• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    四君子湯改善C57小鼠惡病質(zhì)狀態(tài)肌肉消耗的療效及機制研究

    2022-05-10 03:44:08朱健吉兆奕焦擁政朱曉云袁國興吳潔
    環(huán)球中醫(yī)藥 2022年5期
    關(guān)鍵詞:惡病質(zhì)四君子四君子湯

    朱健 吉兆奕 焦擁政 朱曉云 曹 袁國興 吳潔

    惡病質(zhì)是各種惡性腫瘤尤其是晚期患者的主要并發(fā)癥,是造成死亡的獨立危險因素,嚴(yán)重影響患者的生存期及生活質(zhì)量,預(yù)后差[1]。晚期腫瘤患者約50%~80%存在厭食和體重下降等惡病質(zhì)的表現(xiàn)[2],且進(jìn)行性的腫瘤惡病質(zhì)狀態(tài)預(yù)后不佳,存活時間短,占所有癌癥死亡的近20%[3]。目前臨床尚缺乏合理的治療策略,尚無單一性、特異性的療效確切的藥物[4]。

    中醫(yī)學(xué)雖無惡病質(zhì)病名,但其以納呆食少、倦怠乏力、消瘦等一系列臟腑虛損癥狀為主要臨床表現(xiàn),屬于中醫(yī)“虛勞”范疇[5]。中醫(yī)認(rèn)為脾為后天之本、氣血生化之源,從脾論治虛勞最早見于《金匱要略》,而脾虛也是腫瘤發(fā)病的基礎(chǔ)[6]。四君子湯是中醫(yī)治療脾胃氣虛的經(jīng)典方劑,近年研究文獻(xiàn)提示四君子能夠改善腫瘤惡病質(zhì)狀態(tài),與抑制炎癥因子有關(guān)[7],而具體機制未詳細(xì)闡明。基于此,本課題組建立C57小鼠肺癌惡病質(zhì)模型,觀察四君子湯改善C57小鼠惡病質(zhì)狀態(tài)肌肉消耗的療效及機制。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物

    清潔級近交系6~7周C57BL/6小鼠24只,雌雄各半,體質(zhì)量18~24 g,購自中國中醫(yī)科學(xué)院藥品鑒定所實驗動物中心(動物許可證號:SCXK京20000010號)。

    1.2 細(xì)胞株及種瘤方法

    Lewis鼠源肺癌細(xì)胞由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心提供。癌細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),定期更換,約3~4日待細(xì)胞鋪滿瓶底胰酶消化后,用PBS配置為1×107/mL細(xì)胞懸液。使用隨機數(shù)字表法選取18只小鼠,采用1 mL注射器抽取0.2 mL細(xì)胞懸液注入小鼠右腋皮下,7天后皮下可觸及瘤體,成瘤18只。

    1.3 實驗藥物

    四君子湯組方為:黨參、白術(shù)、茯苓、甘草(批號分別為:21081501、21100904、21072002、21082301,均由康美智慧藥房連鎖有限公司提供),以9∶9∶9∶6配比,藥材由中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院中藥房提供并煎湯取汁。醋酸甲地孕酮分散片(青島國海生物制藥有限公司,規(guī)格:40 mg,生產(chǎn)批號:16110502),研磨杵研磨藥片,生理鹽水溶解,按照0.024 g/kg給藥。

    1.4 主要試劑與儀器

    兔來源一抗Activin-A、Myostatin、MuRF1及二抗均購于中國ABclonal公司(生產(chǎn)批號:RP02516、A6913、A3101),Western Blot相關(guān)試劑盒購于中國Solarbio公司(生產(chǎn)批號:P1200、P1010),人活化素A(Activin-A)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒分別購于上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司、武漢云克隆科技股份有限公司(生產(chǎn)批號:YM-1058B、SEA133Ra)。

    1.5 實驗方法

    按照隨機數(shù)字表將上述成模的18只小鼠再次分為模型組、四君子組、地屈孕酮組,每組6只。此外,正常組為6只。其中四君子組以5倍臨床等效劑量,從接種第2日起開始灌胃,藥物濃度1 g/mL,每日1次灌胃,每次0.3 mL;模型組與正常組自接種第2日開始給予同等劑量的生理鹽水灌胃;地屈孕酮組從接種第2日開始每天給予甲地孕酮溶液,按照0.024 g/(kg·d)給藥,每天灌胃1次。

    1.6 檢測指標(biāo)

    1.6.1 動態(tài)觀察小鼠進(jìn)食量和體質(zhì)量 給藥2周后處死動物,眼球取血,分離血清,解剖留取動物皮下腫瘤、脾臟、肝臟、腓腸肌標(biāo)本,游標(biāo)卡尺測量腫瘤長短徑,并稱取質(zhì)量,計算腫瘤及臟器指數(shù)(臟器質(zhì)量/體質(zhì)量)。

    1.6.2 透射電鏡觀察肌纖維形態(tài) 取1 cm3骨骼肌組織若干塊,經(jīng)過乙醇梯度脫水、包埋切片染色等處理,置于JEOL-3010透射電子顯微鏡下觀察骨骼肌結(jié)構(gòu),并用相機記錄。

    1.6.3 檢測血液中炎癥因子水平 采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)檢測血清TNF-α、Activin-A水平,按ELISA試劑盒說明書操作。

    1.6.4 蛋白免疫印跡(Western Blot)法及實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)肌萎縮基因Myostatin、Activin-A、MuRF-1表達(dá)水平 取惡病質(zhì)小鼠骨骼肌組織2 mm3,加入裂解液及蛋白磷酸酶抑制劑,于超聲勻漿中提取蛋白,在4℃,12 000r/min條件下離心5分鐘,取上清后使用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。經(jīng)過SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)至PVDF膜,加入抗體Myostatin、Activin-A、MuRF-1,4℃條件下孵育過夜,在漂洗、二抗孵育、洗膜等操作后,將PVDF膜浸泡于電化學(xué)發(fā)光顯色成圖。

    取惡病質(zhì)小鼠骨骼肌組織,按照10~20 mg組織加入300 μL裂解液,進(jìn)行勻漿處理,按照RNA提取試劑盒的操作要求提取RNA,在納滴儀上檢測核酸濃度并確定無雜質(zhì),配置20 μL反應(yīng)體系將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA,配置20 μL熒光PCR反應(yīng)體系,使用StepOnePlusTMReal-TimePCRSystem型熒光定量PCR儀進(jìn)行擴增,反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴增曲線和融解曲線,輸出數(shù)據(jù)。

    1.7 數(shù)據(jù)處理

    2 結(jié)果

    2.1 四君子湯對肺癌惡病質(zhì)小鼠體質(zhì)量、腫瘤直徑、腫瘤質(zhì)量的影響

    實驗發(fā)現(xiàn),與模型組和地屈孕酮組相比,四君子組瘤體質(zhì)量降低(P<0.05)。見表1。

    表1 各組肺癌惡病質(zhì)小鼠體質(zhì)量、腫瘤直徑、腫瘤質(zhì)量比較

    2.2 四君子湯對肺癌惡病質(zhì)小鼠脾臟、肝臟質(zhì)量及臟器指數(shù)的影響

    正常組無肝脾腫大現(xiàn)象發(fā)生,而肺癌惡病質(zhì)小鼠均有肝脾腫大現(xiàn)象發(fā)生。在脾臟質(zhì)量上,四君子組與模型組、地屈孕酮組差異無統(tǒng)計意義(P>0.05)。而對于肝臟質(zhì)量,與四君子組相比,模型組、地屈孕酮組肝臟質(zhì)量增加,差異具有統(tǒng)計意義(P<0.05)。見表2。

    表2 各組肺癌惡病質(zhì)小鼠脾臟、肝臟質(zhì)量及臟器指數(shù)比較

    2.3 四君子湯對肺癌惡病質(zhì)小鼠骨骼肌(腓腸肌、比目魚肌、脛前肌)質(zhì)量及指數(shù)的影響

    對腓腸肌進(jìn)行解剖、剝離、稱重,發(fā)現(xiàn)荷瘤各組小鼠與正常組比較,肌肉質(zhì)量明顯降低(P<0.05);與模型組比較,四君子湯能夠改善骨骼肌的絕對質(zhì)量(P<0.05),地屈孕酮組無顯著改變,四君子組較模型組骨骼肌/體質(zhì)量指數(shù)有升高的趨勢。見表3。

    2.4 四君子湯對肺癌惡病質(zhì)小鼠骨骼肌纖維形態(tài)學(xué)的影響

    各組小鼠腓腸肌纖維橫截面切片經(jīng)蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色,在電鏡下可觀察到正常組小鼠腓腸肌紋路清晰,骨骼肌細(xì)胞排列緊密,呈圓形或多邊形,細(xì)胞核多位于細(xì)胞周邊,與細(xì)胞膜接近,細(xì)胞核被染成紫色,細(xì)胞質(zhì)被染成粉紅色。惡病質(zhì)小鼠腓腸肌肌細(xì)胞排列疏松,肌纖維細(xì)胞縮小,細(xì)胞間隙增大,肌纖維細(xì)胞大小差異較大,說明惡病質(zhì)模型的腓腸肌存在明顯萎縮現(xiàn)象。四君子湯能明顯改善骨骼肌萎縮的癥狀。見圖1。

    注:A 正常組;B 模型組;C 地屈孕酮組;D 四君子組。

    表3 各組肺癌惡病質(zhì)小鼠腓腸肌質(zhì)量及指數(shù)比較

    2.5 四君子湯對肺癌惡病質(zhì)小鼠血清TNF-α、Activin-A含量的影響

    惡病質(zhì)模型組和四君子組小鼠血清中TNF-α含量、Activin-A較正常組明顯升高(P<0.05),提示接種肺癌細(xì)胞的各組存在血清TNF-α、Activin-A的高表達(dá)(P<0.05)。地屈孕酮組和四君子組Activin-A表達(dá)水平與模型對照組相比,存在不同程度降低(P<0.05)。見表4。

    表4 各組肺癌惡病質(zhì)小鼠血清TNF-α、Activin-A含量比較

    2.6 四君子湯對肺癌惡病質(zhì)小鼠肌萎縮相關(guān)基因表達(dá)的影響

    與正常組相比,模型組腓腸肌中Activin-A、Myostatin、MuRF1的mRNA存在高表達(dá)(P<0.01)。四君子組的Activin-A表達(dá)水平與模型組相比明顯降低(P<0.05);在Myostatin表達(dá)上,地屈孕酮組和四君子組較模型組顯著降低(P<0.01);在MuRF1的表達(dá)上,四君子組與模型組相比明顯降低(P<0.05),而地屈孕酮組與模型組相比顯著降低(P<0.01)。見表5。

    表5 各組肺癌惡病質(zhì)小鼠腓腸肌中Activin-A、Myostatin、MuRF1的mRNA表達(dá)比較

    2.7 四君子湯對肺癌惡病質(zhì)小鼠肌萎縮相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

    模型組小鼠肌萎縮相關(guān)蛋白Activin、Myostatin、MuRF1的表達(dá)顯著升高。與模型組比較,四君子湯顯著降低肌萎縮相關(guān)蛋白Activin-A的表達(dá),結(jié)果與mRNA表達(dá)結(jié)果一致。說明四君子湯可能通過Myostatin/Actvin-ActRIIB信號途徑抑制肺癌惡病質(zhì)小鼠骨骼肌萎縮。而Myostatin、MuRF1蛋白表達(dá)結(jié)果與mRNA表達(dá)存在不完全一致的現(xiàn)象,有待進(jìn)一步實驗驗證。見圖2。

    注:A 正常組;B 模型組;C 地屈孕酮組;D 四君子組

    3 討論

    腫瘤惡病質(zhì)是中晚期腫瘤患者的常見臨床表現(xiàn),以短期內(nèi)體重嚴(yán)重下降、肌肉組織(伴或不伴脂肪組織)進(jìn)行性消耗為顯著特征,同時伴有厭食、水腫、貧血、多器官功能衰竭等癥狀,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,縮短患者的生存時間[4]。研究結(jié)果表明,四君子組的腫瘤平均直徑相較于地屈孕酮組和模型組顯著縮小,同時四君子組的腓腸肌質(zhì)量相較于模型組與地屈孕酮組有一定的增加,在改善肝腫大現(xiàn)象上優(yōu)于地屈孕酮組,在腓腸肌的電鏡圖上顯示四君子組腓腸肌紋路相對清晰,骨骼肌細(xì)胞排列相對緊密,提示四君子湯能夠在改善小鼠腫瘤惡病質(zhì)方面效果優(yōu)于地屈孕酮。

    四君子湯改善骨骼肌萎縮癥狀可能通過改善小鼠靜息能量消耗情況從而逆轉(zhuǎn)小鼠體內(nèi)能量負(fù)平衡代謝狀態(tài),一定程度上相對地提高骨骼肌質(zhì)量。在能量消耗方面,人體內(nèi)分為兩種消耗方式,包括靜息能量消耗和活動能量消耗及飲食生熱。而靜息能量消耗占人體消耗總能量的比值為60%~70%[8],占人體能量消耗的主要部分。而在靜息能量消耗中,又以肝臟、大腦、心臟占靜息能量消耗的58%[9],相反,骨骼肌能量消耗僅為22%[10]。肝臟是小鼠質(zhì)量最大的臟器,與小鼠能量代謝和線粒體中解偶聯(lián)蛋白息息相關(guān)[11]。本研究結(jié)果表明,相較于地屈孕酮,四君子組能夠明顯改善肝腫大現(xiàn)象。

    四君子湯通過抗炎作用改善腫瘤惡病質(zhì)骨骼肌萎縮狀態(tài)。在惡病質(zhì)肌肉萎縮眾多調(diào)控因素中,炎性反應(yīng)也起著重要的作用[12]。蛋白質(zhì)的分解增加和合成減少引起骨骼肌萎縮,最終形成腫瘤惡病質(zhì),而Activin A是腫瘤患者生存期縮短的預(yù)期指標(biāo)。在骨骼肌中,Activin A和Myostatin的受體activin receptor ⅡB(ActRⅡB)能夠?qū)е耂mad2/3磷酸化及FOXO基因的去磷酸化,磷酸化的Smad2/3能夠下調(diào)與肌肉分化相關(guān)的基因[13],還能抑制蛋白合成途徑AKT-mTOR[14];而另一方面,磷酸化的Smad2/3和去磷酸化FOXO還能誘導(dǎo)MURF1和Atrogin-1基因的激活[15],這兩種蛋白能夠促進(jìn)骨骼肌中肌原纖維蛋白的降解,從而促進(jìn)了骨骼肌的能量消耗。而TNF-α等炎癥因子水平升高,也與腫瘤相關(guān)性厭食等有關(guān)[16]。研究發(fā)現(xiàn)肌萎縮時確實存在很多細(xì)胞因子的表達(dá),其中TNF-α通過其信號通路可最終導(dǎo)致MuRF-1表達(dá),并引起肌肉蛋白的降解[17]。TNF-α還可抑制肌肉分化生長因子mRNA水平,導(dǎo)致骨骼肌的分化中斷,影響受損肌肉組織的修復(fù),促進(jìn)腫瘤惡病質(zhì)的進(jìn)展[18]。因此,Activin A和TNF-α水平的升高與腫瘤惡病質(zhì)狀態(tài)密切相關(guān)。四君子組小鼠血清中Activin A較模型組和地屈孕酮組明顯降低,說明四君子組在降低Activin A水平方面明顯優(yōu)于地屈孕酮。

    四君子湯通過干預(yù)Myostatin/Actvin-ActRIIB信號途徑調(diào)控骨骼肌肌肉消耗。肌肉組織是人體最主要的蛋白質(zhì)—能量儲備庫,在禁食、饑餓、各種疾病消耗狀態(tài)時,機體動員蛋白質(zhì)分解以應(yīng)對能量需求及合成新的蛋白質(zhì)。在這種代謝狀態(tài)下,肌蛋白合成減少而分解增加,使機體骨骼肌肌肉量丟失,導(dǎo)致骨骼肌消耗。晚期腫瘤患者臨床表現(xiàn)為體質(zhì)量丟失、骨骼肌萎縮、低蛋白血癥、內(nèi)臟蛋白消耗、蛋白質(zhì)合成減少和分解增加、蛋白轉(zhuǎn)化率升高、血漿氨基酸譜異常以及機體呈現(xiàn)負(fù)氮平衡等,都證實骨骼肌蛋白質(zhì)分解旺盛是腫瘤惡病質(zhì)的主要代謝特點,骨骼肌消耗是引起腫瘤蛋白質(zhì)—能量消耗性營養(yǎng)不良的中心環(huán)節(jié),是最終引起惡病質(zhì)的決定因素[19]。無論是臨床還是實驗研究,均提示多種復(fù)雜因素參與腫瘤性骨骼肌消耗,近年來比較關(guān)注基因轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯水平對骨骼肌蛋白合成/分解的調(diào)控機制[20]。Myostatin/Actvin-ActRIIB信號途徑是肌肉消耗的一條重要通路。MuRF1是肌肉細(xì)胞特異性泛素蛋白連接酶,在骨骼肌細(xì)胞核中特異表達(dá),是蛋白質(zhì)降解的相關(guān)基因,并涉及肌肉應(yīng)答和收縮調(diào)節(jié)的各個方面,過度表達(dá)后在骨骼肌M線處與粗肌絲連接蛋白結(jié)合,破壞粗絲聯(lián)接蛋白的亞結(jié)構(gòu)域,導(dǎo)致粗絲聯(lián)接蛋白的降解[21]。實驗結(jié)果顯示,在肺癌惡病質(zhì)小鼠肌萎縮相關(guān)基因表達(dá)中,四君子湯能夠明顯降低Activin-A、Myostatin、MuRF1的mRNA表達(dá),其中降低血清Myostatin mRNA的表達(dá)更顯著。四君子湯顯著降低肌萎縮相關(guān)蛋白Activin-A的表達(dá),結(jié)果與mRNA表達(dá)結(jié)果一致。而Myostatin、MuRF1蛋白表達(dá)結(jié)果與mRNA表達(dá)存在不完全一致的現(xiàn)象,有待進(jìn)一步實驗驗證。

    如何預(yù)防和逆轉(zhuǎn)腫瘤惡病質(zhì)的發(fā)生發(fā)展,目前臨床上尚缺乏有效手段。針對骨骼肌消耗性營養(yǎng)不良的發(fā)病機制,采取的治療策略包括降低炎癥因子和氧化應(yīng)激水平,改善胰島素抵抗,阻止caspase-3及Atrogin-1和MuRF-1的激活,降低抑制素或activin水平等。探討腫瘤惡病質(zhì)的發(fā)病機制及有效干預(yù)措施,具有十分重要的意義。本研究從Myostatin/Actvin-ActRIIB信號途徑這一前沿領(lǐng)域,證實了四君子湯對腫瘤惡病質(zhì)骨骼肌萎縮的干預(yù)作用,并能降低血清中的炎癥因子,明確了四君子湯治療腫瘤惡病質(zhì)骨骼肌萎縮的關(guān)鍵靶點和核心通路,為應(yīng)用中醫(yī)藥改善晚期腫瘤患者生存質(zhì)量提供了生物學(xué)基礎(chǔ)和科學(xué)理論依據(jù)。

    猜你喜歡
    惡病質(zhì)四君子四君子湯
    足三里穴位植線聯(lián)合加味四君子湯治療功能性消化不良的臨床效果觀察
    癌癥惡病質(zhì)相關(guān)肌肉萎縮發(fā)病機制的研究進(jìn)展
    康艾注射液抗癌癥惡病質(zhì)的臨床觀察
    顆粒劑四君子膏對脾氣虛證模型大鼠心功能的影響
    Potential Mechanism and Application of Strengthening the Spleen, Clearing Heat and Dampness in Treatment of Gastroesophageal Reflux Disease
    趙煒 國畫
    南風(fēng)(2020年2期)2020-02-27 10:54:24
    褚玥瑩作品
    花中四君子 中國傳統(tǒng)文化與法式染色布花工藝
    Coco薇(2017年1期)2017-02-15 18:59:44
    加味四君子湯對堿燒傷食管組織中p53和Bcl-2表達(dá)水平的影響
    四逆四君子湯加味治療肝郁脾虛型慢性胃炎的臨床效果
    午夜激情久久久久久久| 久久毛片免费看一区二区三区| 一个人免费在线观看的高清视频 | 99九九在线精品视频| 国产视频一区二区在线看| 精品亚洲成a人片在线观看| 女性生殖器流出的白浆| 国产精品成人在线| 欧美少妇被猛烈插入视频| 国产成+人综合+亚洲专区| 蜜桃国产av成人99| 亚洲男人天堂网一区| 久久精品国产亚洲av高清一级| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 老汉色av国产亚洲站长工具| 两性夫妻黄色片| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 欧美日韩精品网址| 精品人妻在线不人妻| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 超碰成人久久| 亚洲少妇的诱惑av| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 国产一区二区三区av在线| av一本久久久久| 欧美激情久久久久久爽电影 | 天堂中文最新版在线下载| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 高潮久久久久久久久久久不卡| 九色亚洲精品在线播放| 国产真人三级小视频在线观看| 国产97色在线日韩免费| 亚洲国产精品一区三区| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 另类亚洲欧美激情| 18在线观看网站| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 妹子高潮喷水视频| 国产欧美亚洲国产| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 国产免费一区二区三区四区乱码| 精品亚洲成a人片在线观看| 天天添夜夜摸| 精品国产一区二区久久| 91精品国产国语对白视频| 久久久久久久国产电影| 亚洲av电影在线进入| 日本一区二区免费在线视频| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 国产三级黄色录像| 后天国语完整版免费观看| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 久久国产亚洲av麻豆专区| 丝袜在线中文字幕| 国产一区二区激情短视频 | 少妇精品久久久久久久| 最近最新中文字幕大全免费视频| 国产精品亚洲av一区麻豆| av在线播放精品| 亚洲精品国产区一区二| 亚洲中文av在线| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 丝袜美足系列| 欧美av亚洲av综合av国产av| 在线看a的网站| 国产成人欧美在线观看 | 99久久综合免费| 成年av动漫网址| 国产精品九九99| 免费高清在线观看视频在线观看| 免费在线观看日本一区| 成年av动漫网址| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 久久香蕉激情| 一级毛片精品| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 久久精品成人免费网站| 欧美大码av| 黄色视频在线播放观看不卡| 精品一区二区三卡| 1024视频免费在线观看| 我的亚洲天堂| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 在线永久观看黄色视频| a在线观看视频网站| 2018国产大陆天天弄谢| 999精品在线视频| 国产三级黄色录像| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 五月天丁香电影| 男女无遮挡免费网站观看| a级毛片在线看网站| 制服人妻中文乱码| 亚洲精品一区蜜桃| 亚洲一码二码三码区别大吗| 一级片'在线观看视频| 男人爽女人下面视频在线观看| 精品视频人人做人人爽| 成人手机av| 淫妇啪啪啪对白视频 | 麻豆av在线久日| 亚洲avbb在线观看| 一二三四在线观看免费中文在| 国产xxxxx性猛交| 69av精品久久久久久 | 亚洲精品第二区| 高清视频免费观看一区二区| 桃花免费在线播放| 免费日韩欧美在线观看| 精品乱码久久久久久99久播| 免费在线观看黄色视频的| 午夜91福利影院| 国产又爽黄色视频| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲精品av麻豆狂野| 自线自在国产av| 亚洲性夜色夜夜综合| 首页视频小说图片口味搜索| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 51午夜福利影视在线观看| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 欧美国产精品va在线观看不卡| 久久久精品免费免费高清| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 黄片播放在线免费| 纯流量卡能插随身wifi吗| 午夜福利免费观看在线| 少妇的丰满在线观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 欧美少妇被猛烈插入视频| 啦啦啦啦在线视频资源| 大香蕉久久网| 久久久国产一区二区| 亚洲三区欧美一区| 国产在线免费精品| 亚洲欧洲日产国产| 日韩欧美国产一区二区入口| 中文字幕人妻丝袜制服| 久久国产精品人妻蜜桃| 午夜免费成人在线视频| a级毛片在线看网站| 精品少妇久久久久久888优播| 亚洲专区中文字幕在线| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 久久这里只有精品19| 色婷婷久久久亚洲欧美| 黄色视频不卡| 亚洲av男天堂| 亚洲欧美激情在线| 老司机影院毛片| 老司机午夜福利在线观看视频 | 999精品在线视频| 大陆偷拍与自拍| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 国产欧美日韩精品亚洲av| 亚洲五月婷婷丁香| 搡老乐熟女国产| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 亚洲男人天堂网一区| 日韩有码中文字幕| 不卡av一区二区三区| 午夜影院在线不卡| 国产欧美日韩一区二区精品| 咕卡用的链子| 精品乱码久久久久久99久播| 两人在一起打扑克的视频| 色播在线永久视频| 国产又爽黄色视频| 国产国语露脸激情在线看| 在线 av 中文字幕| 五月开心婷婷网| 亚洲综合色网址| 超碰97精品在线观看| 叶爱在线成人免费视频播放| svipshipincom国产片| 亚洲中文字幕日韩| 免费高清在线观看日韩| 青青草视频在线视频观看| 男女午夜视频在线观看| 免费人妻精品一区二区三区视频| 国产在视频线精品| 99re6热这里在线精品视频| 欧美黄色淫秽网站| 一边摸一边做爽爽视频免费| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| av在线app专区| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 男人添女人高潮全过程视频| 亚洲熟女精品中文字幕| 色老头精品视频在线观看| av视频免费观看在线观看| 操出白浆在线播放| 热99国产精品久久久久久7| 精品乱码久久久久久99久播| 日韩大片免费观看网站| 丝袜在线中文字幕| 麻豆av在线久日| 日日夜夜操网爽| 新久久久久国产一级毛片| 国产成人影院久久av| 免费在线观看日本一区| 一区福利在线观看| bbb黄色大片| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 日本精品一区二区三区蜜桃| 久久这里只有精品19| 亚洲专区国产一区二区| 一个人免费在线观看的高清视频 | 久久久国产欧美日韩av| 久久久国产成人免费| 又黄又粗又硬又大视频| 久久久国产精品麻豆| 亚洲国产中文字幕在线视频| 男人舔女人的私密视频| 嫁个100分男人电影在线观看| 男男h啪啪无遮挡| 国产免费av片在线观看野外av| 欧美日韩福利视频一区二区| 亚洲精品国产av成人精品| 男女床上黄色一级片免费看| 高清av免费在线| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 又大又爽又粗| 黄片播放在线免费| 亚洲精品国产区一区二| 国产在线一区二区三区精| 亚洲国产欧美网| 又黄又粗又硬又大视频| 国产又爽黄色视频| 国产91精品成人一区二区三区 | 午夜免费观看性视频| 成人亚洲精品一区在线观看| 俄罗斯特黄特色一大片| 色94色欧美一区二区| 国产成人影院久久av| 久久久国产成人免费| 老司机福利观看| 99国产精品99久久久久| 精品卡一卡二卡四卡免费| 在线观看舔阴道视频| 国产高清视频在线播放一区 | 99久久精品国产亚洲精品| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 色婷婷久久久亚洲欧美| 丝瓜视频免费看黄片| 国产又色又爽无遮挡免| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 极品人妻少妇av视频| 日日夜夜操网爽| 又黄又粗又硬又大视频| 97在线人人人人妻| 成在线人永久免费视频| 中文字幕人妻熟女乱码| 欧美大码av| 国产精品1区2区在线观看. | 中文精品一卡2卡3卡4更新| 亚洲精品在线美女| 91av网站免费观看| 精品第一国产精品| 国产成人系列免费观看| 国产成人影院久久av| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产免费av片在线观看野外av| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 又紧又爽又黄一区二区| 最近中文字幕2019免费版| 制服人妻中文乱码| 国产野战对白在线观看| a在线观看视频网站| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 欧美另类亚洲清纯唯美| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 黄片大片在线免费观看| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 99国产精品免费福利视频| 人妻久久中文字幕网| 动漫黄色视频在线观看| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 搡老乐熟女国产| 国产亚洲精品第一综合不卡| 麻豆国产av国片精品| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 美女中出高潮动态图| 精品久久久久久电影网| 久久久精品区二区三区| 亚洲欧美精品自产自拍| 精品卡一卡二卡四卡免费| 欧美午夜高清在线| 亚洲av男天堂| 国产精品久久久久久精品古装| av网站免费在线观看视频| 高潮久久久久久久久久久不卡| 免费少妇av软件| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 制服诱惑二区| 国产97色在线日韩免费| 老司机亚洲免费影院| 久久毛片免费看一区二区三区| 叶爱在线成人免费视频播放| 精品亚洲成a人片在线观看| 视频区欧美日本亚洲| 午夜福利在线观看吧| 国产人伦9x9x在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 久久久精品免费免费高清| 亚洲av欧美aⅴ国产| 亚洲精品国产一区二区精华液| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 宅男免费午夜| 欧美成狂野欧美在线观看| 日日夜夜操网爽| 丝瓜视频免费看黄片| 精品国产乱码久久久久久男人| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 亚洲精品一区蜜桃| 男女下面插进去视频免费观看| av天堂久久9| 999久久久精品免费观看国产| 国产成人精品在线电影| 婷婷丁香在线五月| a 毛片基地| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 中文字幕人妻熟女乱码| 大片免费播放器 马上看| 久久久欧美国产精品| 女人精品久久久久毛片| 精品福利观看| 一个人免费看片子| 一级,二级,三级黄色视频| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲伊人色综图| 免费观看a级毛片全部| 亚洲国产欧美网| 国产精品久久久久久精品古装| 男女下面插进去视频免费观看| 久久这里只有精品19| 看免费av毛片| 一区福利在线观看| 大陆偷拍与自拍| 夜夜夜夜夜久久久久| 欧美激情久久久久久爽电影 | 五月天丁香电影| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 两人在一起打扑克的视频| 久久国产精品影院| 国产三级黄色录像| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲中文字幕日韩| av有码第一页| 99热国产这里只有精品6| 丰满饥渴人妻一区二区三| 免费观看av网站的网址| www.熟女人妻精品国产| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 欧美精品一区二区大全| 国产有黄有色有爽视频| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 女人精品久久久久毛片| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产亚洲精品第一综合不卡| 日本91视频免费播放| 亚洲精华国产精华精| 夫妻午夜视频| 亚洲精品在线美女| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产亚洲精品久久久久5区| 黄片大片在线免费观看| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 亚洲欧美一区二区三区久久| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 欧美黄色片欧美黄色片| 亚洲七黄色美女视频| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产精品国产三级国产专区5o| 成年人免费黄色播放视频| e午夜精品久久久久久久| 水蜜桃什么品种好| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 高清视频免费观看一区二区| 黄片播放在线免费| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 国产成人欧美在线观看 | 欧美 日韩 精品 国产| 男人操女人黄网站| 成年av动漫网址| 亚洲国产av影院在线观看| 国产精品影院久久| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 久久人人97超碰香蕉20202| 精品国产乱码久久久久久小说| 久久久久久久大尺度免费视频| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 一边摸一边做爽爽视频免费| 久久性视频一级片| 蜜桃国产av成人99| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 另类精品久久| 久9热在线精品视频| 国产精品一二三区在线看| 中文欧美无线码| 超碰97精品在线观看| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产深夜福利视频在线观看| 国产成人免费观看mmmm| 日本欧美视频一区| 高清在线国产一区| 欧美黄色片欧美黄色片| 一级毛片女人18水好多| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 一级毛片女人18水好多| 国产在线免费精品| 精品久久久精品久久久| 国产福利在线免费观看视频| 久热爱精品视频在线9| 老鸭窝网址在线观看| 色老头精品视频在线观看| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 97人妻天天添夜夜摸| 亚洲人成电影观看| 一区二区三区激情视频| 亚洲美女黄色视频免费看| 国产一级毛片在线| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 丝袜喷水一区| 国产亚洲欧美精品永久| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 男女床上黄色一级片免费看| 欧美久久黑人一区二区| 深夜精品福利| 91精品伊人久久大香线蕉| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 欧美日韩一级在线毛片| 妹子高潮喷水视频| 99久久国产精品久久久| 新久久久久国产一级毛片| 老司机午夜福利在线观看视频 | 久久久水蜜桃国产精品网| 久久99热这里只频精品6学生| 90打野战视频偷拍视频| 欧美人与性动交α欧美软件| 国产福利在线免费观看视频| 国产精品国产三级国产专区5o| 一区在线观看完整版| 三上悠亚av全集在线观看| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产野战对白在线观看| 中文字幕色久视频| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| www.精华液| av视频免费观看在线观看| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 91精品三级在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 成人免费观看视频高清| 又黄又粗又硬又大视频| 色精品久久人妻99蜜桃| 欧美成人午夜精品| 热99re8久久精品国产| 午夜免费成人在线视频| 中文字幕色久视频| 午夜福利一区二区在线看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 欧美黑人欧美精品刺激| 精品国内亚洲2022精品成人 | 一个人免费看片子| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 1024香蕉在线观看| 日本av手机在线免费观看| 视频区欧美日本亚洲| 一本综合久久免费| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲三区欧美一区| 欧美日韩一级在线毛片| 国产亚洲精品第一综合不卡| 国产激情久久老熟女| 久久亚洲国产成人精品v| 黄色毛片三级朝国网站| 51午夜福利影视在线观看| 九色亚洲精品在线播放| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲精品国产av蜜桃| 成年女人毛片免费观看观看9 | 超碰97精品在线观看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 久久国产精品大桥未久av| 男人爽女人下面视频在线观看| 久久精品亚洲av国产电影网| 久久人人97超碰香蕉20202| 亚洲综合色网址| 精品乱码久久久久久99久播| 丁香六月欧美| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 曰老女人黄片| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 亚洲少妇的诱惑av| 亚洲精品国产色婷婷电影| 视频区欧美日本亚洲| 又黄又粗又硬又大视频| 国产精品成人在线| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲精品国产色婷婷电影| 久久精品人人爽人人爽视色| 日韩 亚洲 欧美在线| 69精品国产乱码久久久| 国产野战对白在线观看| 久久久精品94久久精品| 大香蕉久久网| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 视频在线观看一区二区三区| 亚洲全国av大片| 少妇的丰满在线观看| 18禁国产床啪视频网站| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲国产欧美一区二区综合| 国产亚洲一区二区精品| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| avwww免费| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 色94色欧美一区二区| 欧美日韩精品网址| 一区在线观看完整版| 天天影视国产精品| 淫妇啪啪啪对白视频 | 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 久久精品国产亚洲av高清一级| 亚洲五月色婷婷综合| 女警被强在线播放| 男女无遮挡免费网站观看| 日日夜夜操网爽| 中文字幕人妻丝袜制服| 热re99久久精品国产66热6| 桃花免费在线播放| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 9191精品国产免费久久| 免费看十八禁软件| 韩国精品一区二区三区| av网站在线播放免费| 国产伦理片在线播放av一区| av电影中文网址| 久久精品亚洲av国产电影网| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产精品一区二区在线不卡| 99国产综合亚洲精品| 国产视频一区二区在线看| 操出白浆在线播放| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 久久综合国产亚洲精品| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 性色av一级| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 久久久久久久久久久久大奶| 国产精品影院久久| www.熟女人妻精品国产| 亚洲精品美女久久av网站| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 飞空精品影院首页| 91麻豆av在线| 在线精品无人区一区二区三| 在线 av 中文字幕| 最黄视频免费看| 在线观看免费视频网站a站| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 老鸭窝网址在线观看| 在线观看www视频免费| 亚洲成国产人片在线观看| 99精品欧美一区二区三区四区| 亚洲欧美一区二区三区久久| 最新的欧美精品一区二区| 久久久国产欧美日韩av| 天堂8中文在线网| 日本a在线网址| 国产精品一二三区在线看| 婷婷丁香在线五月| 精品少妇黑人巨大在线播放| 成年人午夜在线观看视频| 操出白浆在线播放| 精品人妻在线不人妻| 99久久99久久久精品蜜桃| 麻豆av在线久日| 老熟女久久久| 精品第一国产精品| 男女下面插进去视频免费观看| 悠悠久久av| 大片电影免费在线观看免费| av有码第一页| 日韩中文字幕欧美一区二区| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 午夜福利,免费看| 免费日韩欧美在线观看| 在线观看免费午夜福利视频| 日韩精品免费视频一区二区三区| 亚洲精品av麻豆狂野| 亚洲一区二区三区欧美精品| 91成人精品电影| 精品国产乱子伦一区二区三区 | 动漫黄色视频在线观看| 欧美黄色淫秽网站| 深夜精品福利|