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    養(yǎng)血安胎顆粒抑制外泌體中miR-16促進血管生成的作用研究

    2022-05-10 03:44:06姚偉潔杜博冉李瀟馮欣
    環(huán)球中醫(yī)藥 2022年5期
    關(guān)鍵詞:安胎含藥孔板

    姚偉潔 杜博冉 李瀟 馮欣

    血管生成參與了妊娠的全過程。血管生成伴隨著子宮和臍帶血流量增加,通過提供給胎兒充足的血液,從而促進胚胎的著床與發(fā)育[1]。血管生成異常,會導致流產(chǎn)的風險增加[2]。陳雷寧等[3]采用三維多普勒超聲發(fā)現(xiàn),復發(fā)性自然流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion,RSA)患者的子宮內(nèi)膜血管化程度與正常妊娠女性相比較顯著降低,表明血管生成異常是RSA患者的病理特征。研究表明,滋養(yǎng)層細胞功能缺陷導致的血管生成異常被認為是RSA最重要的原因之一[4]。因此,改善胎盤血管生成可以作為治療RSA的有效方法。

    中藥復方養(yǎng)血安胎顆粒是北京婦產(chǎn)醫(yī)院臨床應用30余年的院內(nèi)制劑,在臨床治療RSA中具有確切的療效[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)養(yǎng)血安胎顆粒能夠通過調(diào)節(jié)溶酶原活化物抑制因子-1治療RSA[5],而溶酶原活化物抑制因子-1是胎盤功能不全的標志,與血管生成密切相關(guān)[7]。課題組進而通過整合藥理學結(jié)合Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes富集分析發(fā)現(xiàn),養(yǎng)血安胎顆粒治療RSA與調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)信號通路密切相關(guān)[8]。VEGF對血管生成發(fā)揮促進作用,是重要的血管生長調(diào)節(jié)因子[9],但是養(yǎng)血安胎顆粒調(diào)控VEGF的機制尚缺少深入報道。研究發(fā)現(xiàn),miR-16與VEGF的3-UTR互補,進而抑制人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞和人絨毛膜癌細胞(JEG-3)中的VEGF表達,從而抑制血管生成[10]。

    研究發(fā)現(xiàn),外泌體在滋養(yǎng)層細胞與子宮各種細胞的相互作用中發(fā)揮了重要的溝通作用,從而保證了血管生成和胎盤的正常發(fā)育[11],養(yǎng)血安胎顆粒能否通過外泌體作為媒介調(diào)控VEGF以促進血管生成仍不清楚。故本實驗以養(yǎng)血安胎顆粒為治療藥物,滋養(yǎng)層細胞和人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)為研究對象,血管生成和外泌體為切入點,探討?zhàn)B血安胎顆粒調(diào)控VEGF以促進血管生成的機制。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物、實驗細胞及培養(yǎng)

    20只SD雄性大鼠,鼠齡6~8周、體質(zhì)量(200±20)g、購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,實驗動物許可證編號:SCXK(京)2016-0006。

    人絨毛膜癌細胞(JEG-3)、人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)均購自武漢普諾賽生命科技有限公司;JEG-3細胞及HUVECs均培養(yǎng)在25 cm2培養(yǎng)瓶中,使用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)基中含10%胎牛血清及1%青鏈霉素混合液,培養(yǎng)環(huán)境為37℃和5%二氧化碳的培養(yǎng)箱。

    1.2 實驗藥物

    養(yǎng)血安胎顆粒(8 g/袋,每g含生藥3.25 g),首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院制劑(批準文號:京藥制字Z20062027;產(chǎn)品批號:200301Y),由當歸417 g、白芍417 g、續(xù)斷417 g、桑寄生417 g、蓮子417 g、菟絲子500 g、山藥417 g和廣木香250 g組成,煎煮并濃縮成顆粒至1000 g。

    1.3 實驗試劑

    小鼠單克隆VEGF抗體(Santa Cruz,貨號:sc-7269),兔多克隆p-VEGFR2抗體(貨號:ab194806),兔單克隆CD9抗體(貨號:ab92726),小鼠單克隆TSG101抗體(貨號:ab83),兔多克隆Flotillin 1抗體(貨號:ab41927),小鼠單克隆β-actin抗體(貨號:ab8226),購自Abcam公司。Trizol試劑(Invitrogen,貨號:223306),TransStart Tip Green qPCR SuperMix(全式金,批號:20200105),TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(全式金,批號:20200105),高效RIPA組織/細胞裂解液(索萊寶,批號:20200305),超敏發(fā)光液(Millipore,批號:1907701),BCA蛋白定量試劑盒(博奧森,批號:20190805),CCK-8試劑盒(尚寶生物,批號:20200111),miR-16-5p mimic、NC及轉(zhuǎn)染試劑(銳博生物)。

    1.4 實驗儀器

    超速離心機(美國Beckman公司,L-80XP),實時熒光定量PCR儀(Bio-Rid,CFX96TM),PowerPacTM基礎(chǔ)電泳儀電源(Bio-Rid),Mini-PROTEAN?Tetra電泳槽(Bio-Rid),小型Trans-Blot?轉(zhuǎn)印槽(Bio-Rid),全波長酶標儀(Molecular Devices,SpectraMax Plus 384)。

    1.5 實驗方法

    1.5.1 養(yǎng)血安胎含藥血清的制備 將20只SD大鼠適應性喂養(yǎng)一周后,隨機分為2組,每組10只,分別為空白血清組和養(yǎng)血安胎血清組。其中養(yǎng)血安胎血清組每天灌胃給予6.24 g/kg的養(yǎng)血安胎溶液,空白血清組每次灌胃給予等量蒸餾水。連續(xù)給藥7天,末次給藥1小時后處死,腹主動脈取血,靜置2小時后,使用離心機在4℃,3 000r/min離心20分鐘,吸取上清液,60℃滅活處理后,通過0.22 μm的微孔濾膜除菌,隨后將血清分裝凍存?zhèn)溆肹12]。

    1.5.2 JEG-3細胞的分組與處理 將JEG-3細胞以4×103細胞/孔的數(shù)量接種于96孔板中或4×105細胞/孔的數(shù)量接種于6孔板中并放置過夜,隨后將6孔板的細胞分為4組,分別為空白對照+mimic NC組、養(yǎng)血安胎+mimic NC組、空白對照+miR-16 mimic組和養(yǎng)血安胎+miR-16 mimic組。其中空白對照+mimic NC組加入空白組血清并轉(zhuǎn)染miR-16-5p mimic NC,養(yǎng)血安胎+mimic NC組加入養(yǎng)血安胎含藥血清并轉(zhuǎn)染miR-16-5p mimic NC,空白對照+miR-16 mimic組加入空白組血清并轉(zhuǎn)染miR-16-5p mimic,養(yǎng)血安胎+miR-16 mimic組加入養(yǎng)血安胎含藥血清并轉(zhuǎn)染miR-16-5p mimic。72小時后收集細胞[13]。96孔板細胞分為空白對照組,1%養(yǎng)血安胎組、5%養(yǎng)血安胎組和10%養(yǎng)血安胎組,分別加入空白血清,1%、5%、10%含藥血清。

    1.5.3 外泌體的分離 通過差速離心法分離JEG-3細胞分泌的外泌體,具體方法為將培養(yǎng)有JEG-3細胞的培養(yǎng)基先后以300 g離心10分鐘,2 000 g離心15分鐘,10 000 g離心30分鐘,隨后吸取上清液并以70 000 g離心70分鐘2次,得到的沉淀物為外泌體。隨后使用磷酸緩沖鹽溶液溶解外泌體,用于后續(xù)實驗[14]。

    1.5.4 HUVECs的分組與外泌體共培養(yǎng) 將HUVECs以4×103細胞/孔的數(shù)量接種于96孔板中或4×105細胞/孔的數(shù)量接種于6孔板中并放置過夜,將6孔板的細胞設(shè)置空白對照+mimic NC組、養(yǎng)血安胎+mimic NC組、空白對照+miR-16 mimic組和養(yǎng)血安胎+miR-16 mimic組。按1∶40 000將HUVECs分別與相應組別JEG-3細胞分泌的外泌體共培養(yǎng)24小時[15]。96孔板細胞分組同1.5.2。

    1.6 檢測指標

    1.6.1 Cell Counting Kit-8(CCK-8)法測定JEG-3和HUVECs的活力 將96孔板中JEG-3細胞放置過夜后,加入不同濃度養(yǎng)血安胎含藥血清(分別為1%、5%、10%)分別處理JEG-3細胞24小時和48小時;將96孔板中HUVECs放置過夜后,按照步驟1.5的方法處理細胞;分別在JEG-3細胞和HUVECs每孔中加入CCK-8溶液后37℃孵育3小時,使用酶標儀在490 nm處測定吸光度值。

    1.6.2 實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)法檢測JEG-3細胞、外泌體和HUVECs中miR-16水平的變化 使用步驟1.5.2的方法處理JEG-3細胞,步驟1.5.4的方法處理HUVECs,隨后收集細胞和外泌體。采用Trizol法提取細胞和外泌體中的總RNA,然后通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA,進而通過SYBR預混系統(tǒng)和特異性引物進行RT-PCR擴增,以U6為內(nèi)參,計算2-△△Ct目的基因相對表達量,結(jié)果以倍數(shù)形式表示。引物序列見表1。

    表1 qRT-PCR引物

    1.6.3 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法檢測JEG-3細胞和HUVECs中VEGF和磷酸化血管內(nèi)皮細胞生長因子受體2(phosphorylated VEGF receptor 2,p-VEGFR2)蛋白表達及外泌體的標記蛋白的表達 使用步驟1.5.2的方法處理JEG-3細胞,步驟1.5.4的方法處理HUVECs,隨后收集細胞和外泌體。使用RIPA裂解液提取細胞中的總蛋白,并使用蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度,將蛋白加入十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝中,使用電泳分離蛋白質(zhì),隨后使用濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)將蛋白轉(zhuǎn)移至0.45 μm的PVDF膜上。使用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2小時,4℃下加入相應一抗孵育過夜,回收一抗后洗膜,加入對應二抗室溫孵育1小時,加入電化學發(fā)光試劑并在凝膠成像系統(tǒng)中形成圖像。使用Image J軟件計算樣品灰度值,計算蛋白表達,將β-actin作為內(nèi)標蛋白,結(jié)果以倍數(shù)的形式表示。一抗分別為小鼠單克隆VEGF抗體、兔多克隆p-VEGFR2抗體、兔單克隆CD9抗體、小鼠單克隆TSG101抗體、兔多克隆Flotillin 1抗體。

    1.7 數(shù)據(jù)處理

    2 結(jié)果

    2.1 養(yǎng)血安胎含藥血清對JEG-3細胞活力的影響

    結(jié)果顯示,與空白對照組、1%養(yǎng)血安胎組比較,24小時和48小時的5%和10%養(yǎng)血安胎組JEG-3細胞活力均顯著升高(P<0.05);與48小時的5%養(yǎng)血安胎組比較,48小時的10%養(yǎng)血安胎組JEG-3細胞活力進一步升高(P<0.05),表明養(yǎng)血安胎含藥血清能夠提高JEG-3細胞的細胞增殖,后續(xù)實驗選擇10%含藥血清干預JEG-3細胞48小時。見表2。

    表2 不同濃度養(yǎng)血安胎含藥血清在不同時間點對JEG-3細胞活力的影響

    2.2 外泌體分離結(jié)果

    使用超速離心法對處理后的JEG-3細胞培養(yǎng)基中外泌體進行分離,通過Western blot法對外泌體標記蛋白進行測定。結(jié)果顯示,CD9、TSG101和Flotillin1蛋白表達呈陽性,Calnexin蛋白表達陰性,表明分離得到的物質(zhì)為外泌體,且外泌體中未包含細胞碎片,純度符合標準。見圖1。

    圖1 Western blot法測定外泌體標志性蛋白的表達結(jié)果

    2.3 外泌體對HUVECs細胞活力的影響

    將外泌體與HUVECs共培養(yǎng),明確其對細胞增殖的影響。結(jié)果顯示,與空白對照+mimic NC組比較,miR-16 mimic來源的外泌體干預后,HUVECs細胞活力顯著降低(P<0.05);與空白對照+mimic NC組、空白對照+miR-16 mimic組比較,養(yǎng)血安胎來源的外泌體干預后,HUVECs細胞活力顯著升高(P<0.05),表明養(yǎng)血安胎能夠通過外泌體對HUVECs的細胞增殖進行調(diào)節(jié),其調(diào)節(jié)作用可能與外泌體中miR-16水平有關(guān)。見表3。

    表3 不同處理組細胞的外泌體對HUVECs細胞活力的影響

    2.4 養(yǎng)血安胎顆粒對JEG-3細胞、HUVECs及外泌體中miR-16的影響

    結(jié)果顯示,在JEG-3細胞中,與空白對照+mimic NC組、養(yǎng)血安胎+mimic NC組比較,轉(zhuǎn)染miR-16 mimic后,miR-16水平均顯著升高(P<0.05),表明miR-16被成功過表達。與空白對照+mimic NC組、空白對照+miR-16 mimic組比較,使用養(yǎng)血安胎干預后,miR-16水平均顯著降低(P<0.05),表明養(yǎng)血安胎含藥血清能夠抑制miR-16水平。見表4。

    在外泌體中,與空白對照+mimic NC組、養(yǎng)血安胎+mimic NC組比較,轉(zhuǎn)染miR-16 mimic后,外泌體中miR-16水平均顯著升高(P<0.05);與空白對照+mimic NC組、空白對照+miR-16 mimic組比較,使用養(yǎng)血安胎干預后,miR-16水平均顯著降低(P<0.05),表明JEG-3細胞miR-16變化能夠進一步影響其分泌的外泌體中miR-16水平。見表4。

    在HUVECs中,與空白對照+mimic NC組、養(yǎng)血安胎+mimic NC組比較,miR-16 mimic來源的外泌體干預后,HUVECs中miR-16水平均顯著升高(P<0.05);與空白對照+mimic NC組、空白對照+miR-16 mimic組比較,養(yǎng)血安胎來源的外泌體干預后,HUVECs中miR-16水平均顯著降低(P<0.05),表明外泌體與HUVECs共培養(yǎng)后,外泌體進入HUVECs中,并影響了HUVECs中miR-16水平。見表4。

    表4 養(yǎng)血安胎顆粒對不同組別細胞及JEG-3細胞分泌的外泌體中miR-16的影響

    2.5 養(yǎng)血安胎顆粒對JEG-3細胞、HUVECs中VEGF、p-VEGFR2的影響

    研究發(fā)現(xiàn),miR-16直接靶向VEGF,進而對VEGF進行負調(diào)節(jié)。本實驗結(jié)果顯示,在JEG-3細胞中,與空白對照+mimic NC組、養(yǎng)血安胎+mimic NC組比較,轉(zhuǎn)染miR-16 mimic后,JEG-3細胞中VEGF和p-VEGFR2蛋白表達均顯著降低(P<0.05),表明過表達miR-16能夠抑制VEGF的表達。與空白對照+mimic NC組、空白對照+miR-16 mimic組比較,使用養(yǎng)血安胎干預后,VEGF和p-VEGFR2蛋白表達均顯著升高(P<0.05),VEGF對血管生成發(fā)揮促進作用,表明養(yǎng)血安胎能夠增加VEGF表達以促進血管生成。見圖2、表5。

    在HUVECs中,與空白對照+mimic NC組、養(yǎng)血安胎+mimic NC組比較,miR-16 mimic來源的外泌體干預后,HUVECs中VEGF和p-VEGFR2蛋白表達均顯著降低(P<0.05);與空白對照+mimic NC組、空白對照+miR-16 mimic組比較,養(yǎng)血安胎來源的外泌體干預后,HUVECs中VEGF和p-VEGFR2蛋白表達均顯著升高(P<0.05)表明外泌體通過影響HUVECs中miR-16,進而影響血管生成。見圖2、表5。

    注:A 空白對照+ mimic NC組; B 養(yǎng)血安胎+mimic NC組; C 養(yǎng)血安胎+miR-16 mimic組; D 養(yǎng)血安胎+miR-16 mimic組。

    表5 養(yǎng)血安胎顆粒對不同組別JEG-3細胞和HUVECs中VEGF和p-VEGFR2的影響

    3 討論

    RSA在中醫(yī)學中屬“滑胎”范疇,治療的關(guān)鍵在于調(diào)補腎氣,活血化瘀。近年來,以補腎活血法治療RSA的方劑臨床療效確切,并被證明與改善血管生成相關(guān)[16-17]。養(yǎng)血安胎顆粒由菟絲子、續(xù)斷、山藥、益母草、白芍、當歸、石蓮子、桑寄生、廣木香組成,以補腎活血為治則,諸藥合用,以奏補腎健脾,養(yǎng)血安胎之功。其治療RSA可能也與改善血管生成相關(guān)[8],但目前尚未有深入的研究報道。

    VEGF是重要的血管生成的調(diào)控因子,對血管生成發(fā)揮促進作用,利于胚胎著床。在妊娠過程中,胎盤組織中能夠檢測到VEGF蛋白和mRNA的高表達,而RSA患者血清中VEGF表達則顯著降低[18]。VEGF也可通過介導VEGFR2發(fā)揮促血管生成作用,通過與VEGFR2結(jié)合,后者發(fā)生二聚化和自磷酸化,進而激活下游通路,促進細胞增殖與遷移,發(fā)揮促血管生成作用[19-21]。

    miRNA能夠通過調(diào)節(jié)相關(guān)血管生成蛋白表達進而導致RSA發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn),將miR-16注入妊娠小鼠胎盤,會導致小鼠胎盤異常,出現(xiàn)自然流產(chǎn)幾率明顯增加。此外,通過分離RSA患者的絨毛和蛻膜組織,也檢測到miR-16水平相比正常妊娠女性明顯增加,表明miR-16在RSA中發(fā)揮了重要的作用[10]。熒光素酶報告基因結(jié)果顯示,miR-16與VEGF的3-UTR互補,通過直接靶向VEGF來負調(diào)節(jié)VEGF表達,是血管生成的新型抑制劑[10]。本實驗中,為了探討?zhàn)B血安胎顆粒能否提高VEGF的表達,首先通過miR-16 mimic過表達了JEG-3細胞中miR-16水平,發(fā)現(xiàn)JEG-3細胞中VEGF蛋白表達顯著降低,也驗證了miR-16能夠抑制VEGF的表達。而養(yǎng)血安胎顆粒干預后,發(fā)現(xiàn)其能夠抑制miR-16的水平,進而增加VEGF的表達。CCK-8實驗也顯示,養(yǎng)血安胎顆粒能夠促進JEG-3細胞的增殖。以上結(jié)果表明,養(yǎng)血安胎顆粒具有增加VEGF表達,促進血管生成的作用。

    血管生成是由蛻膜化子宮內(nèi)膜細胞作用于內(nèi)皮細胞以促進其增殖,遷移和侵襲產(chǎn)生的[22]。為了進一步研究養(yǎng)血安胎顆粒如何調(diào)節(jié)血管生成,課題組分離了JEG-3細胞中的外泌體。細胞外囊泡是由真核和原核細胞釋放到細胞外空間的各種具有膜結(jié)構(gòu)的囊泡結(jié)構(gòu)統(tǒng)稱,根據(jù)直徑大小可分為外泌體、微囊泡和凋亡小體[23]。外泌體的研究目前最為廣泛,其直徑約40~100 nm,具有雙層膜結(jié)構(gòu),內(nèi)部包含多種蛋白、mRNA和miRNA等多種物質(zhì)。外泌體一旦釋放到細胞外空間,即可改變臨近細胞活性或進入體液向遠端發(fā)揮作用,通過攜帶來源細胞的蛋白質(zhì)、mRNA和miRNA至受體細胞,進而對受體細胞功能進行調(diào)控,發(fā)揮細胞通訊作用。研究發(fā)現(xiàn),外泌體能夠調(diào)節(jié)血管生成,并在胚胎植入中發(fā)揮重要的通訊作用。細胞的跨膜蛋白CD9、CD63、多泡體產(chǎn)生的蛋白Alix和TSG101以及轉(zhuǎn)膜和融合相關(guān)蛋白Flotillin 1可作為鑒定外泌體的標記物[24]。Calnexin是細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的標記蛋白,本實驗中,通過Western blot法對外泌體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標記蛋白進行測定,發(fā)現(xiàn)CD9、TSG101和Flotllin 1呈陽性表達,Calnexin蛋白呈陰性表達,表明分離得到的物質(zhì)為外泌體,且不含其他細胞成分,純度符合標準,能夠用于后續(xù)實驗。實驗結(jié)果表明,過表達JEG-3細胞中的miR-16后,其分泌的外泌體中miR-16也同樣升高;而養(yǎng)血安胎干預后,外泌體中的miR-16水平也得以降低。

    將分離的外泌體進而與HUVECs共培養(yǎng)后可觀察到HUVECs的細胞增殖與JEG-3細胞趨勢一致,表明外泌體能夠?qū)κ荏w細胞進行調(diào)控,且受源細胞的影響。檢測與外泌體共培養(yǎng)后的HUVECs中miR-16水平和VEGF的蛋白表達,結(jié)果顯示miR-16水平和VEGF的蛋白表達也均與JEG-3細胞的趨勢相同,表明JEG-3分泌的外泌體進入HUVECs后,對HUVECs的活性進行了調(diào)節(jié)。養(yǎng)血安胎顆粒則通過外泌體增加了HUVECs的VEGF表達,進而發(fā)揮了促血管生成作用。

    綜上,養(yǎng)血安胎顆粒抑制JEG-3細胞外泌體中miR-16水平,進一步抑制HUVECs中的miR-16水平,進而增加HUVECs中VEGF和VEGFR2的蛋白表達,促進血管生成。

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