基于COX信號(hào)通路探討梔黃止痛散對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠的影響*

王洋洋，齊秀春，韓崇濤

1.河南省省立醫(yī)院，河南 鄭州 450000； 2.河南省中醫(yī)院，河南 鄭州 450000

急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(acute gouty arthritis，AGA)是因尿酸鹽沉積在關(guān)節(jié)囊、滑囊、軟骨及其他組織中引起的關(guān)節(jié)病變及炎性反應(yīng)，患者常表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、活動(dòng)受限，嚴(yán)重者可出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形、肌萎縮，甚至由于長(zhǎng)期活動(dòng)受限導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能永久喪失，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。治療主要以消炎止痛為主，但可使用的藥物較少，同時(shí)有不良反應(yīng)[2]。近年來(lái)，中醫(yī)藥對(duì)關(guān)節(jié)炎疾病的治療有明顯優(yōu)勢(shì)，單獨(dú)或聯(lián)合常規(guī)西藥治療能夠有效改善患者的癥狀[3-5]。梔黃止痛散為治療關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)損傷的外用中藥方劑，具有活血化瘀止痛、除濕消腫的功效。研究表明，梔黃止痛散外敷能夠治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，減輕患者關(guān)節(jié)疼痛，改善睡眠質(zhì)量，聯(lián)合體外沖擊波可顯著緩解滑膜炎患者關(guān)節(jié)腫脹和疼痛，但其作用機(jī)制尚不明確[6-7]。本研究通過(guò)向大鼠踝關(guān)節(jié)腔注射尿酸鈉建立AGA模型，觀察梔黃止痛散對(duì)AGA模型大鼠的保護(hù)作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物75只6周齡SD大鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量180～220 g，雌雄各半，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。動(dòng)物許可證號(hào)為：SCXK(京)2017-0011。飼養(yǎng)條件如下：室溫(22±2) ℃，濕度(50±10)%，動(dòng)物房保持12 h12 h光暗循環(huán)照明，食水不限。研究方案獲河南省省立醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理批號(hào)：HNSLYY2019C010。

1.2 藥物和試劑梔黃止痛散(主要成分為梔子、大黃、乳香、沒藥、木香、姜黃、赤芍、白芷、天花粉、白蘞、赤小豆、黃柏、冰片、麝香，由河南省省立醫(yī)院藥學(xué)部制劑室提供)。秋水仙堿片(云南西雙版納藥業(yè)有限公司，批號(hào)：H53021369)；尿酸鈉(美國(guó)Sigma-Aldrich公司，貨號(hào)：U2875)；白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、IL-1β、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，貨號(hào)：E-EL-R0015c、E-EL-R0012c、E-EL-R2856c、E-EL-0060c、E-BC-K020-M)；環(huán)氧化酶-1(cyclooxygenase，COX-1)、COX-2兔源單克隆抗體(美國(guó)CST公司，貨號(hào)：9896、12282)；前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)兔源單克隆抗體[艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司，貨號(hào)：ab45295]；RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit(美國(guó)Thermo Scientific，貨號(hào)：K1622)；蛋白定量試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，貨號(hào)：AR0146)。

1.3 儀器37140型爪腫測(cè)量?jī)x(意大利Ugo Basile)；1703935型轉(zhuǎn)印電泳儀、1645050型電泳儀電源、1658001型垂直電泳儀、ChemiDoc MP型凝膠成像儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；7500型PCR儀(美國(guó)ABI公司)；IX53型顯微鏡(日本Olympus公司)；FlexA-200型全波長(zhǎng)酶標(biāo)分析儀(杭州奧盛儀器有限公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組、造模與給藥將75只大鼠隨機(jī)選取15只為正常組，其余大鼠均通過(guò)踝關(guān)節(jié)腔注射尿酸鈉建立AGA模型，具體為：大鼠用體積分?jǐn)?shù)10%水合氯醛麻醉后，在右后踝關(guān)節(jié)處注射50 μL尿酸鈉混懸液(20 g·L-1)，正常組大鼠在相同部位注射50 μL生理鹽水[8]，若大鼠受試關(guān)節(jié)在1 h內(nèi)腫脹度≥0.3 mL即認(rèn)為造模成功，然后將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、秋水仙堿組、梔黃止痛散組和聯(lián)合組。造模后1 h開始給藥，梔黃止痛散組大鼠使用梔黃止痛散(根據(jù)關(guān)節(jié)大小，取適量梔黃止痛散加蜂蜜調(diào)勻)攤涂在棉紗上外敷于受試踝關(guān)節(jié)處并用醫(yī)用膠帶固定，每12 h更換一次藥物；秋水仙堿組大鼠灌胃秋水仙堿0.15 mg·kg-1，每天3次；聯(lián)合組大鼠在灌胃秋水仙堿的基礎(chǔ)上外敷梔黃止痛散；正常組和模型組大鼠使用淀粉外敷于受試關(guān)節(jié)，每12 h更換一次。所有大鼠均連續(xù)給藥3 d。

2.2 大鼠步態(tài)評(píng)分造模后1 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h觀察大鼠步態(tài)變化，并進(jìn)行分級(jí)評(píng)分為0級(jí)：行走正常，計(jì)0分；1級(jí)：受試肢體稍微彎曲，輕度跛行，計(jì)2分；2級(jí)：受試肢體剛觸及地面，中度跛行，計(jì)4分；3級(jí)：受試肢體離開地面，呈三足態(tài)行走，重度跛行，計(jì)6分[9]。

2.3 大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度測(cè)定在大鼠受試踝關(guān)節(jié)處做標(biāo)記，造模后1 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h采用爪腫測(cè)量?jī)x測(cè)量各組大鼠右后踝關(guān)節(jié)標(biāo)記以下的容積。

關(guān)節(jié)腫脹度(mL)=(造模后踝關(guān)節(jié)容積-造模前踝關(guān)節(jié)容積)

2.4 大鼠機(jī)械縮足反射閾(paw mechanical withdrawal threshold，PWT)測(cè)定采用von Frey測(cè)試針?lè)謩e于造模后1 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h測(cè)定大鼠PWT值，以此評(píng)價(jià)大鼠機(jī)械性痛覺過(guò)敏變化。每次測(cè)試前，大鼠先放置于容器中適應(yīng)15 min，然后使用不同刺激強(qiáng)度的von Frey測(cè)試針刺激大鼠受試右后肢足底中部，使針彎曲并持續(xù)6～8 s，觀察大鼠后肢縮足反應(yīng)。若大鼠在刺激時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)縮足反應(yīng)則記為陽(yáng)性反應(yīng)，每次刺激間隔時(shí)間應(yīng)大于10 s，找到能引起大鼠50%縮足反應(yīng)的測(cè)試探針，記錄相應(yīng)的壓力值(g)。

2.5 大鼠血清炎癥和氧化應(yīng)激因子測(cè)定造模 72 h 后，各組大鼠腹主動(dòng)脈取血并分離血清，按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)IL-6、IL-1β、TNF-α、MDA含量和SOD活力。

2.6 HE染色觀察大鼠關(guān)節(jié)組織病理?yè)p傷變化處死大鼠，每組隨機(jī)取5只大鼠分離其右后肢踝關(guān)節(jié)，置于體積分?jǐn)?shù)10%福爾馬林中固定，隨后進(jìn)行脫鈣、組織脫水、制作組織蠟塊、切片，切片厚度為 4 μm。將組織切片置于防脫載玻片上，65 ℃烤片 2 h 后使用二甲苯脫蠟30 min，行HE染色，脫水后用中性樹膠封片，置于顯微鏡下觀察各組大鼠關(guān)節(jié)組織的病理改變。

2.7 Western Blot法檢測(cè)大鼠關(guān)節(jié)組織COX-1、COX-2、PGE2蛋白表達(dá)水平每組隨機(jī)選取5只大鼠的右后肢踝關(guān)節(jié)囊，收集關(guān)節(jié)液、滑膜等周圍的軟組織，冰上研磨，離心取沉淀，沉淀中加入RIPA裂解液提取組織蛋白，BCA法蛋白定量，確定蛋白濃度，將蛋白作變性處理后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉2 h，4 ℃孵育COX-1、COX-2、PGE2一抗(抗體稀釋比例均為11 000)，過(guò)夜后洗膜，37 ℃孵育二抗(抗體稀釋比例為11 000)，再次清洗后滴加發(fā)光試劑，放入凝膠成像儀中成像，Image J軟件對(duì)目的蛋白灰度值進(jìn)行量化，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值

2.8 RT-PCR法檢測(cè)大鼠關(guān)節(jié)組織COX-1mRNA、COX-2mRNA、PGE2mRNA表達(dá)水平取剩余大鼠的右后肢踝關(guān)節(jié)囊，收集關(guān)節(jié)液、滑膜等周圍的軟組織，冰上研磨，加1 mL Trizol裂解液提總RNA，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA并進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)。采用2-△△CT的方法計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平。引物序列見表1。

表1 基因引物序列

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠步態(tài)變化比較造模后1 h，模型大鼠的步態(tài)均不正常，步態(tài)評(píng)分均為所有時(shí)間點(diǎn)最高值。正常組大鼠有輕微跛行現(xiàn)象，模型組、秋水仙堿組、梔黃止痛散組和聯(lián)合組大鼠右后足彎曲，跛行現(xiàn)象明顯，個(gè)別大鼠呈現(xiàn)三足步態(tài)；造模后6 h，正常組大鼠步態(tài)恢復(fù)正常，但其余四組大鼠仍存在明顯跛行現(xiàn)象，隨著時(shí)間推移，各組大鼠步態(tài)逐漸趨于正常。與模型組比較，秋水仙堿組、梔黃止痛散組和聯(lián)合組大鼠步態(tài)評(píng)分顯著降低，其中聯(lián)合組恢復(fù)最快，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠步態(tài)評(píng)分比較

3.2 各組大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度比較造模后1 h，各組大鼠踝關(guān)節(jié)均出現(xiàn)腫脹現(xiàn)象，其中正常組大鼠踝關(guān)節(jié)有輕微紅腫，模型組、秋水仙堿組、梔黃止痛散組和聯(lián)合組大鼠踝關(guān)節(jié)處紅腫明顯。造模后6 h，與正常組比較，其余四組大鼠踝關(guān)節(jié)仍存在明顯腫脹(P<0.05)；與模型組比較，秋水仙堿組、梔黃止痛散組和聯(lián)合組大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度減輕(P<0.05)。隨著時(shí)間推移，各組大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹均逐漸恢復(fù)正常，其中聯(lián)合組大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度減少最顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度比較

3.3 各組大鼠PWT值比較造模后1 h，與正常組比較，其余各組大鼠PWT值均降低(P<0.05)。造模后6～72 h，模型組、秋水仙堿組和梔黃止痛散組大鼠PWT值均有所回升，與模型組比較，秋水仙堿組、梔黃止痛散組和聯(lián)合組大鼠PWT值顯著升高，其中，聯(lián)合組PWT值高于秋水仙堿組和梔黃止痛散組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠PWT值比較

3.4 各組大鼠血清炎癥和氧化應(yīng)激因子水平比較與正常組比較，模型組大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α、MDA含量顯著升高，SOD活力顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，秋水仙堿組、梔黃止痛散組和聯(lián)合組大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α、MDA含量均顯著降低，SOD活力顯著升高(P<0.05)；與秋水仙堿組比較，聯(lián)合組IL-6、IL-1β、TNF-α、MDA含量降低，SOD活力顯著升高(P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠血清細(xì)胞因子水平比較

3.5 各組大鼠關(guān)節(jié)組織病理變化比較正常組大鼠關(guān)節(jié)組織正常，偶見炎癥細(xì)胞；模型組大鼠關(guān)節(jié)組織滑膜增生，滑膜細(xì)胞數(shù)量增加，同時(shí)有大量炎癥細(xì)胞向滑膜組織浸潤(rùn)；與模型組比較，秋水仙堿組、梔黃止痛散組和聯(lián)合組大鼠關(guān)節(jié)組織雖有纖維增生，但炎癥細(xì)胞向滑膜組織的浸潤(rùn)明顯減輕。見圖1。

圖1 各組大鼠關(guān)節(jié)組織病理變化比較(HE染色，×400)

3.6 各組大鼠關(guān)節(jié)組織COX信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平比較與正常組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)組織COX-2、PGE2蛋白表達(dá)均升高(P<0.05)，COX-1表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)；與模型組比較，秋水仙堿組、梔黃止痛散組和聯(lián)合組大鼠關(guān)節(jié)組織COX-2、PGE2蛋白表達(dá)均降低，COX-1表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)；與秋水仙堿組比較，梔黃止痛散組大鼠關(guān)節(jié)組織COX-1、COX-2、PGE2蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)，聯(lián)合組大鼠關(guān)節(jié)組織 COX-2、PGE2蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，COX-1表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)。見圖2，表6。

表6 各組大鼠關(guān)節(jié)組織COX信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平比較

注：A.正常組；B.模型組；C.秋水仙堿組；D.梔黃止痛散組；E.聯(lián)合組

3.7 各組大鼠關(guān)節(jié)組織COX-1mRNA、COX-2mRNA、PGE2mRNA水平比較與正常組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)組織COX-2mRNA、PGE2mRNA表達(dá)均顯著升高(P<0.05)，COX-1mRNA表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)；與模型組比較，秋水仙堿組、梔黃止痛散組和聯(lián)合組大鼠關(guān)節(jié)組織COX-2mRNA、PGE2mRNA表達(dá)均顯著降低(P<0.05)，COX-1mRNA表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)；與秋水仙堿組比較，梔黃止痛散組大鼠關(guān)節(jié)組織COX-1mRNA、COX-2mRNA、PGE2mRNA表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)，聯(lián)合組大鼠關(guān)節(jié)組織COX-2mRNA、PGE2mRNA表達(dá)均降低，COX-1mRNA表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)。見表7。

表7 各組大鼠關(guān)節(jié)組織COX信號(hào)通路mRNA表達(dá)水平比較

4 討論

AGA是由于嘌呤代謝紊亂導(dǎo)致血尿酸水平升高，尿酸鹽結(jié)晶沉積于關(guān)節(jié)腔引起的關(guān)節(jié)紅腫熱痛的急性炎癥反應(yīng)[10-11]。中藥在治療AGA具有多成分、多靶點(diǎn)和多通路的治療優(yōu)勢(shì)[12-13]。梔黃止痛散由梔子、大黃、乳香、沒藥、木香、姜黃、赤芍、白芷、天花粉、白蘞、赤小豆、黃柏、冰片、麝香等中藥組成。梔子和大黃可消腫散結(jié)、破瘀通脈；乳香、沒藥、木香、姜黃、赤芍可活血化瘀、消腫止痛；白芷、天花粉、白蘞、赤小豆、黃柏除濕利水消腫；冰片、麝香芳香走竄，引藥入病所，用蜂蜜調(diào)和藥粉，外敷患處，全方共奏行氣活血、化濕利水、清熱消腫之功效。臨床研究證明，梔黃止痛散對(duì)關(guān)節(jié)炎癥性疾病具有較好的療效，并可協(xié)同其他療法改善患者癥狀，但其作用機(jī)制尚不清晰[14-15]。本研究通過(guò)建立大鼠AGA模型觀察梔黃止痛散對(duì)AGA大鼠關(guān)節(jié)腫脹與疼痛的改善作用，并初步探究其作用機(jī)制。

研究結(jié)果顯示，秋水仙堿和梔黃止痛散均能降低AGA模型大鼠步態(tài)評(píng)分，減輕踝關(guān)節(jié)腫脹，提高PWT值，而秋水仙堿和梔黃止痛散聯(lián)合的效果優(yōu)于單藥，初步表明梔黃止痛散對(duì)大鼠急性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)腫脹和疼痛具有一定的改善作用，并可協(xié)同提高西藥療效。氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是AGA的重要病理變化過(guò)程，兩種反應(yīng)相輔相成，互相誘導(dǎo)，是加快疾病發(fā)展的重要因素[16-18]。IL-1β是IL-1的主要存在形式，可與滑膜細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞上的受體結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄，刺激單核-巨噬細(xì)胞等大量分泌IL-1、IL-6及TNF-α等因子并沉積于關(guān)節(jié)，誘發(fā)炎癥反應(yīng)[19-20]。研究表明，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血與關(guān)節(jié)液中IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子異常升高，可能參與了風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展[21]。研究認(rèn)為，血清IL-6、IL-1β、TNF-α等細(xì)胞因子的表達(dá)水平對(duì)藥物治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的療效具有一定程度的預(yù)測(cè)作用，IL-6、IL-1β、TNF-α 的表達(dá)下調(diào)代表著藥物治療的有效性[22]。另一方面，在正常情況下，活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生受到體內(nèi)SOD等抗氧化劑的控制，但在關(guān)節(jié)炎中這種氧化劑和抗氧化劑的平衡失調(diào)，ROS可破壞關(guān)節(jié)組織中的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA，MDA的含量增加[23-25]。本研究發(fā)現(xiàn)，秋水仙堿和梔黃止痛散可降低AGA模型大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α、MDA含量，提高SOD活力，二者聯(lián)合的抗炎和抗氧化應(yīng)激作用更顯著，提示梔黃止痛散可顯著抑制AGA大鼠的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷，與西藥聯(lián)合應(yīng)用有增效作用。病理結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)組織有明顯滑膜增生和炎癥浸潤(rùn)；與模型組比較，秋水仙堿組、梔黃止痛散組和聯(lián)合組大鼠關(guān)節(jié)組織雖有纖維增生，但炎癥細(xì)胞向滑膜組織的浸潤(rùn)明顯減輕，表明梔黃止痛散可顯著改善急性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)組織病變。

環(huán)氧合酶(COX)由兩種同工酶組成，即COX-1和COX-2。COX-1主要存在于胃、腎、血管等組織，有保護(hù)胃腸道黏膜、調(diào)節(jié)腎血流量的作用，與COX-1不同，COX-2的表達(dá)主要由機(jī)體炎癥反應(yīng)如TNF、IL-1β等細(xì)胞因子的刺激引起，PGE2是其主要代謝產(chǎn)物，可進(jìn)一步加速炎癥反應(yīng)的發(fā)展[26-27]。研究表明，IL-6/COX-2軸的激活加重了急性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展[28]。研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)COX-2可拮抗膠原誘導(dǎo)型大鼠關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)腫脹和疼痛反應(yīng)[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，AGA模型大鼠關(guān)節(jié)組織COX-2、PGE2 蛋白和mRNA表達(dá)水平均升高，而秋水仙堿和梔黃止痛散可降低COX-2、PGE2 蛋白和mRNA表達(dá)，其中梔黃止痛散聯(lián)合秋水仙堿的作用優(yōu)于單藥治療，表明梔黃止痛散單獨(dú)或聯(lián)合西藥治療可抑制AGA大鼠COX信號(hào)通路的活化。

綜上所述，梔黃止痛散單獨(dú)和聯(lián)合西藥治療均可改善AGA模型大鼠步態(tài)、踝關(guān)節(jié)腫脹和疼痛，減少炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕受試關(guān)節(jié)組織病理?yè)p傷變化，其作用可能與抑制COX信號(hào)通路的活化有關(guān)。