的NaNO2溶液，搖勻，避光靜置6 min后加入1 mL 10%的Al（NO3）3溶液，搖勻，避光靜置6 min后加入4 mL 4%NaOH溶液，用70%乙醇定容至10 mL，搖勻，即得到濃度分別為 0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，避光靜置15 min后在510 nm處測(cè)定吸光度。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以各濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=10.691 9x+0.001 2（R2=0.999 5）。

1.3.3 樣品中黃酮純度的測(cè)定

稱取10 mg凍干制備的樣品，用70%乙醇定容于10 mL容量瓶中，得到樣品溶液，取1 mL樣品溶液于10 mL容量瓶中，按1.3.2中的方法處理后于510 nm處檢測(cè)吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品溶液中的總黃酮濃度，再計(jì)算得到樣品中總黃酮的純度。計(jì)算公式如下[15]。

式中：C為溶液中總黃酮濃度，mg/mL；V為所取樣品溶液的體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量，mg。

1.3.4 大孔樹脂的預(yù)處理

D101大孔樹脂經(jīng)3倍體積的95%乙醇浸泡溶脹24 h，再用95%乙醇沖洗抽濾，至濾液中加入蒸餾水不產(chǎn)生渾濁為止，用蒸餾水沖洗至無醇味備用，預(yù)處理后的大孔樹脂儲(chǔ)存在95%乙醇溶液中，使用前用蒸餾水沖洗至無醇味即可[16]。

1.3.5 大孔樹脂靜態(tài)吸附曲線和靜態(tài)解吸曲線的繪制

稱取2 g預(yù)處理后的大孔樹脂于具塞錐形瓶中，加入50 mL一定濃度的苦丁茶粗提物溶液，置于轉(zhuǎn)速120 r/min的恒溫水浴振蕩器中，每隔一段時(shí)間取1 mL苦丁茶粗提物溶液，測(cè)定其總黃酮濃度，直到錐形瓶中溶液的黃酮濃度趨于穩(wěn)定。根據(jù)測(cè)得的數(shù)據(jù)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以吸附率為縱坐標(biāo)，繪制靜態(tài)吸附曲線。

將上述吸附飽和的大孔樹脂水洗、晾干，置于具塞錐形瓶中，加入50 mL70%乙醇，置于轉(zhuǎn)速120 r/min的恒溫水浴振蕩器中，每隔一段時(shí)間取1 mL乙醇溶液測(cè)定其總黃酮濃度，至剩余溶液中的總黃酮濃度趨于穩(wěn)定。根據(jù)測(cè)得的數(shù)據(jù)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以解吸率為縱坐標(biāo)，繪制靜態(tài)解吸曲線。公式如下[17]。

式中：C0為吸附前上樣液初始總黃酮濃度，mg/mL；C1為吸附后上樣液總黃酮濃度，mg/mL；C2為解吸后樣液總黃酮濃度，mg/mL；V0為吸附前上樣液體積，mL；V1為吸附后上樣液體積，mL；V2為解吸液體積，mL。

1.3.6 大孔樹脂純化工藝參數(shù)的確定

1.3.6.1 上樣液pH值對(duì)大孔樹脂吸附率的影響

稱取2 g預(yù)處理后的大孔樹脂若干份于具塞錐形瓶中，分別加入pH值為1、2、3、4、5的一定濃度的上樣液50 mL，在恒溫水浴振蕩器中以轉(zhuǎn)速120 r/min振蕩24 h，到達(dá)吸附飽和，計(jì)算吸附率。每個(gè)pH值梯度重復(fù)3次平行試驗(yàn)。

1.3.6.2 洗脫液濃度對(duì)解吸率的影響

稱取吸附飽和的2 g大孔樹脂若干份于具塞錐形瓶中，分別加入濃度為50%、60%、70%、80%、90%乙醇洗脫液，在恒溫水浴振蕩器中以轉(zhuǎn)速120 r/min振蕩24 h進(jìn)行解吸，計(jì)算解吸率。每個(gè)乙醇濃度梯度重復(fù)3次平行試驗(yàn)。

1.3.6.3 上樣濃度對(duì)大孔樹脂吸附率的影響

取預(yù)處理后大孔樹脂濕法裝入具閥色譜柱（2 cm×30cm）中，分別用質(zhì)量濃度為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 mg/mL的上樣液經(jīng)過層析柱，流速為2.0 mL/min，pH值為3，計(jì)算吸附率。

1.3.6.4 上樣流速對(duì)大孔樹脂吸附率的影響

取預(yù)處理后大孔樹脂濕法裝入具閥色譜柱（2 cm×30 cm）中，分別以流速 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL/min 使上樣液經(jīng)過層析柱，上樣液質(zhì)量濃度為3.0 mg/mL，pH值為3，計(jì)算吸附率。

1.3.6.5 洗脫液流速對(duì)解吸率的影響

取吸附飽和的大孔樹脂濕法裝柱，70%乙醇溶液分別以流速 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL/min 經(jīng)過層析柱，至流出的洗脫液無色為止，收集洗脫液，計(jì)算解吸率。

1.3.6.6 大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附曲線的繪制

稱取預(yù)處理后的D101樹脂5 g，濕法裝柱，將苦丁茶粗提物配制為質(zhì)量濃度3.0 mg/mL上樣液，以流速2.0 mL/min流過層析柱，每5 mL收集1管流出液，測(cè)定其總黃酮濃度，共收集16管。以管數(shù)為橫坐標(biāo)，總黃酮濃度為縱坐標(biāo)繪制大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附曲線。當(dāng)流出液中總黃酮濃度為上樣液初始濃度的10%時(shí)，達(dá)到大孔樹脂的泄漏點(diǎn)[18]，此時(shí)的上樣體積為最佳上樣體積。

1.3.6.7 大孔樹脂動(dòng)態(tài)洗脫曲線的繪制

上樣結(jié)束后，先用80 mL蒸餾水水洗雜質(zhì)，再用70%乙醇，以流速2.0 mL/min進(jìn)行洗脫，每5 mL收集1管洗脫液，測(cè)定其總黃酮濃度，共收集16管。以管數(shù)為橫坐標(biāo)，總黃酮濃度為縱坐標(biāo)，繪制動(dòng)態(tài)洗脫曲線，確定最佳洗脫液體積。

1.3.7 苦丁茶黃酮純度的測(cè)定

在最佳工藝條件下，對(duì)苦丁茶粗提物進(jìn)行純化，收集乙醇溶液洗脫后的洗脫液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中旋蒸至無醇味，再經(jīng)過冷凍干燥得到粉末狀物質(zhì)。根據(jù)1.3.3公式計(jì)算純化前后樣品的純度。

1.3.8 XOD體外活性抑制試驗(yàn)

1.3.8.1 溶液和供試品配制

供試品和溶液配制的方法參照Nguyen等[19]的方法，并稍作修改。磷酸緩沖溶液（phosphate buffer solution，PBS）：稱取 71.6 g Na2HPO4·12H2O，蒸餾水定容至1 000 mL，得到 A 液；稱取 31.2 g NaH2PO4·2H2O，蒸餾水定容至1 000 mL，得到B液。量取A液81 mL，B液19 mL，混合搖勻，即得到0.2 mol/L、pH 7.4的 PBS。黃嘌呤（xanthine，XA）底物溶液：精密稱取黃嘌呤 6.1 mg，用1 mL1 mol/L氫氧化鈉溶液助溶，以PBS定容至100mL，得到0.4 mmol/L黃嘌呤溶液。XOD溶液：取XOD（10.9 U/mL）用PBS稀釋為0.05 U/mL工作液。XA和XOD溶液均應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用。

苦丁茶粗提物和純化后的總黃酮溶液：稱取適量苦丁茶粗提物和純化后的總黃酮樣品，用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解配制成100 mg/mL的儲(chǔ)備液，試驗(yàn)時(shí)用PBS將儲(chǔ)備液稀釋為不同濃度的供試品溶液，苦丁茶粗提物溶液在反應(yīng)體系中的終濃度分別為 125、150、175、200、225、250、275 μg/mL，純化后的總黃酮溶液的終濃度分別為 75、100、125、150、175、200、225 μg/mL，反應(yīng)體系中 DMSO 含量＜5%（體積比）。

別嘌醇溶液：精密稱取別嘌醇10 mg，用PBS于100 mL容量瓶中定容，得到0.1 mg/mL別嘌醇溶液，使用時(shí)用PBS稀釋為所需濃度，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.8.2 黃嘌呤氧化酶體外活性抑制試驗(yàn)

黃嘌呤氧化酶體外活性檢測(cè)方法參考燕曉婷等[20]、Zhang等[21]的方法，并加以修改。方法為試驗(yàn)在96孔酶標(biāo)板中進(jìn)行，向酶標(biāo)板中加入50 μL供試品和別嘌醇溶液，分別為試驗(yàn)組和對(duì)照組；加入50 μL PBS，為空白組。分別向各組加入50 μL XOD溶液，在酶標(biāo)儀中于37℃恒溫孵育3 min，分別向各組加入100 μL XA溶液，啟動(dòng)反應(yīng)，體系總體積為200 μL。在波長290 nm處測(cè)定吸光度A，每10 s讀取一次，記錄3 min內(nèi)吸光度的變化，每個(gè)濃度平行測(cè)定3次，計(jì)算XOD抑制率，公式如下。

式中：dA為反應(yīng)起始和反應(yīng)終止時(shí)的吸光度的差值；dt為反應(yīng)時(shí)間。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均平行3次，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行分析并計(jì)算不同樣品對(duì)XOD 的 IC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹脂靜態(tài)吸附曲線和靜態(tài)解吸曲線

2.1.1 大孔樹脂靜態(tài)吸附曲線

大孔樹脂靜態(tài)吸附曲線見圖1。

圖1 大孔樹脂靜態(tài)吸附曲線Fig.1 Static adsorption curve of macroporous resin

由圖1可知，在0.5 h～9.0 h內(nèi)，大孔樹脂對(duì)黃酮的吸附率隨著吸附時(shí)間的延長而增長。吸附3 h時(shí)，吸附率達(dá)到（75.08±0.37）%，為飽和吸附率的91.31%，說明D101大孔樹脂對(duì)苦丁茶總黃酮的吸附為快速平衡型，對(duì)苦丁茶總黃酮具有良好的吸附效果。吸附5 h后，靜態(tài)吸附曲線隨時(shí)間延長趨于平緩，此時(shí)大孔樹脂基本吸附飽和，達(dá)到吸附平衡的狀態(tài)?？紤]時(shí)間成本問題，最佳靜態(tài)吸附時(shí)間為3 h。

2.1.2 大孔樹脂靜態(tài)解吸曲線

大孔樹脂靜態(tài)解吸曲線見圖2。

圖2 大孔樹脂靜態(tài)解吸曲線Fig.2 Static desorption curve of macroporous resin

由圖2可知，大孔樹脂在2 h內(nèi)迅速解吸。解吸2 h時(shí)，解吸率為（89.78±0.38）%，達(dá)到最大解吸率的93.91%。解吸2 h后，隨著解吸時(shí)間延長，大孔樹脂靜態(tài)解吸曲線趨于平緩。說明以70%乙醇為洗脫液時(shí)，D101大孔樹脂對(duì)苦丁茶黃酮具有快速解吸作用，為節(jié)約時(shí)間成本，取2 h為最佳靜態(tài)解吸時(shí)間。

2.2 大孔樹脂純化工藝參數(shù)

2.2.1 上樣液pH值對(duì)吸附率的影響

上樣液pH值對(duì)吸附率的影響見圖3。

圖3 上樣pH值對(duì)吸附率的影響Fig.3 Effect of loading pH on adsorption rate

由圖3可知，當(dāng)上樣液pH值為3時(shí)吸附率達(dá)到最高，這是因?yàn)楫?dāng)pH值過低時(shí)，大量氫離子與溶液中的黃酮類化合物爭奪大孔樹脂上的吸附活性位點(diǎn)，導(dǎo)致吸附率降低；當(dāng)pH值過高，黃酮類化合物游離出陰離子，與樹脂的氫鍵作用減弱[22]，均會(huì)降低大孔樹脂對(duì)黃酮類化合物的吸附率。因此選擇在上樣液pH值為3的條件下進(jìn)行吸附。

2.2.2 洗脫液濃度對(duì)解吸率的影響

洗脫液濃度對(duì)解吸率的影響見圖4。

圖4 洗脫液濃度對(duì)解吸率的影響Fig.4 Effect of eluent solubility on resolution

由圖4可知，當(dāng)乙醇濃度在50%～90%時(shí)，解吸率隨乙醇濃度的升高而升高；乙醇濃度為70%、80%、90%時(shí)，乙醇濃度的升高對(duì)解吸率的影響并不明顯，這可能是因?yàn)樵谝欢舛纫掖嫉臉O性條件下，苦丁茶總黃酮與大孔樹脂結(jié)合的作用位點(diǎn)易被破壞[23]。從節(jié)約成本、減少有機(jī)試劑使用的角度考慮，選擇洗脫液乙醇濃度為70%進(jìn)行解吸。

2.2.3 上樣濃度對(duì)大孔樹脂吸附率的影響

上樣濃度對(duì)大孔樹脂吸附率的影響見圖5。

圖5 上樣濃度對(duì)吸附率的影響Fig.5 Effect of loading concentration on adsorption rate

由圖5可知，隨著上樣濃度的提高，大孔樹脂吸附率呈先上升后下降的趨勢(shì)。濃度為3.0 mg/mL時(shí)吸附率最高。繼續(xù)提高濃度，吸附率逐漸下降。原因可能是上樣濃度提高的同時(shí)，溶液中分子的密集程度增大，更容易與大孔樹脂接觸并被吸附；濃度過高時(shí)，上樣液中的總黃酮經(jīng)過大孔樹脂時(shí)不能充分被吸附，上樣液所含雜質(zhì)的濃度也隨之提高，影響了上樣液黃酮與大孔樹脂充分接觸，導(dǎo)致吸附率逐漸下降[24]。因此確定最佳上樣濃度為3.0 mg/mL。

2.2.4 上樣流速對(duì)大孔樹脂吸附率的影響

上樣流速對(duì)大孔樹脂吸附率的影響見圖6。

圖6 上樣流速對(duì)吸附率的影響Fig.6 Effect of loading flow rate on adsorption rate

由圖6可知，隨著上樣流速的增加，大孔樹脂的吸附率逐漸下降?？赡苁且?yàn)樵诖罂讟渲剿俾视邢薜那闆r下，上樣液流速越快，與大孔樹脂接觸的時(shí)間就越短，吸附率就越低；反之，上樣液流速越慢，上樣液流過大孔樹脂所需時(shí)間越長，就能更充分地與大孔樹脂接觸，吸附率就越高。但上樣液流速過低會(huì)導(dǎo)致耗費(fèi)時(shí)間過長，降低了生產(chǎn)效率，考慮到時(shí)間成本，選擇2.0 mL/min為最佳上樣流速。

2.2.5 洗脫液流速對(duì)解吸率的影響

洗脫液流速對(duì)解吸率的影響見圖7。

圖7 洗脫液流速對(duì)解吸率的影響Fig.7 Effect of eluent solubility on resolution

由圖7可知，解吸率隨洗脫液流速的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)。這可能是因?yàn)楫?dāng)流速太慢，吸附在大孔樹脂內(nèi)部的黃酮類物質(zhì)無法被充分洗脫下來；當(dāng)流速太高，則導(dǎo)致吸附的黃酮未能充分地溶解在乙醇中被洗脫下來，因此影響了解吸率，綜合考慮時(shí)間和解吸率的因素，選擇2.0 mL/min為最佳洗脫液流速進(jìn)行解吸。

2.2.6 動(dòng)態(tài)吸附曲線

動(dòng)態(tài)吸附曲線見圖8。

圖8 大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附曲線Fig.8 Dynamic adsorption curve of macroporous resin

由圖8可知，隨著上樣量的增加，流出液中的黃酮濃度也隨之提高，上樣體積由0～50 mL時(shí)，流出液中的黃酮濃度緩慢增加；上樣體積超過50 mL時(shí)，流出液的黃酮濃度開始迅速提高；上樣體積為55 mL時(shí)，流出液黃酮濃度為（0.28±0.01）mg/mL，接近上樣液濃度（3 mg/mL）的10%，認(rèn)為55 mL是動(dòng)態(tài)吸附的泄漏點(diǎn)，當(dāng)上樣體積高于55 mL時(shí)吸附的黃酮大量泄漏，損失較大，因此選擇上樣體積為55 mL。

2.2.7 動(dòng)態(tài)解吸曲線

動(dòng)態(tài)解吸曲線見圖9。

圖9 大孔樹脂動(dòng)態(tài)解吸曲線Fig.9 Dynamic desorption curve macroporous resin

由圖9可知，70%乙醇洗脫液以流速2.0 mL/min通過吸附飽和的大孔樹脂，可以迅速將大孔樹脂中吸附的黃酮洗脫下來，在70%乙醇洗脫液通過10 mL時(shí)達(dá)到高峰，通過40 mL后大孔樹脂中吸附的黃酮基本被洗脫下來，洗脫曲線出峰快，洗脫峰集中，無明顯的拖尾現(xiàn)象，因此認(rèn)為40 mL為最佳的洗脫液體積。

2.3 苦丁茶總黃酮純度的測(cè)定

苦丁茶總黃酮粗提物中，總黃酮純度為（75.53±0.86）%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為1.135%；苦丁茶粗提物經(jīng)上述最佳純化工藝純化后，凍干所得的樣品中，總黃酮純度為（94.40±1.46）%，RSD為1.548%。經(jīng)純化后，樣品總黃酮的純度明顯提高。

2.4 苦丁茶粗提物和純化后總黃酮樣品的XOD體外抑制活性

2.4.1 樣品對(duì)XOD的體外抑制活性

測(cè)定不同濃度苦丁茶粗提物和純化后總黃酮樣品對(duì)XOD的抑制率，繪制濃度-抑制率曲線，見圖10。

圖10 苦丁茶粗提物和純化后總黃酮對(duì)XOD的濃度-抑制率曲線Fig.10 The concentration-inhibitory rate curve of crude extract of Kudingcha and purified total flavonoids sample

由圖10可知，苦丁茶粗提物和純化后的總黃酮樣品對(duì)XOD具有體外抑制活性，抑制率隨樣品濃度升高而升高。李美娟[25]對(duì)苦丁茶化學(xué)成分和XOD抑制活性進(jìn)行研究，結(jié)果顯示苦丁茶乙醇提取物經(jīng)乙酸乙酯萃取后，萃取部分中含有多種黃酮類化合物，其XOD抑制活性隨樣品濃度升高而升高，本試驗(yàn)結(jié)果與該研究結(jié)果相似。

2.4.2 粗提物和純化后的總黃酮樣品的IC50

采用GraphPad Prism 7.0軟件，計(jì)算粗提物和純化后的總黃酮樣品以及別嘌醇（陽性對(duì)照）的IC50。結(jié)果見表1。

表1 粗提物和純化后的總黃酮樣品及別嘌醇的IC50Table 1 IC50 value of crude extract，purified total flavonoids sample and allopurinol for the XOD inhibition

由表1可知，苦丁茶粗提物對(duì)XOD的IC50為（228.22±1.07）μg/mL，純化后的總黃酮樣品為（135.74±1.02）μg/mL。純化后的總黃酮樣品黃酮純度提高，具有更強(qiáng)的XOD體外抑制活性。郝悅等[11]篩選30種黃酮類化合物（純度>98%），從中得到XOD抑制活性最強(qiáng)的木犀草素、槲皮素、芹菜素、山柰酚，IC50分別為12.03、36.94、36.75、52.77 μg/mL，說明不同黃酮類化合物的XOD抑制活性存在差異。本試驗(yàn)純化后總黃酮樣品可能為多種黃酮類化合物的混合物，混合物中黃酮類化合物的種類和含量決定了混合物XOD抑制活性的強(qiáng)弱。因此，對(duì)純化后總黃酮樣品進(jìn)一步純化分離后，可能得到具有更強(qiáng)XOD抑制活性的黃酮類化合物。

3 結(jié)論

本研究使用超聲波輔助乙醇提取法提取苦丁茶中的黃酮類化合物，采用D101大孔樹脂對(duì)粗提物總黃酮進(jìn)行分離純化，探究最佳的純化工藝條件，得到的最佳純化工藝條件：上樣液pH值為3，洗脫液乙醇濃度70%，上樣液濃度3.0 mg/mL，上樣液流速2.0 mL/min，洗脫液流速2.0mL/min，上樣量55mL，洗脫液體積40mL。在最佳純化工藝條件下，苦丁茶乙醇提取物中的總黃酮純度由（75.53±0.86）%提高至（94.40±1.46）%，可見D101大孔樹脂能有效地分離純化苦丁茶總黃酮。

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可知，苦丁茶粗提物和純化后總黃酮樣品對(duì)XOD具有體外抑制活性，其抑制活性隨著樣品中總黃酮純度的升高而升高。其抑制活性的強(qiáng)弱關(guān)系為別嘌醇>純化后總黃酮樣品>苦丁茶粗提物。后續(xù)可進(jìn)一步分離鑒定具有XOD抑制活性的苦丁茶黃酮組分，探明苦丁茶黃酮抑制XOD活性的機(jī)理。