側(cè)柏葉黃酮的大孔樹脂純化工藝研究

肖 凡

（同方藥業(yè)集團(tuán)有限公司，北京 102100）

側(cè)柏葉是柏科植物側(cè)柏Platycladus orientalis（L.）的干燥嫩枝和葉，具有涼血止血，化痰止咳的功效，富含多種活性成分，其中黃酮化合物含量較為豐富，是其主要功能成分之一[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，該黃酮化合物具有抗菌、抗氧化、抗運(yùn)動疲勞和提高機(jī)體免疫力等效果，因此，相關(guān)研究多集中對其提取工藝的研究和藥理作用的探討[2]，但無論采取溶劑或超聲波輔助提取，其產(chǎn)物中雜質(zhì)仍較多，而目前鮮有涉及側(cè)柏葉黃酮的純化研究報(bào)道。由于大孔樹脂吸附分離具有選擇性高、干擾因素少、且能重復(fù)循環(huán)利用等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于天然產(chǎn)物的純化[3]，因此，本研究利用大孔樹脂純化側(cè)柏葉黃酮粗提物，通過靜態(tài)和動態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)，討論不同工藝條件對側(cè)柏葉黃酮的吸附與解吸性能影響，從而為側(cè)柏葉黃酮的富集利用提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

側(cè)柏葉，經(jīng)鑒定為柏科植物側(cè)柏的干燥葉片，購于南京益豐大藥房；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（92.4%中國食品藥品檢定研究院）；AB-8、H103型大孔樹脂（天津歐瑞生物科技有限公司）；HPD 400型大孔樹脂（天津浩聚科技有限公司）；DM 301、HPD 600型大孔樹脂（北京索萊寶科技有限公司）；其他試劑均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

玻璃層析柱（Ф16mm×50mm，新輝層析設(shè)備有限公司）；5800H型紫外-可見分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；FA1004型電子天平（紹興市景邁儀器設(shè)備有限公司）；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；TG18G-II型臺式高速離心機(jī)（鹽城凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；SHA-C型恒溫振蕩器（常州國華儀器制造有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 側(cè)柏葉黃酮提取 側(cè)柏葉經(jīng)60℃烘箱干燥4h后粉碎，過60目篩，稱取一定重量的側(cè)柏葉干粉，在料液比1∶20（m∶V）下，加入50%乙醇溶液，于60℃、100W超聲波功率下提取51min后過濾，對所得濾渣重復(fù)上述提取步驟，濃縮后減壓干燥即得[4]。

1.2.2 總黃酮含量測定 依照文獻(xiàn)所述方法，配制不同濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，于510nm波長下測定吸光度[5]，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=11.16x-0.011（r=0.9994），表明在0.01～0.10mg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。不同樣品溶液經(jīng)稀釋后于相同波長測定吸光度，根據(jù)下式計(jì)算樣品的黃酮含量（以蘆丁含量計(jì)）。

式中 c：樣品中蘆丁濃度，mg·mL-1；V：樣品溶液體積，mL；n：稀釋倍數(shù)；m：樣品質(zhì)量，mg。

1.2.3 靜態(tài)吸附-解吸試驗(yàn) 分別準(zhǔn)確稱取不同溶液預(yù)處理后的5種型號樹脂2.0g置于錐形瓶后，加入3mg·mL-1黃酮提取液30mL，于室溫下振蕩吸附12h使其充分吸附后過濾，測得濾液中黃酮濃度；另用純水洗去樹脂表面未吸附的雜質(zhì)與溶液后，置于錐形瓶中加入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液100mL，于室溫下振蕩12h，使其充分解吸后，過濾，測得洗脫液中黃酮濃度[6]，根據(jù)下式分別計(jì)算5種型號大孔樹脂對側(cè)柏葉黃酮的吸附率、解吸率與回收率。

式中 c0：樣品溶液中黃酮濃度，mg·mL-1；ce：飽和吸附后濾液中黃酮濃度，mg·mL-1；cd：洗脫液中黃酮濃度，mg·mL-1；V1：樣品溶液體積，mL；V2：洗脫液體積，mL；Qe：吸附率，%；Dd：洗脫率，%；R：回收率，%。

1.2.4 動態(tài)吸附-洗脫條件考察

上樣濃度選擇 將5.0g AB-8樹脂濕法裝柱后，以體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液為溶劑，分別配制1、2、3、4、5mg·mL-1上樣溶液60mL，以2.0mL·min-1流速上樣后，測得流出液中黃酮濃度，考察不同上樣濃度對側(cè)柏葉黃酮吸附率的影響。

上樣液pH值選擇 相同濃度上樣溶液分別調(diào)節(jié)pH值為4、5、6、7、8后于2.0mL·min-1流速上樣至濕法填充樹脂的層析柱內(nèi)，測得流出液中黃酮濃度，考察不同上樣濃度對側(cè)柏葉黃酮吸附率的影響。

上樣流速選擇 相同濃度上樣溶液分別以1.0、2.0、3.0mL·min-1流速上樣至濕法填充樹脂的層析柱內(nèi)，測得流出液中黃酮濃度，考察不同上樣濃度對側(cè)柏葉黃酮吸附率的影響。

洗脫液體積分?jǐn)?shù)選擇 采用上述最佳條件上樣后，用純水沖洗至流出液中基本無黃酮化合物，分別采用50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液，以1.0mL·min-1流速洗脫，測得不同收集管內(nèi)洗脫液中黃酮濃度，考察洗脫液的不同體積分?jǐn)?shù)對側(cè)柏葉黃酮洗脫率的影響。

洗脫流速選擇 采用上述最佳條件上樣后，用純水沖洗至流出液中無黃酮化合物，以70%乙醇溶液分別于1.0、2.0、3.0mL·min-1流速洗脫，測得不同收集管內(nèi)洗脫液中黃酮濃度，考察洗脫液的不同流速對側(cè)柏葉黃酮洗脫率的影響。

泄漏曲線與洗脫曲線繪制 3mg·mL-1不同體積的上樣溶液以2.0mL·min-1流速上樣至濕法填充樹脂的層析柱內(nèi)，測得流出液中黃酮濃度后，繪制吸附曲線，同時吸附飽和后，以70%乙醇溶液于1.0mL·min-1流速洗脫，測得不同體積流出液中黃酮濃度后，繪制洗脫曲線。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有結(jié)果均以3次平行試驗(yàn)結(jié)果的均值與標(biāo)準(zhǔn)差表示，并采用OriginPro 8.5軟件作圖分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 靜態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)結(jié)果

不同型號樹脂在靜態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)的結(jié)果，見表1。

表1 不同型號樹脂對側(cè)柏葉黃酮的靜態(tài)吸附－解吸效果Tab.1 Static adsorption and desorption capacity of different type resins for flavonoid from Platycladus orientalis leaves

由表1可見，不同型號樹脂對側(cè)柏葉黃酮的吸附率依次為H 103＞AB－8＞HPD－400＞DM 301＞HPD 600，這歸因于H 103樹脂的比表面積較大，可提供較多的吸附位點(diǎn)，而洗脫率依次為AB－8＞HPD 600＞DM 301＞HPD－400＞H 103，這源于側(cè)柏葉黃酮類化合物的極性較弱，因此，與具有一定極性樹脂的范德華力和氫鍵作用較低[7]，AB－8樹脂的比表面積適中，且對黃酮類化合物的回收率較高，從而選擇AB－8樹脂純化側(cè)柏葉黃酮化合物。

2.2 上樣濃度對吸附率的影響

圖1為黃酮粗提液濃度對AB－8樹脂吸附效果的影響。

圖1 黃酮粗提液濃度對AB－8樹脂吸附效果的影響Fig.1 Effect of flavonoid crude concentration on adsorption efficiency of AB－8 resin

由圖1可見，隨著上樣濃度增大至3mg·mL－1后，樹脂的吸附率開始下降，這歸因于當(dāng)上樣濃度較低時，樹脂的吸附位點(diǎn)較多，因此，隨著上樣濃度的增大，樹脂的吸附量適當(dāng)增大，但當(dāng)上樣濃度大于3mg·mL－1時，表明樹脂吸附基團(tuán)飽和，這不僅造成側(cè)柏葉黃酮的泄漏，同時增大樣品中雜質(zhì)堵塞樹脂的風(fēng)險[8]，因此，選擇3mg·mL－1黃酮粗提液作為上樣液溶液濃度較宜。

2.3 上樣液pH值對吸附率的影響

圖2為上樣液pH值對AB－8樹脂吸附效果的影響。

圖2 上樣液pH值對AB－8樹脂吸附效果的影響Fig.2 Effect of pH value of loading sample solution on adsorption efficiency of AB－8 resin

由圖2可見，當(dāng)上樣液pH值低于6時，AB－8樹脂對黃酮化合物的吸附率呈升高趨勢，隨后逐漸下降。由于黃酮化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)中存在多羥基酚和糖苷鍵結(jié)構(gòu)呈弱酸性，溶液pH值過低或過高時，黃酮化合物易以離子形式存在，均不利于與樹脂發(fā)生相互作用[9]，當(dāng)上樣液pH值為6時，樹脂對側(cè)柏葉黃酮的吸附率達(dá)到最高，表明其有利于吸附于樹脂內(nèi)，這與魏靜等研究大孔樹脂吸附不同pH值蝴蝶花黃酮溶液的結(jié)果相近[10]，因此，選擇上樣液pH值為6較適宜。

2.4 上樣流速對吸附率的影響

圖3為上樣流速對AB－8樹脂吸附效果的影響。

圖3 上樣流速對AB－8樹脂吸附效果的影響Fig.3 Effect of loading sample velocity on adsorption efficiency of AB－8 resin

由圖3可見，隨著上樣流速的增大，AB－8樹脂對側(cè)柏葉黃酮的吸附率逐漸下降，大孔樹脂對黃酮化合物的吸附分為膜擴(kuò)散與粒擴(kuò)散過程，流速越快導(dǎo)致側(cè)柏葉黃酮與樹脂的接觸時間越短，不利于進(jìn)行吸附過程，便流出柱外[11]。與1.0mL·min－1上樣流速相較，采用2.0mL·min－1的流速上樣時，樹脂對側(cè)柏葉黃酮的吸附率僅下降（3.1±0.1）%，但上樣液體積卻增大2倍，與段宇宙等研究不同上樣流速下樹脂對沉香葉黃酮的變化趨勢較一致[12]，考慮后續(xù)應(yīng)用的生產(chǎn)效率，因此，選擇2.0mL·min-1作為上樣流速較適宜。

2.5 泄漏曲線

圖4為AB-8樹脂對側(cè)柏葉黃酮的動態(tài)吸附曲線。

圖4 上樣液體積對AB-8樹脂吸附效果的影響Fig.4 Effect of loading sample volume on adsorption efficiency of AB-8 resin

由圖4可知，隨著上樣液體積增大，流出液中側(cè)柏葉黃酮的濃度逐漸增大，當(dāng)上樣液體積為60mL時，流出液中黃酮化合物濃度為（0.39±0.08）mg·mL-1，約為上樣濃度的10%，即為曲線的泄漏點(diǎn)，表明該體積下樹脂已開始發(fā)生目標(biāo)化合物的泄漏，繼續(xù)增大體積至140mL時，流出液中的黃酮化合物濃度接近上樣液中側(cè)柏葉黃酮濃度，表明AB-8樹脂達(dá)到飽和吸附，綜合考慮樣品利用率與吸附效率，選擇上樣液體積為60mL。

2.6 洗脫液濃度對洗脫率的影響

圖5為洗脫濃度對AB-8樹脂解吸側(cè)柏葉黃酮的影響。

圖5 洗脫液濃度對AB-8樹脂解吸側(cè)柏葉黃酮的影響Fig.5 Effect of eluent concentration on the desorption of flavonoid from Platycladus orientalis leaves by AB-8 resin

由圖5可見，隨著洗脫液乙醇的體積分?jǐn)?shù)增大，側(cè)柏葉黃酮的洗脫率呈先增大后減小的趨勢，適當(dāng)濃度的乙醇溶液有利于減小樹脂對黃酮化合物的吸附作用力，但濃度過高可能使得吸附的其它雜質(zhì)（如色素、蛋白質(zhì)等）同時被洗脫，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)70%時，洗脫率達(dá)到最大，與吳婕等考察不同濃度的乙醇溶液洗脫甜茶葉黃酮的影響一致[13]，因此，選擇70%乙醇溶液洗脫吸附于樹脂中的側(cè)柏葉黃酮。

2.7 洗脫流速對洗脫率的影響

圖6為洗脫流速對AB-8樹脂解吸側(cè)柏葉黃酮的影響。

圖6 洗脫流速對AB-8樹脂解吸側(cè)柏葉黃酮的影響Fig.6 Effect of elution velocity on desorption of flavonoid from Platycladus orientalis leaves by AB-8 resin

由圖6可知，側(cè)柏葉黃酮的洗脫率隨著洗脫流速加快而逐漸減小，與1.0mL·min-1洗脫流速相較，當(dāng)洗脫流速為2.0mL·min-1時，乙醇對側(cè)柏葉黃酮的洗脫率下降幅度超過10%。這歸因于乙醇流速過快，與吸附在AB-8樹脂內(nèi)的側(cè)柏葉黃酮接觸時間過短，從而不利于解吸，導(dǎo)致吸附的部分側(cè)柏葉黃酮未被洗脫，因此，選擇1.0mL·min-1作為洗脫流速較適宜。

2.8 洗脫曲線

洗脫曲線可反映不同用量洗脫液對側(cè)柏葉黃酮在的解吸效果，圖7為洗脫液體積對AB-8樹脂解吸側(cè)柏葉黃酮的影響。

圖7 洗脫液體積對AB-8樹脂解吸側(cè)柏葉黃酮的影響Fig.7 Effect of eluent volume on desorption of flavonoid from Platycladus orientalis leaves by AB-8 resin

由圖7可見，隨著洗脫液用量增多，收集的側(cè)柏葉黃酮濃度不斷增大，當(dāng)乙醇用量約為60mL時，流出液中側(cè)柏葉黃酮含量達(dá)到最高為（2.2±0.1）mg·mL-1，繼續(xù)增大洗脫液用量后，流出液中黃酮濃度不斷下降，當(dāng)洗脫液體積為140mL時，流出液中黃酮的濃度僅為0.08mg·mL-1，約為最高濃度的1/25，表明吸附的側(cè)柏葉黃酮基本被洗脫完全，因此，選擇最佳洗脫液體積為140mL。

2.9 最佳純化工藝驗(yàn)證

采用AB-8樹脂分離純化側(cè)柏葉黃酮粗提物，配制pH值為6，3mg·mL-1上樣溶液60mL，以2.0mL·min-1流速上樣后，采用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇溶液140mL，以1.0mL·min-1流速洗脫，純化后樣品的黃酮純度由（24.7±0.8）%提高至（68.2±1.1）%，約為純化前2.8倍，李倩曾采用大孔樹脂純化圓柏黃酮，其純度較純化前約提高2.8倍[14]，而馮靖采用大孔樹脂純化銀杏葉黃酮，其純度較純化前約提高3.0倍[15]，表明AB-8型大孔樹脂純化側(cè)柏葉黃酮的最佳工藝除雜純化效果較好。

3 結(jié)論

由于黃酮類化合物具有較好的抗氧化、保鮮等作用，為此本研究利用大孔樹脂純化側(cè)柏葉黃酮化合物。通過靜態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)確定AB-8樹脂分離純化側(cè)柏葉黃酮粗提物，其最佳工藝條件為：pH值為6，3mg·mL-1上樣溶液60mL，以2.0mL·min-1流速上樣后，采用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇溶液140mL，以1.0mL·min-1流速洗脫，純化后樣品的黃酮從（24.7±0.8）%提高至（68.2±1.1）%，表明該純化工藝分離效果可靠，可用于側(cè)柏葉黃酮的富集。