槐花散中側(cè)柏葉的遵古炮制及現(xiàn)代炮制方法比較研究

于浩，包永睿，2，3，王帥，2，3，李天嬌，2，3，孟憲生，2，3*（. 遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧 大連6600；2. 遼寧省中藥多維分析專業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心，遼寧 大連 6600；3. 遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實驗室，遼寧 大連6600）

經(jīng)典名方遵古開發(fā)相關(guān)研究已成為研究熱點，已有較多文獻從本草考證、制劑工藝、專利研究等方面展開相關(guān)研究。但有關(guān)經(jīng)典名方中具體中藥炮制方法的研究鮮有報道。本課題組在“遵從經(jīng)典，符合藥典”的原則下，采用性狀鑒別、浸出物含量、化學成分、指紋圖譜相似度評價等多種分析方法比較經(jīng)典名方槐花散中側(cè)柏葉古法炮制與現(xiàn)代炮制方法的異同點，結(jié)合多波長融合指紋圖譜，從化學成分方面驗證古今炮制方法的異同。

槐花散由炒槐花、焙側(cè)柏葉、荊芥穗、麩炒枳殼組成，具有疏風利氣、清腸涼血的功效，主治腸風臟毒下血、痔瘡出血、脫肛屬風邪熱毒或濕熱等病癥[1]。經(jīng)方組成中側(cè)柏葉起涼血止血之功效，側(cè)柏葉藥材的基原與藥用部位與2020年版《中國藥典》收載品種相同，選用柏科植物側(cè)柏Platycladus orientalis（L.）Franco的干燥枝梢和葉，多在夏、秋二季采收，陰干[2]。側(cè)柏葉最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，微寒，能涼血止血、清熱止咳、祛風利濕、散腫毒、生發(fā)烏發(fā)[3]。焙是古代炮制方法之一，將藥物置于器皿中，用文火經(jīng)較短時間加熱至藥物顏色加深、質(zhì)地酥脆為度。焙制側(cè)柏葉在《圣濟總錄》和《普濟方》中皆有記載[3-4]。本研究還原古籍中記載，以焙制側(cè)柏葉為基準，采用烘制方法，比較烘制側(cè)柏葉與焙制側(cè)柏葉的異同點。

1 材料

1.1 試藥

側(cè)柏葉藥材（上元堂藥房，產(chǎn)地為安徽省，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學許亮教授鑒定為柏科植物側(cè)柏的干燥枝梢和葉）。乙腈、甲酸、甲醇（色譜純，美國TEDIA公司），水為超純水。

1.2 儀器

2 L 陶瓷藥罐（壺福有限公司）；1260 InfinityⅡ型超高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司，包括二元高壓梯度泵、真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱和 OpenLAB CDS色譜工作站）；LY15-101-2電熱恒溫干燥箱（上海龍躍儀器有限公司）；JX-2020小型珠磨儀（上海凈信有限公司）；KQ5200V超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 不同炮制方法樣品性狀鑒別

2.1.1 焙制側(cè)柏葉的制作 取干燥后側(cè)柏葉，除去硬梗及雜質(zhì)，置于陶瓷藥罐內(nèi)，用文火加熱，至罐中側(cè)柏葉顏色變深，質(zhì)地酥脆，有香氣散出。取出，晾干，得側(cè)柏葉焙制樣品（見圖1）[4-6]。

圖1 不同炮制方法的側(cè)柏葉性狀鑒別Fig 1 Characteristics of cacumen platycladi by different processing methods

2.1.2 烘制側(cè)柏葉的制作 取干燥后側(cè)柏葉，除去硬梗及雜質(zhì)，置于烘箱中，采用均勻設(shè)計法，烘箱溫度為120、140、160、180℃，烘制時間為10、15、20 min。取出，晾干，得不同條件下側(cè)柏葉烘制樣品。

2.1.3 性狀鑒別及浸出物含量測定 對不同炮制方法的側(cè)柏葉樣品進行性狀鑒別和浸出物含量測定。按2020年版《中國藥典》規(guī)定方法，照醇溶性浸出物測定法下的熱浸法測定，用乙醇作溶劑，測定不同炮制側(cè)柏葉樣品的浸出物含量，結(jié)果見表1。

表1 不同炮制方法樣品的鑒定Tab 1 Identification of samples of different processing methods

2.2 側(cè)柏葉UPLC指紋圖譜的建立[7-8]

2.2.1 色譜條件 Agilent Proshell 120 SB-C18色譜柱（3.0 mm×100 mm，2.7 μm），A為0.1%甲酸水，流動相 B為乙腈，梯度洗脫條件（0～2 min，5%～15%B；2～6 min，15%～18%B；6～18 min，18%～38%B；18～21 min，38%～54%B；21～27 min，54%～64%B；27～30 min，64%～85%B），進樣量5 μL，流速0.6 mL·min－1，柱溫30℃。

2.2.2 供試品溶液的制備 取炮制后側(cè)柏葉粉末約0.5 g，精密稱定置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇溶液20 mL，超聲處理20 min，用甲醇補足失重，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 儀器精密度試驗 取同一供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，結(jié)果各色譜峰相對保留時間RSD＜0.1%，相對峰面積RSD＜1.5%，表明儀器精密度良好。

2.2.4 重復性試驗 取相同炮制方法的側(cè)柏葉供試品溶液6份，按“2.2.1”項下色譜條件進行測定，結(jié)果各共有峰相對保留時間的RSD均＜0.1%，相對峰面積RSD均＜1.5%，表明方法重復性良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，室溫下放置0、2、4、6、12、24 h分別按“2.2.1”項下色譜條件進行測定，結(jié)果各共有色譜峰相對保留時RSD＜0.1%，相對峰面積RSD＜1.3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.6 多波長融合側(cè)柏葉的UPLC指紋圖譜的建立 選取140℃烘制樣品與焙制樣品，按“2.2.2”項下方法制備，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，共確認了21個共有峰。通過DAD檢測器對側(cè)柏葉色譜圖進行紫外全波長（200～400 nm）掃描。根據(jù)掃描結(jié)果確定融合波長為254、280、300 nm。分別從Agilent 1260色譜工作站中導出254、280、300 nm的dif格式數(shù)據(jù)文件，使用Matlab軟件編程，將導出的數(shù)據(jù)進行全時段多波長信息融合后，比較得出焙制側(cè)柏葉與烘制側(cè)柏葉在色譜圖上無顯著性差別，結(jié)果見圖2。

圖2 側(cè)柏葉焙制品（S1：B1、B2、B3混合樣品）與烘制品（S2：H1、H2、H3混合樣品）多波長融合的UPLC指紋圖譜Fig 2 UPLC multi-wavelength fusion fingerprint of cacumen platycladi baked product（S1：B1，B2，B3 mixed samples）and dried product（S2：H1，H2，H3 mixed samples）

2.3 不同炮制方法的側(cè)柏葉樣品同異性分析

將不同炮制方法的側(cè)柏葉共有峰峰面積數(shù)據(jù)導入SIMCA-P 14.1中進行無監(jiān)督模式的PCA-X，獲得相應的模型，模型參數(shù)R2X（在 X 軸方向模型的解釋率）為0.748，Q2（模型預測率）為0.649，均＞0.5，表明該模型穩(wěn)定可靠，見圖3。結(jié)果表明3批焙制側(cè)柏葉處在同一區(qū)間，且相鄰距離很小，焙制側(cè)柏葉樣品穩(wěn)定性較好；不同烘制側(cè)柏葉處在不同區(qū)間，表明烘制側(cè)柏葉樣品隨不同烘制溫度受熱具有一定變化，可能與側(cè)柏葉的寒涼性有關(guān)。通過PCA-X判別可以直觀地顯示不同炮制方法側(cè)柏葉樣品之間的異同性，其中與焙制側(cè)柏葉最相近的烘制側(cè)柏葉方法為“2.1.3”項下H5條件（即140℃烘制15 min）。

圖3 不同炮制方法的側(cè)柏葉共有峰PCA-XFig 3 Lateral cypress PCA-X of cacumen platycladi by different processing methods

2.4 兩種炮制方法相似度評價

為了驗證烘制側(cè)柏葉與焙制側(cè)柏葉炮制方法的一致性，按照“2.1.3”項下H5條件制備10批樣品（編號為HZ1～HZ10），按照B1條件制備10批樣品的（編號為BZ1～BZ10），將所得樣品的UPLC色譜圖分別導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2014版）軟件，設(shè)定參照圖譜和時間漂移值0.2 min，用中位數(shù)法譜峰自動匹配，生成UPLC指紋圖譜共有模式，即對照指紋圖譜。結(jié)果烘制側(cè)柏葉與焙制側(cè)柏葉樣品對照指紋圖譜的相似度在0.96～0.99，說明烘制樣品與焙制樣品有較好的一致性，結(jié)果見圖4。

圖4 焙制側(cè)柏葉對照指紋圖譜（A）與烘制側(cè)柏葉對照指紋圖譜（B）Fig 4 Baked cacumen platycladi control fingerprints（A）and dried cacumen platycladi control fingerprints（B）

3 討論

本研究對烘制與焙制的側(cè)柏葉指紋圖譜進行多波長融合，融合后的指紋圖譜能夠完整地表征側(cè)柏葉的化學成分組成。運用主成分分析技術(shù)，將經(jīng)典名方槐花散中古籍記載的焙制側(cè)柏葉與現(xiàn)代炮制工藝烘制的側(cè)柏葉進行分析，發(fā)現(xiàn)在140℃烘制15 min，得到的樣品與焙制樣品具有高度一致性。通過中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)，結(jié)果表明該條件下烘制側(cè)柏葉與焙制側(cè)柏葉的UPLC指紋圖譜相似度均在0.96～0.99，且兩種炮制方法生成的對照指紋圖譜基本相同，進一步驗證了現(xiàn)代烘制側(cè)柏葉可以代替古籍中記載的焙制側(cè)柏葉。

《古代經(jīng)典名方關(guān)鍵信息考證原則》[9]中指出“信息考證在遵古的基礎(chǔ)上充分考慮當前臨床和生產(chǎn)實際，傳承不泥古，用歷史和發(fā)展的角度去認識經(jīng)典名方中藥物炮制等關(guān)鍵共性問題”。本研究在烘制側(cè)柏葉過程中，利用烘箱、干燥室等使樣品受熱均勻，操作較為簡單，炮制方法僅與儀器的溫度、加熱時間有關(guān)，不需要考慮火候及操作經(jīng)驗，只需要制訂炮制標準即可，解決了焙制側(cè)柏葉產(chǎn)量低、焙制火候難以控制、側(cè)柏葉化學成分熱不穩(wěn)定性、焙制樣品差異性對藥效產(chǎn)生影響等問題。本研究發(fā)現(xiàn)不同烘制溫度的側(cè)柏葉樣品之間具有明顯差異，側(cè)柏葉屬寒涼類藥物，其中的槲皮苷、異槲皮苷、楊梅苷等黃酮苷類均與寒涼之性明顯相關(guān)[10-16]，研究表明側(cè)柏葉隨受熱溫度升高，穗花衫雙黃酮、扁柏雙黃酮含量下降，山柰酚、楊梅素含量增加[17-18]。

本研究表明用烘制側(cè)柏葉代替古籍中記載的焙制側(cè)柏葉，既遵從了古代炮制制藥技術(shù)理念又便于控制炮制程度，既降低了勞動成本和炮制工藝的繁瑣性又能復刻藥效，體現(xiàn)了中藥現(xiàn)代炮制方法的科學性。