• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    養(yǎng)血安胎顆粒抑制外泌體中miR-16促進血管生成的作用研究

    2022-05-10 03:44:06姚偉潔杜博冉李瀟馮欣
    環(huán)球中醫(yī)藥 2022年5期
    關(guān)鍵詞:安胎含藥孔板

    姚偉潔 杜博冉 李瀟 馮欣

    血管生成參與了妊娠的全過程。血管生成伴隨著子宮和臍帶血流量增加,通過提供給胎兒充足的血液,從而促進胚胎的著床與發(fā)育[1]。血管生成異常,會導致流產(chǎn)的風險增加[2]。陳雷寧等[3]采用三維多普勒超聲發(fā)現(xiàn),復發(fā)性自然流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion,RSA)患者的子宮內(nèi)膜血管化程度與正常妊娠女性相比較顯著降低,表明血管生成異常是RSA患者的病理特征。研究表明,滋養(yǎng)層細胞功能缺陷導致的血管生成異常被認為是RSA最重要的原因之一[4]。因此,改善胎盤血管生成可以作為治療RSA的有效方法。

    中藥復方養(yǎng)血安胎顆粒是北京婦產(chǎn)醫(yī)院臨床應用30余年的院內(nèi)制劑,在臨床治療RSA中具有確切的療效[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)養(yǎng)血安胎顆粒能夠通過調(diào)節(jié)溶酶原活化物抑制因子-1治療RSA[5],而溶酶原活化物抑制因子-1是胎盤功能不全的標志,與血管生成密切相關(guān)[7]。課題組進而通過整合藥理學結(jié)合Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes富集分析發(fā)現(xiàn),養(yǎng)血安胎顆粒治療RSA與調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)信號通路密切相關(guān)[8]。VEGF對血管生成發(fā)揮促進作用,是重要的血管生長調(diào)節(jié)因子[9],但是養(yǎng)血安胎顆粒調(diào)控VEGF的機制尚缺少深入報道。研究發(fā)現(xiàn),miR-16與VEGF的3-UTR互補,進而抑制人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞和人絨毛膜癌細胞(JEG-3)中的VEGF表達,從而抑制血管生成[10]。

    研究發(fā)現(xiàn),外泌體在滋養(yǎng)層細胞與子宮各種細胞的相互作用中發(fā)揮了重要的溝通作用,從而保證了血管生成和胎盤的正常發(fā)育[11],養(yǎng)血安胎顆粒能否通過外泌體作為媒介調(diào)控VEGF以促進血管生成仍不清楚。故本實驗以養(yǎng)血安胎顆粒為治療藥物,滋養(yǎng)層細胞和人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)為研究對象,血管生成和外泌體為切入點,探討?zhàn)B血安胎顆粒調(diào)控VEGF以促進血管生成的機制。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物、實驗細胞及培養(yǎng)

    20只SD雄性大鼠,鼠齡6~8周、體質(zhì)量(200±20)g、購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,實驗動物許可證編號:SCXK(京)2016-0006。

    人絨毛膜癌細胞(JEG-3)、人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)均購自武漢普諾賽生命科技有限公司;JEG-3細胞及HUVECs均培養(yǎng)在25 cm2培養(yǎng)瓶中,使用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)基中含10%胎牛血清及1%青鏈霉素混合液,培養(yǎng)環(huán)境為37℃和5%二氧化碳的培養(yǎng)箱。

    1.2 實驗藥物

    養(yǎng)血安胎顆粒(8 g/袋,每g含生藥3.25 g),首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院制劑(批準文號:京藥制字Z20062027;產(chǎn)品批號:200301Y),由當歸417 g、白芍417 g、續(xù)斷417 g、桑寄生417 g、蓮子417 g、菟絲子500 g、山藥417 g和廣木香250 g組成,煎煮并濃縮成顆粒至1000 g。

    1.3 實驗試劑

    小鼠單克隆VEGF抗體(Santa Cruz,貨號:sc-7269),兔多克隆p-VEGFR2抗體(貨號:ab194806),兔單克隆CD9抗體(貨號:ab92726),小鼠單克隆TSG101抗體(貨號:ab83),兔多克隆Flotillin 1抗體(貨號:ab41927),小鼠單克隆β-actin抗體(貨號:ab8226),購自Abcam公司。Trizol試劑(Invitrogen,貨號:223306),TransStart Tip Green qPCR SuperMix(全式金,批號:20200105),TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(全式金,批號:20200105),高效RIPA組織/細胞裂解液(索萊寶,批號:20200305),超敏發(fā)光液(Millipore,批號:1907701),BCA蛋白定量試劑盒(博奧森,批號:20190805),CCK-8試劑盒(尚寶生物,批號:20200111),miR-16-5p mimic、NC及轉(zhuǎn)染試劑(銳博生物)。

    1.4 實驗儀器

    超速離心機(美國Beckman公司,L-80XP),實時熒光定量PCR儀(Bio-Rid,CFX96TM),PowerPacTM基礎(chǔ)電泳儀電源(Bio-Rid),Mini-PROTEAN?Tetra電泳槽(Bio-Rid),小型Trans-Blot?轉(zhuǎn)印槽(Bio-Rid),全波長酶標儀(Molecular Devices,SpectraMax Plus 384)。

    1.5 實驗方法

    1.5.1 養(yǎng)血安胎含藥血清的制備 將20只SD大鼠適應性喂養(yǎng)一周后,隨機分為2組,每組10只,分別為空白血清組和養(yǎng)血安胎血清組。其中養(yǎng)血安胎血清組每天灌胃給予6.24 g/kg的養(yǎng)血安胎溶液,空白血清組每次灌胃給予等量蒸餾水。連續(xù)給藥7天,末次給藥1小時后處死,腹主動脈取血,靜置2小時后,使用離心機在4℃,3 000r/min離心20分鐘,吸取上清液,60℃滅活處理后,通過0.22 μm的微孔濾膜除菌,隨后將血清分裝凍存?zhèn)溆肹12]。

    1.5.2 JEG-3細胞的分組與處理 將JEG-3細胞以4×103細胞/孔的數(shù)量接種于96孔板中或4×105細胞/孔的數(shù)量接種于6孔板中并放置過夜,隨后將6孔板的細胞分為4組,分別為空白對照+mimic NC組、養(yǎng)血安胎+mimic NC組、空白對照+miR-16 mimic組和養(yǎng)血安胎+miR-16 mimic組。其中空白對照+mimic NC組加入空白組血清并轉(zhuǎn)染miR-16-5p mimic NC,養(yǎng)血安胎+mimic NC組加入養(yǎng)血安胎含藥血清并轉(zhuǎn)染miR-16-5p mimic NC,空白對照+miR-16 mimic組加入空白組血清并轉(zhuǎn)染miR-16-5p mimic,養(yǎng)血安胎+miR-16 mimic組加入養(yǎng)血安胎含藥血清并轉(zhuǎn)染miR-16-5p mimic。72小時后收集細胞[13]。96孔板細胞分為空白對照組,1%養(yǎng)血安胎組、5%養(yǎng)血安胎組和10%養(yǎng)血安胎組,分別加入空白血清,1%、5%、10%含藥血清。

    1.5.3 外泌體的分離 通過差速離心法分離JEG-3細胞分泌的外泌體,具體方法為將培養(yǎng)有JEG-3細胞的培養(yǎng)基先后以300 g離心10分鐘,2 000 g離心15分鐘,10 000 g離心30分鐘,隨后吸取上清液并以70 000 g離心70分鐘2次,得到的沉淀物為外泌體。隨后使用磷酸緩沖鹽溶液溶解外泌體,用于后續(xù)實驗[14]。

    1.5.4 HUVECs的分組與外泌體共培養(yǎng) 將HUVECs以4×103細胞/孔的數(shù)量接種于96孔板中或4×105細胞/孔的數(shù)量接種于6孔板中并放置過夜,將6孔板的細胞設(shè)置空白對照+mimic NC組、養(yǎng)血安胎+mimic NC組、空白對照+miR-16 mimic組和養(yǎng)血安胎+miR-16 mimic組。按1∶40 000將HUVECs分別與相應組別JEG-3細胞分泌的外泌體共培養(yǎng)24小時[15]。96孔板細胞分組同1.5.2。

    1.6 檢測指標

    1.6.1 Cell Counting Kit-8(CCK-8)法測定JEG-3和HUVECs的活力 將96孔板中JEG-3細胞放置過夜后,加入不同濃度養(yǎng)血安胎含藥血清(分別為1%、5%、10%)分別處理JEG-3細胞24小時和48小時;將96孔板中HUVECs放置過夜后,按照步驟1.5的方法處理細胞;分別在JEG-3細胞和HUVECs每孔中加入CCK-8溶液后37℃孵育3小時,使用酶標儀在490 nm處測定吸光度值。

    1.6.2 實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)法檢測JEG-3細胞、外泌體和HUVECs中miR-16水平的變化 使用步驟1.5.2的方法處理JEG-3細胞,步驟1.5.4的方法處理HUVECs,隨后收集細胞和外泌體。采用Trizol法提取細胞和外泌體中的總RNA,然后通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA,進而通過SYBR預混系統(tǒng)和特異性引物進行RT-PCR擴增,以U6為內(nèi)參,計算2-△△Ct目的基因相對表達量,結(jié)果以倍數(shù)形式表示。引物序列見表1。

    表1 qRT-PCR引物

    1.6.3 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法檢測JEG-3細胞和HUVECs中VEGF和磷酸化血管內(nèi)皮細胞生長因子受體2(phosphorylated VEGF receptor 2,p-VEGFR2)蛋白表達及外泌體的標記蛋白的表達 使用步驟1.5.2的方法處理JEG-3細胞,步驟1.5.4的方法處理HUVECs,隨后收集細胞和外泌體。使用RIPA裂解液提取細胞中的總蛋白,并使用蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度,將蛋白加入十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝中,使用電泳分離蛋白質(zhì),隨后使用濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)將蛋白轉(zhuǎn)移至0.45 μm的PVDF膜上。使用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2小時,4℃下加入相應一抗孵育過夜,回收一抗后洗膜,加入對應二抗室溫孵育1小時,加入電化學發(fā)光試劑并在凝膠成像系統(tǒng)中形成圖像。使用Image J軟件計算樣品灰度值,計算蛋白表達,將β-actin作為內(nèi)標蛋白,結(jié)果以倍數(shù)的形式表示。一抗分別為小鼠單克隆VEGF抗體、兔多克隆p-VEGFR2抗體、兔單克隆CD9抗體、小鼠單克隆TSG101抗體、兔多克隆Flotillin 1抗體。

    1.7 數(shù)據(jù)處理

    2 結(jié)果

    2.1 養(yǎng)血安胎含藥血清對JEG-3細胞活力的影響

    結(jié)果顯示,與空白對照組、1%養(yǎng)血安胎組比較,24小時和48小時的5%和10%養(yǎng)血安胎組JEG-3細胞活力均顯著升高(P<0.05);與48小時的5%養(yǎng)血安胎組比較,48小時的10%養(yǎng)血安胎組JEG-3細胞活力進一步升高(P<0.05),表明養(yǎng)血安胎含藥血清能夠提高JEG-3細胞的細胞增殖,后續(xù)實驗選擇10%含藥血清干預JEG-3細胞48小時。見表2。

    表2 不同濃度養(yǎng)血安胎含藥血清在不同時間點對JEG-3細胞活力的影響

    2.2 外泌體分離結(jié)果

    使用超速離心法對處理后的JEG-3細胞培養(yǎng)基中外泌體進行分離,通過Western blot法對外泌體標記蛋白進行測定。結(jié)果顯示,CD9、TSG101和Flotillin1蛋白表達呈陽性,Calnexin蛋白表達陰性,表明分離得到的物質(zhì)為外泌體,且外泌體中未包含細胞碎片,純度符合標準。見圖1。

    圖1 Western blot法測定外泌體標志性蛋白的表達結(jié)果

    2.3 外泌體對HUVECs細胞活力的影響

    將外泌體與HUVECs共培養(yǎng),明確其對細胞增殖的影響。結(jié)果顯示,與空白對照+mimic NC組比較,miR-16 mimic來源的外泌體干預后,HUVECs細胞活力顯著降低(P<0.05);與空白對照+mimic NC組、空白對照+miR-16 mimic組比較,養(yǎng)血安胎來源的外泌體干預后,HUVECs細胞活力顯著升高(P<0.05),表明養(yǎng)血安胎能夠通過外泌體對HUVECs的細胞增殖進行調(diào)節(jié),其調(diào)節(jié)作用可能與外泌體中miR-16水平有關(guān)。見表3。

    表3 不同處理組細胞的外泌體對HUVECs細胞活力的影響

    2.4 養(yǎng)血安胎顆粒對JEG-3細胞、HUVECs及外泌體中miR-16的影響

    結(jié)果顯示,在JEG-3細胞中,與空白對照+mimic NC組、養(yǎng)血安胎+mimic NC組比較,轉(zhuǎn)染miR-16 mimic后,miR-16水平均顯著升高(P<0.05),表明miR-16被成功過表達。與空白對照+mimic NC組、空白對照+miR-16 mimic組比較,使用養(yǎng)血安胎干預后,miR-16水平均顯著降低(P<0.05),表明養(yǎng)血安胎含藥血清能夠抑制miR-16水平。見表4。

    在外泌體中,與空白對照+mimic NC組、養(yǎng)血安胎+mimic NC組比較,轉(zhuǎn)染miR-16 mimic后,外泌體中miR-16水平均顯著升高(P<0.05);與空白對照+mimic NC組、空白對照+miR-16 mimic組比較,使用養(yǎng)血安胎干預后,miR-16水平均顯著降低(P<0.05),表明JEG-3細胞miR-16變化能夠進一步影響其分泌的外泌體中miR-16水平。見表4。

    在HUVECs中,與空白對照+mimic NC組、養(yǎng)血安胎+mimic NC組比較,miR-16 mimic來源的外泌體干預后,HUVECs中miR-16水平均顯著升高(P<0.05);與空白對照+mimic NC組、空白對照+miR-16 mimic組比較,養(yǎng)血安胎來源的外泌體干預后,HUVECs中miR-16水平均顯著降低(P<0.05),表明外泌體與HUVECs共培養(yǎng)后,外泌體進入HUVECs中,并影響了HUVECs中miR-16水平。見表4。

    表4 養(yǎng)血安胎顆粒對不同組別細胞及JEG-3細胞分泌的外泌體中miR-16的影響

    2.5 養(yǎng)血安胎顆粒對JEG-3細胞、HUVECs中VEGF、p-VEGFR2的影響

    研究發(fā)現(xiàn),miR-16直接靶向VEGF,進而對VEGF進行負調(diào)節(jié)。本實驗結(jié)果顯示,在JEG-3細胞中,與空白對照+mimic NC組、養(yǎng)血安胎+mimic NC組比較,轉(zhuǎn)染miR-16 mimic后,JEG-3細胞中VEGF和p-VEGFR2蛋白表達均顯著降低(P<0.05),表明過表達miR-16能夠抑制VEGF的表達。與空白對照+mimic NC組、空白對照+miR-16 mimic組比較,使用養(yǎng)血安胎干預后,VEGF和p-VEGFR2蛋白表達均顯著升高(P<0.05),VEGF對血管生成發(fā)揮促進作用,表明養(yǎng)血安胎能夠增加VEGF表達以促進血管生成。見圖2、表5。

    在HUVECs中,與空白對照+mimic NC組、養(yǎng)血安胎+mimic NC組比較,miR-16 mimic來源的外泌體干預后,HUVECs中VEGF和p-VEGFR2蛋白表達均顯著降低(P<0.05);與空白對照+mimic NC組、空白對照+miR-16 mimic組比較,養(yǎng)血安胎來源的外泌體干預后,HUVECs中VEGF和p-VEGFR2蛋白表達均顯著升高(P<0.05)表明外泌體通過影響HUVECs中miR-16,進而影響血管生成。見圖2、表5。

    注:A 空白對照+ mimic NC組; B 養(yǎng)血安胎+mimic NC組; C 養(yǎng)血安胎+miR-16 mimic組; D 養(yǎng)血安胎+miR-16 mimic組。

    表5 養(yǎng)血安胎顆粒對不同組別JEG-3細胞和HUVECs中VEGF和p-VEGFR2的影響

    3 討論

    RSA在中醫(yī)學中屬“滑胎”范疇,治療的關(guān)鍵在于調(diào)補腎氣,活血化瘀。近年來,以補腎活血法治療RSA的方劑臨床療效確切,并被證明與改善血管生成相關(guān)[16-17]。養(yǎng)血安胎顆粒由菟絲子、續(xù)斷、山藥、益母草、白芍、當歸、石蓮子、桑寄生、廣木香組成,以補腎活血為治則,諸藥合用,以奏補腎健脾,養(yǎng)血安胎之功。其治療RSA可能也與改善血管生成相關(guān)[8],但目前尚未有深入的研究報道。

    VEGF是重要的血管生成的調(diào)控因子,對血管生成發(fā)揮促進作用,利于胚胎著床。在妊娠過程中,胎盤組織中能夠檢測到VEGF蛋白和mRNA的高表達,而RSA患者血清中VEGF表達則顯著降低[18]。VEGF也可通過介導VEGFR2發(fā)揮促血管生成作用,通過與VEGFR2結(jié)合,后者發(fā)生二聚化和自磷酸化,進而激活下游通路,促進細胞增殖與遷移,發(fā)揮促血管生成作用[19-21]。

    miRNA能夠通過調(diào)節(jié)相關(guān)血管生成蛋白表達進而導致RSA發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn),將miR-16注入妊娠小鼠胎盤,會導致小鼠胎盤異常,出現(xiàn)自然流產(chǎn)幾率明顯增加。此外,通過分離RSA患者的絨毛和蛻膜組織,也檢測到miR-16水平相比正常妊娠女性明顯增加,表明miR-16在RSA中發(fā)揮了重要的作用[10]。熒光素酶報告基因結(jié)果顯示,miR-16與VEGF的3-UTR互補,通過直接靶向VEGF來負調(diào)節(jié)VEGF表達,是血管生成的新型抑制劑[10]。本實驗中,為了探討?zhàn)B血安胎顆粒能否提高VEGF的表達,首先通過miR-16 mimic過表達了JEG-3細胞中miR-16水平,發(fā)現(xiàn)JEG-3細胞中VEGF蛋白表達顯著降低,也驗證了miR-16能夠抑制VEGF的表達。而養(yǎng)血安胎顆粒干預后,發(fā)現(xiàn)其能夠抑制miR-16的水平,進而增加VEGF的表達。CCK-8實驗也顯示,養(yǎng)血安胎顆粒能夠促進JEG-3細胞的增殖。以上結(jié)果表明,養(yǎng)血安胎顆粒具有增加VEGF表達,促進血管生成的作用。

    血管生成是由蛻膜化子宮內(nèi)膜細胞作用于內(nèi)皮細胞以促進其增殖,遷移和侵襲產(chǎn)生的[22]。為了進一步研究養(yǎng)血安胎顆粒如何調(diào)節(jié)血管生成,課題組分離了JEG-3細胞中的外泌體。細胞外囊泡是由真核和原核細胞釋放到細胞外空間的各種具有膜結(jié)構(gòu)的囊泡結(jié)構(gòu)統(tǒng)稱,根據(jù)直徑大小可分為外泌體、微囊泡和凋亡小體[23]。外泌體的研究目前最為廣泛,其直徑約40~100 nm,具有雙層膜結(jié)構(gòu),內(nèi)部包含多種蛋白、mRNA和miRNA等多種物質(zhì)。外泌體一旦釋放到細胞外空間,即可改變臨近細胞活性或進入體液向遠端發(fā)揮作用,通過攜帶來源細胞的蛋白質(zhì)、mRNA和miRNA至受體細胞,進而對受體細胞功能進行調(diào)控,發(fā)揮細胞通訊作用。研究發(fā)現(xiàn),外泌體能夠調(diào)節(jié)血管生成,并在胚胎植入中發(fā)揮重要的通訊作用。細胞的跨膜蛋白CD9、CD63、多泡體產(chǎn)生的蛋白Alix和TSG101以及轉(zhuǎn)膜和融合相關(guān)蛋白Flotillin 1可作為鑒定外泌體的標記物[24]。Calnexin是細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的標記蛋白,本實驗中,通過Western blot法對外泌體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標記蛋白進行測定,發(fā)現(xiàn)CD9、TSG101和Flotllin 1呈陽性表達,Calnexin蛋白呈陰性表達,表明分離得到的物質(zhì)為外泌體,且不含其他細胞成分,純度符合標準,能夠用于后續(xù)實驗。實驗結(jié)果表明,過表達JEG-3細胞中的miR-16后,其分泌的外泌體中miR-16也同樣升高;而養(yǎng)血安胎干預后,外泌體中的miR-16水平也得以降低。

    將分離的外泌體進而與HUVECs共培養(yǎng)后可觀察到HUVECs的細胞增殖與JEG-3細胞趨勢一致,表明外泌體能夠?qū)κ荏w細胞進行調(diào)控,且受源細胞的影響。檢測與外泌體共培養(yǎng)后的HUVECs中miR-16水平和VEGF的蛋白表達,結(jié)果顯示miR-16水平和VEGF的蛋白表達也均與JEG-3細胞的趨勢相同,表明JEG-3分泌的外泌體進入HUVECs后,對HUVECs的活性進行了調(diào)節(jié)。養(yǎng)血安胎顆粒則通過外泌體增加了HUVECs的VEGF表達,進而發(fā)揮了促血管生成作用。

    綜上,養(yǎng)血安胎顆粒抑制JEG-3細胞外泌體中miR-16水平,進一步抑制HUVECs中的miR-16水平,進而增加HUVECs中VEGF和VEGFR2的蛋白表達,促進血管生成。

    猜你喜歡
    安胎含藥孔板
    核電廠高壓安注系統(tǒng)再循環(huán)管線節(jié)流孔板的分析與改進
    消癥安胎湯聯(lián)合西藥在早期復發(fā)性流產(chǎn)患者中的應用效果
    和胃安胎飲輔助治療妊娠劇吐的臨床觀察
    急救含藥姿勢要正確
    限流孔板的計算與應用
    廣州化工(2020年6期)2020-04-18 03:30:20
    補腎安胎飲對腎虛型不明原因復發(fā)性流產(chǎn)患者的臨床療效
    中成藥(2019年12期)2020-01-04 02:03:12
    乳病消片含藥血清對MCF-7細胞增殖的抑制作用
    中成藥(2018年10期)2018-10-26 03:40:44
    長距離礦漿管道系統(tǒng)中消能孔板的運行優(yōu)化
    固腎安胎丸聯(lián)合低分子肝素干預復發(fā)性流產(chǎn)婦女血栓前狀態(tài)的療效
    中成藥(2017年12期)2018-01-19 02:06:29
    氣田集輸站場火災泄壓放空限流孔板計算解析
    91精品一卡2卡3卡4卡| 免费在线观看成人毛片| 亚洲人与动物交配视频| 欧美zozozo另类| 99热这里只有是精品在线观看| 水蜜桃什么品种好| 欧美xxxx性猛交bbbb| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产日韩欧美在线精品| 亚洲av成人精品一区久久| 国产精品国产av在线观看| 久久精品国产亚洲av涩爱| 亚洲欧美精品自产自拍| 精华霜和精华液先用哪个| 国产av不卡久久| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 成人亚洲精品av一区二区| 久久久精品免费免费高清| 国产男女超爽视频在线观看| 2022亚洲国产成人精品| 最近最新中文字幕免费大全7| 欧美激情久久久久久爽电影| 久久久久久久久久人人人人人人| 国产真实伦视频高清在线观看| 日日撸夜夜添| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 丰满少妇做爰视频| 乱系列少妇在线播放| 久久精品国产a三级三级三级| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 最近最新中文字幕大全电影3| 国产综合懂色| 日本一本二区三区精品| 丝袜喷水一区| 亚洲三级黄色毛片| 国产探花在线观看一区二区| 免费人成在线观看视频色| 天堂网av新在线| 国产高清三级在线| 日韩视频在线欧美| 国产免费又黄又爽又色| 夜夜爽夜夜爽视频| 国产毛片在线视频| 国产成人精品福利久久| 亚洲国产高清在线一区二区三| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国产av国产精品国产| 婷婷色av中文字幕| 白带黄色成豆腐渣| 美女国产视频在线观看| 成年人午夜在线观看视频| 精品一区二区三卡| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 在线观看美女被高潮喷水网站| 秋霞在线观看毛片| 精品少妇黑人巨大在线播放| 亚洲美女视频黄频| 男插女下体视频免费在线播放| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 日本-黄色视频高清免费观看| 丰满人妻一区二区三区视频av| 一区二区三区乱码不卡18| 直男gayav资源| 亚洲经典国产精华液单| 精品熟女少妇av免费看| 亚洲精品乱久久久久久| 在线免费观看不下载黄p国产| 少妇的逼水好多| 久久久亚洲精品成人影院| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产片特级美女逼逼视频| 国产色婷婷99| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 久久久久久久精品精品| 亚洲国产精品国产精品| 在线看a的网站| 午夜激情久久久久久久| 国产精品一二三区在线看| 在线播放无遮挡| 国产亚洲5aaaaa淫片| 国产视频首页在线观看| 特大巨黑吊av在线直播| 欧美三级亚洲精品| 国国产精品蜜臀av免费| 一级黄片播放器| 18+在线观看网站| 久久久午夜欧美精品| 亚洲精品国产成人久久av| 三级国产精品片| 91狼人影院| 91aial.com中文字幕在线观看| 视频中文字幕在线观看| 丝瓜视频免费看黄片| 波野结衣二区三区在线| 国产成年人精品一区二区| 国产精品熟女久久久久浪| 成人一区二区视频在线观看| 91aial.com中文字幕在线观看| 最近中文字幕高清免费大全6| 如何舔出高潮| 五月开心婷婷网| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 天天躁日日操中文字幕| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 身体一侧抽搐| 成人特级av手机在线观看| 日韩一区二区三区影片| 看十八女毛片水多多多| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 国产精品一区二区性色av| 一级片'在线观看视频| 日韩亚洲欧美综合| 久久久欧美国产精品| 国产亚洲5aaaaa淫片| 校园人妻丝袜中文字幕| 男女那种视频在线观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 久久97久久精品| 内地一区二区视频在线| 在线看a的网站| 丰满乱子伦码专区| 美女高潮的动态| 国产成人精品福利久久| 色吧在线观看| 国产精品国产三级国产专区5o| 欧美+日韩+精品| 日韩中字成人| 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲在线观看片| 22中文网久久字幕| 国产av国产精品国产| 97在线人人人人妻| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 国产精品女同一区二区软件| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 成人毛片60女人毛片免费| 欧美国产精品一级二级三级 | 亚洲最大成人手机在线| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 免费观看a级毛片全部| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产又色又爽无遮挡免| 久久久成人免费电影| 国产老妇伦熟女老妇高清| 赤兔流量卡办理| 亚洲成人精品中文字幕电影| 亚洲最大成人手机在线| 亚洲欧美日韩东京热| 久久久久久久久大av| 国产成人a∨麻豆精品| av在线app专区| 人妻夜夜爽99麻豆av| 九色成人免费人妻av| 国产乱来视频区| 国产毛片a区久久久久| 国产精品久久久久久精品电影| 国产淫片久久久久久久久| 97超碰精品成人国产| 最新中文字幕久久久久| 国产成人aa在线观看| 91狼人影院| 久久99热这里只有精品18| 国内精品宾馆在线| 久久久久国产网址| 精品久久久久久久久av| 亚洲人成网站在线播| 全区人妻精品视频| 亚洲最大成人av| 晚上一个人看的免费电影| 色网站视频免费| 日韩av免费高清视频| 欧美丝袜亚洲另类| 日本免费在线观看一区| 视频中文字幕在线观看| 成人一区二区视频在线观看| 亚洲欧洲国产日韩| 国产中年淑女户外野战色| 亚洲欧洲国产日韩| 国产亚洲av嫩草精品影院| 联通29元200g的流量卡| 亚洲熟女精品中文字幕| 最后的刺客免费高清国语| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 最新中文字幕久久久久| 少妇熟女欧美另类| 欧美最新免费一区二区三区| 激情 狠狠 欧美| 亚洲人成网站在线播| 成人毛片60女人毛片免费| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 老司机影院毛片| 丰满乱子伦码专区| 国产高清三级在线| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 亚洲人与动物交配视频| 高清午夜精品一区二区三区| 久久久久久久午夜电影| 又爽又黄a免费视频| 国产乱人视频| 高清欧美精品videossex| 另类亚洲欧美激情| 黑人高潮一二区| 99热这里只有是精品在线观看| 国产老妇女一区| 国国产精品蜜臀av免费| 国产色爽女视频免费观看| 亚洲精品亚洲一区二区| 亚洲国产最新在线播放| 一个人看视频在线观看www免费| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 韩国av在线不卡| 国产av码专区亚洲av| 国产高清国产精品国产三级 | 国产精品一区二区在线观看99| 一边亲一边摸免费视频| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 免费观看a级毛片全部| 久久久色成人| 亚洲色图av天堂| 亚洲国产欧美人成| 国产高清三级在线| 草草在线视频免费看| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产av码专区亚洲av| 深爱激情五月婷婷| 成年女人在线观看亚洲视频 | 精品一区二区三卡| 日日撸夜夜添| 久久久久久久国产电影| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 色播亚洲综合网| 日韩一区二区视频免费看| 欧美bdsm另类| 国产视频内射| 成人毛片a级毛片在线播放| 亚洲,一卡二卡三卡| 中文字幕久久专区| 成人国产av品久久久| 91久久精品电影网| 亚洲国产精品成人综合色| 99久久精品一区二区三区| 日本wwww免费看| a级毛色黄片| 亚洲欧美精品自产自拍| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 中文欧美无线码| 国产亚洲av嫩草精品影院| 不卡视频在线观看欧美| 亚洲精品国产成人久久av| videos熟女内射| 久久国产乱子免费精品| 午夜激情福利司机影院| 欧美精品一区二区大全| 高清欧美精品videossex| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 超碰av人人做人人爽久久| 天堂网av新在线| 又大又黄又爽视频免费| 干丝袜人妻中文字幕| 麻豆久久精品国产亚洲av| 毛片一级片免费看久久久久| 久久鲁丝午夜福利片| 夫妻午夜视频| 国产探花在线观看一区二区| 国产一区亚洲一区在线观看| 亚洲精品一区蜜桃| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产精品99久久99久久久不卡 | 少妇人妻精品综合一区二区| 大话2 男鬼变身卡| 一级毛片我不卡| 高清视频免费观看一区二区| 男女国产视频网站| 国产色婷婷99| 日韩三级伦理在线观看| 国产综合懂色| 久久久久久伊人网av| 如何舔出高潮| 成人黄色视频免费在线看| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产免费福利视频在线观看| 能在线免费看毛片的网站| 一个人看视频在线观看www免费| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 成人特级av手机在线观看| tube8黄色片| 26uuu在线亚洲综合色| 国产精品99久久99久久久不卡 | 晚上一个人看的免费电影| 五月开心婷婷网| 国产高潮美女av| 国产男人的电影天堂91| 日韩免费高清中文字幕av| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 夫妻性生交免费视频一级片| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 一区二区三区四区激情视频| 美女视频免费永久观看网站| 免费大片黄手机在线观看| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 最近中文字幕高清免费大全6| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产一区二区在线观看日韩| 国产一级毛片在线| 中文欧美无线码| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 我要看日韩黄色一级片| 国产精品人妻久久久久久| 国产av不卡久久| av在线老鸭窝| 亚洲自偷自拍三级| 久久久a久久爽久久v久久| 国产精品av视频在线免费观看| 一级av片app| 日韩av不卡免费在线播放| 免费观看的影片在线观看| 成人免费观看视频高清| 男男h啪啪无遮挡| 国产一区二区三区综合在线观看 | 啦啦啦啦在线视频资源| 黄片无遮挡物在线观看| 美女高潮的动态| 婷婷色麻豆天堂久久| 精品一区二区三区视频在线| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 久久这里有精品视频免费| 日韩大片免费观看网站| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 婷婷色综合大香蕉| 欧美3d第一页| 深夜a级毛片| 青春草国产在线视频| 成人毛片a级毛片在线播放| 久久国内精品自在自线图片| 永久网站在线| 春色校园在线视频观看| 全区人妻精品视频| 国产精品熟女久久久久浪| 高清午夜精品一区二区三区| 99久久精品国产国产毛片| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 午夜激情久久久久久久| 国产淫语在线视频| 国产男女内射视频| 午夜视频国产福利| 久久久精品欧美日韩精品| 久热这里只有精品99| 日韩av免费高清视频| 国产免费又黄又爽又色| 一边亲一边摸免费视频| 人妻 亚洲 视频| 国产成人精品婷婷| 亚洲丝袜综合中文字幕| 国国产精品蜜臀av免费| 97超碰精品成人国产| 亚洲精品国产成人久久av| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产精品爽爽va在线观看网站| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 我要看日韩黄色一级片| 中文资源天堂在线| 久久99热这里只频精品6学生| 色5月婷婷丁香| 久久久精品欧美日韩精品| 国产精品人妻久久久久久| 丰满乱子伦码专区| 亚洲国产精品999| 亚洲最大成人av| 免费av观看视频| 久久久精品欧美日韩精品| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 国产精品女同一区二区软件| 不卡视频在线观看欧美| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | av女优亚洲男人天堂| 亚洲av日韩在线播放| 国产精品嫩草影院av在线观看| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产精品99久久99久久久不卡 | 欧美高清性xxxxhd video| 亚洲熟女精品中文字幕| 免费黄网站久久成人精品| 99热国产这里只有精品6| 99热这里只有精品一区| 日本wwww免费看| 亚洲国产精品国产精品| 国产精品人妻久久久影院| 久久久久久久亚洲中文字幕| 久久人人爽人人爽人人片va| 秋霞伦理黄片| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 91狼人影院| 日本爱情动作片www.在线观看| 黄色配什么色好看| 美女内射精品一级片tv| 在线天堂最新版资源| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 在线天堂最新版资源| 大香蕉97超碰在线| 午夜福利高清视频| 韩国高清视频一区二区三区| 看非洲黑人一级黄片| 丝瓜视频免费看黄片| 久久久久久伊人网av| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 777米奇影视久久| 成人综合一区亚洲| 91久久精品国产一区二区三区| 午夜免费男女啪啪视频观看| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 国产一区二区在线观看日韩| av黄色大香蕉| xxx大片免费视频| 男人添女人高潮全过程视频| 国产高清国产精品国产三级 | 亚洲熟女精品中文字幕| 直男gayav资源| 色吧在线观看| 久久久精品免费免费高清| 在线观看国产h片| 特级一级黄色大片| 久久韩国三级中文字幕| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产淫片久久久久久久久| 亚洲精品亚洲一区二区| 国产v大片淫在线免费观看| 一区二区av电影网| 午夜精品一区二区三区免费看| 国产成人福利小说| 麻豆成人av视频| 91久久精品国产一区二区成人| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 一本久久精品| 交换朋友夫妻互换小说| 欧美丝袜亚洲另类| 又大又黄又爽视频免费| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产视频首页在线观看| 欧美激情久久久久久爽电影| 高清欧美精品videossex| 欧美精品一区二区大全| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产免费福利视频在线观看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲精品aⅴ在线观看| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲熟女精品中文字幕| 伊人久久国产一区二区| xxx大片免费视频| 人人妻人人看人人澡| 欧美一区二区亚洲| 三级经典国产精品| 美女cb高潮喷水在线观看| 成人毛片60女人毛片免费| 韩国av在线不卡| 日韩中字成人| 联通29元200g的流量卡| 国产精品精品国产色婷婷| 不卡视频在线观看欧美| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产高潮美女av| 久久精品久久久久久久性| 国内揄拍国产精品人妻在线| 亚洲在线观看片| 激情 狠狠 欧美| 看免费成人av毛片| 免费观看的影片在线观看| 日韩av不卡免费在线播放| 国产精品久久久久久精品古装| 99久久精品热视频| 亚洲丝袜综合中文字幕| 精品少妇久久久久久888优播| 波野结衣二区三区在线| 亚洲国产精品成人久久小说| 欧美日韩视频精品一区| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产精品三级大全| 看免费成人av毛片| 99久国产av精品国产电影| 午夜福利在线在线| 成人亚洲精品av一区二区| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 成年女人在线观看亚洲视频 | 99视频精品全部免费 在线| 国产精品一区www在线观看| 国产精品偷伦视频观看了| 久久精品国产亚洲av天美| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 免费人成在线观看视频色| 偷拍熟女少妇极品色| 黄色日韩在线| 亚洲国产色片| 欧美日韩在线观看h| videos熟女内射| 男女国产视频网站| 久久久久久久久久久免费av| 简卡轻食公司| 国产一区二区在线观看日韩| 欧美一级a爱片免费观看看| 听说在线观看完整版免费高清| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 97热精品久久久久久| 亚洲色图av天堂| av卡一久久| 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲高清免费不卡视频| 免费av不卡在线播放| 搡老乐熟女国产| 久久久精品免费免费高清| 国产亚洲最大av| 久久亚洲国产成人精品v| 青青草视频在线视频观看| 十八禁网站网址无遮挡 | av专区在线播放| 欧美精品国产亚洲| 国产成人精品一,二区| 各种免费的搞黄视频| 高清在线视频一区二区三区| 亚洲av成人精品一二三区| 国产精品蜜桃在线观看| 3wmmmm亚洲av在线观看| 嘟嘟电影网在线观看| 国产精品国产三级专区第一集| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产乱人视频| 免费黄色在线免费观看| 久久久午夜欧美精品| 国产视频内射| 日本与韩国留学比较| 成年免费大片在线观看| 国产黄频视频在线观看| 婷婷色av中文字幕| 五月伊人婷婷丁香| 亚洲人成网站在线播| 亚洲怡红院男人天堂| 国产大屁股一区二区在线视频| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 国产综合懂色| 国产成人精品婷婷| 可以在线观看毛片的网站| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 看黄色毛片网站| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 日本-黄色视频高清免费观看| 最近手机中文字幕大全| 一区二区三区精品91| 新久久久久国产一级毛片| 中国国产av一级| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 女人被狂操c到高潮| xxx大片免费视频| 亚洲最大成人中文| 精品一区二区三区视频在线| 99热国产这里只有精品6| 久热这里只有精品99| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 国产黄色免费在线视频| 又爽又黄a免费视频| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国产成人一区二区在线| 久久久色成人| 日韩精品有码人妻一区| a级一级毛片免费在线观看| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 亚洲一区二区三区欧美精品 | 搡老乐熟女国产| 高清午夜精品一区二区三区| 男人狂女人下面高潮的视频| 高清av免费在线| 亚洲经典国产精华液单| 国产精品国产三级国产专区5o| 亚洲精品乱久久久久久| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 国产人妻一区二区三区在| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 91精品一卡2卡3卡4卡| 国产亚洲av嫩草精品影院| 日本午夜av视频| 日韩电影二区| 91精品伊人久久大香线蕉| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产综合懂色| 亚洲色图综合在线观看| 男女边摸边吃奶| 最近最新中文字幕大全电影3| 嫩草影院新地址| 中文字幕av成人在线电影| 乱码一卡2卡4卡精品| 在线观看美女被高潮喷水网站| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 啦啦啦啦在线视频资源| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 色视频www国产| 国产男人的电影天堂91| 国产黄片美女视频| 国产精品国产三级国产专区5o| 五月玫瑰六月丁香| 成人亚洲精品一区在线观看 | 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 黄色怎么调成土黄色| av网站免费在线观看视频| 亚洲av在线观看美女高潮| 午夜亚洲福利在线播放| 国产爱豆传媒在线观看| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 啦啦啦中文免费视频观看日本|