骨痹止痛丸對腎陽虛大鼠軟骨調(diào)控作用機制研究

楊朔 楊杰 章敬程 幺寶金 冷向陽

中醫(yī)“腎主骨”理論在防治骨疾病方面具有重要價值。腎主骨，治腎亦治骨，從腎論治骨科疾患是歷代醫(yī)家長期遵循的治病原則，一直以來對中醫(yī)骨傷科臨床實踐起到了重要的指導作用。對于腎主骨相關機制的研究[1-4]和臨床實踐正在不斷深入。骨痹止痛丸出自“天池傷科”流派第三代傳人國醫(yī)大師劉柏齡教授之手，是劉老以腎主骨理論為基礎研發(fā)的頗具代表性的經(jīng)驗方。此方中含有淫羊藿、骨碎補等溫補腎陽之要藥，目前已制成長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑。在臨床實踐中，課題組發(fā)現(xiàn)骨痹止痛丸對骨性關節(jié)炎等退行性疾病確有療效，尤其適用于腎陽虛證者，但其具體作用機制尚未完全明確。本文旨在研究骨痹止痛丸調(diào)控腎陽虛大鼠軟骨的作用機制，為骨痹止痛丸的臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級6周齡雄性大鼠30只，體質(zhì)量(200±20)g，購自遼寧長生生物科技有限公司，實驗動物許可證號： SCXK (遼) 2020-0001。 動物實驗經(jīng)長春中醫(yī)藥大學動物研究倫理委員會批準(批準編號：2021411)。動物自由飲水和進食，在溫度(25±1)℃、濕度50%、12小時光照條件下飼養(yǎng)。

1.2 實驗藥物

本實驗中所使用的骨痹止痛丸為長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑(批號：吉藥制字Z20170048)，由長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院提供。具體藥物組成包括：淫羊藿15 g、骨碎補15 g、萊菔子6 g、雞血藤10 g、鎖陽10 g、熟地黃20 g、狗脊15 g。制備方法如下：將上述7種藥物按固定比例進行混合，以蒸餾水浸泡(水面沒過藥材3 cm)；浸泡2小時后，用砂鍋將藥物和浸泡液煮沸30分鐘，使用絹布過濾回收第一次所得藥液，藥渣留于砂鍋內(nèi)；再向砂鍋中加入蒸餾水，繼續(xù)沸水煎煮1小時，使用絹布過濾收取第二次所得藥液，重復操作1次；將3次所得藥液進行混合，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮獲得浸膏，4℃保存[4]。

1.3 主要試劑與儀器

大鼠聯(lián)酶免疫吸附法(enzyme unked immunsoybent assay,ELISA)試劑盒(上海優(yōu)選生物科技有限公司，批號：202006C)，總RNA提取試劑盒(BioTek公司，批號：11752053)，TRIzol Reagent(Invitrogen公司，批號：10296028)，蘇木素染色液(珠海貝索生物科技有限公司，批號：BA-4097)，伊紅染色液(珠海貝索生物科技有限公司，批號：BA-4022)，熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa，批號：4472920)，氫化可的松混懸液(天津金耀藥業(yè)有限公司，規(guī)格20 mL∶100 MG，批號：2103008S)，4%多聚甲醛溶液(Beyotime公司，批號：P0099)。

高速離心機(Eppendorf公司)，Infnite 200 PRO型酶標儀(Life Science公司)，PCR儀(Eppendorf公司)，紫外可見分光光度計(日本島津公司)，F(xiàn)A1004N型電子天平(上海精密科學儀器有限公司)，Leica RM2255型石蠟切片機(德國Leica公司)，Leica EG1140石蠟包埋機(德國Leica公司)，OlympusBX51光學顯微鏡(日本Olympus公司)，NIS-ELEMNTBR型圖像分析系統(tǒng)(日本NIKON公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組與給藥 所有大鼠適應性喂養(yǎng)1周后隨機分為3組，每組10只，分別為對照組、腎陽虛組和骨痹止痛丸組。對照組大鼠后肢肌肉注謝0.9%生理鹽水0.3 mL，每日1次，連續(xù)22天。腎陽虛組大鼠后肢肌肉注射氫化可的松混懸液2.5 mg/100 g，每日1次，連續(xù)進行22天。骨痹止痛丸組大鼠后肢肌肉注射氫化可的松混懸2.5 mg/100 g，每日1次，連續(xù)22天，從第8天開始，按1.05 g/(kg·d)(體表面積折算法人等效劑量)的標準劑量給予骨痹止痛丸水溶液連續(xù)灌胃給藥[5]，每天灌胃1次，連續(xù)進行15天，直至第22天。

1.4.2 動物組織取材 本研究中30只大鼠無死亡情況，在末次給藥后12小時，各組大鼠分別用乙醚進行麻醉，而后進行腹主動脈取血。血液離心后取血清并保存在-20℃冰箱中(離心條件：4℃ 3000 r/min離心10分鐘)。大鼠處死后取腎臟和整個膝關節(jié)，分離軟骨組織，一側(cè)腎臟和膝關節(jié)軟骨放于凍存管中，-80℃保存；另一側(cè)腎臟和膝關節(jié)軟骨用4%多聚甲醛溶液固定。

1.5 指標檢測

1.5.1 一般情況 每日觀察大鼠形態(tài)及行為學變化，每3日測量各組大鼠體質(zhì)量并記錄。

1.5.2 ELISA檢測血清激素 從每組中隨機抽取3只大鼠進行檢測，具體操作步驟按照ELISA試劑盒說明書進行，檢測指標包括促腎上腺皮質(zhì)激素(adreno cortico tropic hormone，ACTH)、皮質(zhì)醇(cortisol，CORT)、促黃體生成素(luteinizing hormone，LH)和睪酮(testosterone，T)

1.5.3 腎臟和膝關節(jié)軟骨組織病理切片 用4%的多聚甲醛溶液將大鼠一側(cè)腎臟和膝關節(jié)軟骨組織固定過夜，然后進行石蠟包埋，切片機切成3 mm的組織切片，最后用蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，在光學顯微鏡下進行拍照觀察。

1.5.4 實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)法檢測基因表達水平 從每組中隨機抽取3只大鼠，采用qRT-PCR法檢測各組大鼠膝關節(jié)軟骨中Col2a1、Col9a1、Col10a1、Col11a1、Acan、Comp、Hapln1、Ibsp、Wwp2、Sox9、Sox5、Sox4等基因的表達水平。引物序列見表1，以Gapdh為表達的內(nèi)參，采用2-ΔΔCT方法計算基因的相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.6 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量與形態(tài)變化

腎陽虛組大鼠體質(zhì)量相比于對照組明顯下降(P<0.05)，經(jīng)骨痹止痛丸治療后，體質(zhì)量增加，見表2。此外，腎陽虛組大鼠還出現(xiàn)了疲勞、活動減少、聚集傾向、怕冷、食欲下降、毛發(fā)脫落等一系列行為和生理特征，提示腎陽虛造模成功。

表2 各組腎陽虛大鼠體質(zhì)量比較

2.2 各組大鼠血清激素水平變化

與對照組相比，腎陽虛組大鼠血清中ACTH、T、LH、CORT等激素水平明顯下降，經(jīng)骨痹止痛丸治療后，略有上升，提示大鼠腎陽虛得到改善[6]見表3。

表3 各組腎陽虛大鼠血清激素水平比較

2.3 各組大鼠腎臟、膝關節(jié)軟骨病理切片情況

對照組腎臟腎小管和腎小球均未見異常變化；腎陽虛組腎小球擴張，近曲小管變性，遠曲小管擴張；骨痹止痛丸組腎小球擴張程度相比腎陽虛組減輕，腎小管功能狀態(tài)改善，近曲小管未見明顯變性，遠曲小管未見明顯擴張。見圖1。

注：A 對照組；B腎陽虛組；C 骨痹止痛丸組。

對照組膝關節(jié)軟骨表現(xiàn)為軟骨面光滑連續(xù)，軟骨細胞數(shù)量豐富，細胞分布層次較多，軟骨下骨質(zhì)內(nèi)骨小梁寬大，分布呈網(wǎng)狀，分布密集。腎陽虛組膝關節(jié)軟骨面失去光滑連續(xù)的表面結(jié)構(gòu)，軟骨層表面塌陷，凹凸不平，可見纖維成分增生增多，并有少量脂肪組織化生；軟骨層明顯變薄，軟骨細胞固縮，軟骨基質(zhì)成分明顯減少，軟骨囊內(nèi)同源軟骨細胞群分布明顯減少，軟骨骨小梁成分分布減少，骨小梁變細變長，骨小梁間連接減少。軟骨層所體現(xiàn)的軟骨成分與骨小梁所體現(xiàn)的骨組織成分都表現(xiàn)處萎縮、減少；此種變化與中醫(yī)理論中的“骨痿”相符合。骨痹止痛丸組膝關節(jié)軟骨層增厚，表面光滑連續(xù)；相比腎陽虛組有效增加軟骨層中軟骨細胞數(shù)量，增加軟骨基質(zhì)和同源軟骨細胞數(shù)目；軟骨層下骨小梁成分增寬，分布數(shù)量增加。見圖2。

注：A 對照組；B腎陽虛組；C 骨痹止痛丸組。

2.4 各組大鼠軟骨相關基因表達情況

與對照組相比，腎陽虛組的Col2a1、Col9a1、Col10a1、Col11a1、Acan、Comp、Hapln1、Ibsp、Wwp2、Sox9、Sox5、Sox4等基因表達水平明顯下調(diào)(P<0.05)。經(jīng)骨痹止痛丸給藥治療后，以上基因表達水平明顯上調(diào)(P<0.05)。這些基因為軟骨祖細胞標志物和生長板軟骨細胞標志物。將各基因表達的相對差別倍數(shù)歸一化到內(nèi)控基因Gapdh，見表4。

表4 基因相對表達量的影響

3 討論

中醫(yī)腎主骨理論源自于《內(nèi)經(jīng)》[7-8]。在中醫(yī)理論體系中，腎為先天之本，五行屬性為水，為陰中之陽。腎主藏精，包括稟受于父母的先天之精和水谷精微充養(yǎng)的后天之精，二者相互為用，彼此依存。《素問·陰陽應象大論篇》：“腎生骨髓”，髓藏于骨腔之中，以充養(yǎng)骨骼，構(gòu)成腎主骨的物質(zhì)基礎。國醫(yī)大師劉柏齡教授崇尚腎主骨的思想，并結(jié)合其自身多年臨床經(jīng)驗總結(jié)確立了“治腎亦即治骨”的學術理念。他認為腎中精氣的保養(yǎng)，是人體抵御病邪和防治骨病的重要措施，這與現(xiàn)代醫(yī)學研究結(jié)果不謀而合。本研究中所使用的骨痹止痛丸具有補腎健骨，舒筋通絡的功效。腎主骨、生髓，腎虛則骨痿。無論是先天不足還是腎精的后天衰敗、房勞傷腎、他病及腎等都可以引起腎病及骨。所以在治療骨相關疾病時，善用補腎藥尤為重要。

現(xiàn)代醫(yī)學認為腎臟與骨骼組織具有相同的起源，均由中胚層細胞分化并發(fā)育而來，預示著腎臟與骨骼在人體的生長發(fā)育及受到損傷后的修復過程中可能存在著密切關系。腎臟可以產(chǎn)生骨形成蛋白7、促紅細胞生成素等物質(zhì)，它們可以調(diào)節(jié)鈣磷代謝的平衡及成骨過程中有機質(zhì)的形成和礦化等環(huán)節(jié)。同時，有研究發(fā)現(xiàn)腎臟通過調(diào)節(jié)骨保護素和硬骨素的水平，進而影響骨細胞的活性。上述物質(zhì)在骨的形成、構(gòu)建、功能維持以及損傷和修復過程中發(fā)揮了重要的作用。這些科學研究[9-12]為中醫(yī)學腎主骨理論提供了必要的科學依據(jù)和物質(zhì)基礎。腎通過影響激素的產(chǎn)生和分泌，對骨產(chǎn)生直接或間接的調(diào)控作用。如下丘腦—垂體—腎上腺皮質(zhì)軸、下丘腦—垂體—性腺軸和下丘腦—垂體—甲狀腺軸，腎虛可導致以上3個靶腺軸的功能紊亂，造成垂體、性腺、甲狀腺等多個腺體的退行性改變，腺體分泌激素處于異常狀態(tài)，致使成骨功能下降。有研究表明受下丘腦—垂體—腎上腺皮質(zhì)軸系統(tǒng)調(diào)控的內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素通過直接影響成熟成骨細胞Wnt蛋白的表達和分泌，可以間接抑制骨髓間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞的分化，并會促使成骨細胞形成[13]。

本研究建立了腎陽虛大鼠模型，研究發(fā)現(xiàn)腎陽虛組大鼠相比于對照組，血清中ACTH、T、LH、CORT等激素水平明顯下降，同時腎陽虛組腎臟病理切片表現(xiàn)為腎小球擴張，近曲小管變性，遠曲小管擴張。這提示在腎陽虛狀態(tài)下，大鼠的腎臟功能受到抑制和損傷。而通過骨痹止痛丸給藥治療，這種抑制和損傷在一定程度上得到了改善。在腎主骨的研究中，軟骨是不可割舍的重要部分。本課題組分析了一些軟骨相關的重要標志基因。腎陽虛組較對照組Col2a1、Col9a1、Col10a1、Col11a1、Acan、Comp、Hapln1、Ibsp、Wwp2、Sox9、Sox5、Sox4等基因表達明顯下調(diào)，而經(jīng)骨痹止痛丸給藥治療后，這些基因相比腎陽虛組表達水平明顯上調(diào)。Sox9是一種主轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)控靶基因Sox8、Sox5、Sox4、Acan、Col2a1、Col9a1、Col11a1、Hapln1和Wwp2在軟骨發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[14-16]。此前，本課題組利用轉(zhuǎn)錄組測序、同位素標記相對和絕對定量等現(xiàn)代生物學技術，對骨和軟骨發(fā)育、生長和再生相關的分子機制進行了探索，并證明其潛在的分子機制與腎主骨理論高度一致。本項研究的結(jié)果也與本課題組之前的研究結(jié)果一致[1-4]。這些結(jié)果提示骨痹止痛丸能夠有效改善大鼠腎陽虛的病理狀態(tài)，并通過調(diào)控Col2a1、Col9a1、Col10a1、Col11a1、Acan、Comp、Hapln1、Ibsp、Wwp2、Sox9、Sox5、Sox4等基因，從而達到保護軟骨的效果。

在前期的臨床研究[17]中，骨痹止痛丸已經(jīng)顯示出其針對骨性關節(jié)炎等退行性疾病的確切療效，但其具體作用機制尚未完全清楚。本研究以腎主骨理論為切入點探討骨痹止痛丸調(diào)控腎陽虛大鼠軟骨的作用機制，發(fā)現(xiàn)骨痹止痛丸可通過提高軟骨標志物的基因表達水平發(fā)揮治療作用。關于中醫(yī)藥復方的研究，傳統(tǒng)的研究方法主要是通過單一的信號通路進行評估，無法系統(tǒng)而全面地揭示中藥復方治療疾病的科學內(nèi)涵，這也是本研究需要繼續(xù)完善之處。中醫(yī)學提倡整體觀，如何從整體觀念出發(fā)，系統(tǒng)而全面地闡釋其科學內(nèi)涵也是未來研究的新方向。在隨后的研究中，本課題組將繼續(xù)圍繞“腎主骨”這一方向，嘗試從轉(zhuǎn)錄組學、蛋白組學以及多組學聯(lián)合等角度，對其進行更深層次的研究和挖掘。