可視化高通量檢測天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶活性的方法

高博，馮旭東，李春，2

（1 北京理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，北京 100081；2 清華大學(xué)化學(xué)工程系，北京 100084）

天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶（ATCase，EC 2.1.3.2）催化L-天冬氨酸（L-Asp）和氨甲酰磷酸（CP）合成-氨甲酰基-L-天冬氨酸（-CP-L-Asp），是嘧啶生物合成途徑的第一個酶。大腸桿菌來源的ATCase 是其中研究最多的酶，該酶是十二聚體，由兩個三聚體催化亞基（c）和三個二聚體調(diào)節(jié)亞基（r）組成。每個催化亞基存在兩個底物的結(jié)合域：Asp 結(jié)構(gòu)域和CP 結(jié)構(gòu)域。當(dāng)L-Asp 和CP 與酶的催化亞基結(jié)合時，酶發(fā)生變構(gòu)并使兩個結(jié)構(gòu)域之間距離縮短，進而引發(fā)L-Asp 的氨基對CP 的羰基碳進攻，發(fā)生轉(zhuǎn)氨甲?；磻?yīng)。此外，ATCase的活性還受到嘌呤和嘧啶代謝途徑產(chǎn)物的影響，三磷酸胞苷（CTP）和三磷酸腺苷（ATP）可以在ATCase 調(diào)節(jié)亞基的不同位點結(jié)合，并分別顯著抑制和促進酶活。ATCase 的這一反饋調(diào)節(jié)機制具有重要的生理功能，它在生物體內(nèi)控制嘌呤和嘧啶合成途徑的代謝平衡，在生命活動中具有重要意義。

體外活性檢測可以直觀研究ATCase 反饋調(diào)節(jié)機制的影響。目前，檢測ATCase 活性最普遍的方法是Kantrowitz 等提出的分光光度計法，該方法中使用了兩個顯色試劑，即2,3-丁二酮肟和安替比林，將它們分別溶于酸溶液中并混合。將顯色劑加入反應(yīng)后的溶液，在黑暗條件下室溫靜置16h，再在45℃水浴中加熱并均勻光照30min，最后測定466nm 處的吸光度。盡管該方法與早期的pH 檢測法和同位素示蹤法相比，已經(jīng)很大程度地簡化了操作要求并提高了檢測范圍，但仍然需要過夜反應(yīng)，且需要通過水浴和均勻光照來穩(wěn)定顯色產(chǎn)物的吸光度，因此無法滿足高通量檢測的需求。曹飛等研究表明，對二甲氨基苯甲醛（PDAB）可以在酸性溶液中與-CP-L-Asp 發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生黃色物質(zhì)，并且在438nm處的吸光度與-CP-L-Asp的濃度呈現(xiàn)線性關(guān)系。因此，本研究使用PDAB 建立快速、簡單和可視化的測定ATCase 活性的比色法，通過觀察加入PDAB 顯色劑后不同濃度的-氨甲?；?DL-天冬氨酸（-CP-DL-Asp）的顏色變化，并測定吸光度，確定該檢測方法的可行性；通過精密度實驗和加標(biāo)回收實驗驗證該方法的精確度；通過檢測粗酶液和純酶液反應(yīng)，驗證該方法檢測ATCase 活性的準(zhǔn)確度；通過酶標(biāo)儀實驗，確定該檢測方法可以用于ATCase 的高通量檢測。本研究為ATCase 的酶學(xué)研究和分子改造提供了更加方便、高效的檢測方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、質(zhì)粒和培養(yǎng)基

大腸桿菌DH5，BL21（DE3）以及DH5-pET28a 均為本實驗室保存。原核表達質(zhì)粒pET28a 通過天根生化科技公司的質(zhì)粒提取試劑盒獲得。LB 培養(yǎng)基：酵母膏5g，氯化鈉10g，蛋白胨10g，蒸餾水1000mL。

1.1.2 試劑、儀器及軟件

-氨甲酰基-DL-天冬氨酸（-CP-DL-Asp，純度95%）、L-天冬氨酸（純度98%），上海畢得醫(yī)藥；氨甲酰磷酸二鈉鹽（純度80%，在冷的50%乙醇中重結(jié)晶純化）、PDAB （純度98%），Sigma-Aldrich；2×mix 聚合酶，聚合美公司；2×fastmix 聚 合 酶，Trans 2K、Trans 2K Plus DNA marker，全式金公司；質(zhì)粒提取試劑盒，天根生化科技公司；膠回收試劑盒，Protein Ladder 26614，Thermofisher 公司；Gibson assembly master mix由實驗室自制。

PCR 儀，型號GE-TOUCH，杭州柏恒公司；電泳儀， 型號DYY-7C， 北京六一公司；Nanodrop，型號Nano-500，杭州奧盛公司；臺式搖床，型號ZQZY-CS9，知楚儀器公司；高速冷凍離心機，型號J6-XP，貝克曼公司；高壓破碎儀，型號JN-3000，廣州聚能納米公司；AKTA 蛋白純化儀（型號AKTA purifer）和His Trap FF 預(yù)裝柱，GE Healthcare； 酶 標(biāo) 儀， 型 號infinite M200，TECAN 公司。引物設(shè)計和序列比對使用SnapGene軟件。

1.2 實驗方法

1.2.1 目的基因的擴增與重組質(zhì)粒的構(gòu)建

在NCBI 數(shù)據(jù)庫中檢索大腸桿菌K12 MG1655中表達ATCase 的基因B 和I（在基因組中相鄰），將這兩個基因的序列在SnapGene中組合，并在其上下游設(shè)計引物P1、P2。在大腸桿菌DH5（大腸桿菌K12 系菌株）中擴增出BI 基因。同時，設(shè)計引物P3、P4，通過PCR 將pET28a 線性化。線性化的基因片段通過瓊脂糖凝膠電泳驗證，并通過膠回收試劑盒回收。通過Gibson 組裝方法，將兩個片段構(gòu)建成含有Kan抗性標(biāo)記的重組質(zhì)粒。

用于擴增目的片段的引物序列如下：P1,5'-CTTGCGGCCGCACTCGAATGGCTAATCCGCTATAT CAG-3'；P2,5'-GTGGTGGTGGTGGTGGTGATTGGC CAGCACCAC-3'；P3,5'-CATAATGTGGTGCTGGCC AATCACCACCACCACCACCACTG-3'；P4,5'-GATA TAGCGGATTAGCCATTCGAGTGCGGCCGCAAG-3'。

PCR 體系：Nuclease-Free Water，22μL；2×fastmix，25μL；引物（10μmol/L），1μL；模板（質(zhì)?；蚓海?，1μL。PCR 條件：預(yù)變性，95℃，2min；變性，95℃，20s；退火，60℃，20s；延伸，72℃，2kb/min；完全延伸，72℃，8min。共30個循環(huán)，最后存放于4℃冰箱。

1.2.2 重組質(zhì)粒的大腸桿菌轉(zhuǎn)化

將重組質(zhì)粒pET28a-ATCase 轉(zhuǎn)化至DH5中。在100μL DH5感 受 態(tài) 中 加 入10μL Gibson 組裝的質(zhì)粒，冰上孵育30min，42℃熱擊60s，冰上孵育5min，加入600μL LB 液體培養(yǎng)基，37℃、200r/min 搖床中復(fù)蘇1h。菌液在5000r/min離心3min，并全部涂布于含有卡那霉素的LB 平板上，放于37℃培養(yǎng)箱中過夜。挑取單克隆，使用T7 引物進行菌落PCR 鑒定，將陽性克隆挑入含有卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基。使用天根生化科技公司的質(zhì)粒提取試劑盒提取出重組質(zhì)粒，并送金唯智公司測序。將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）感受態(tài)中，用于表達目的蛋白。

1.2.3 目標(biāo)蛋白的誘導(dǎo)表達和純化

將轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的BL21（DE3）菌液接種于400mL 含有卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min 培 養(yǎng) 至OD=0.6 左 右，加 入0.1mmol/L 的IPTG，16℃誘導(dǎo)20h。使用高速冷凍離心機收集菌體，用20mL 的50mmol/L 的Tris-HCl（pH8.0）緩沖液重懸，高壓破碎，取上清液，在AKTA 蛋白純化儀中用含0.5mol/L 咪唑的緩沖液洗脫，獲得純酶，并通過SDS-PAGE 驗證。通過ATCase 的 吸 光 系 數(shù)，=0.59cm2/mg 計 算 純 酶濃度。

1.2.4 ATCase活性的測定

酶活反應(yīng)體系如下：5mmol/L 的L-Asp，5mmol/L 的CP，ATCase 純酶液（濃度為6nmol/L），加入緩沖液補足至0.5mL，與25℃水浴中反應(yīng)30min。反應(yīng)結(jié)束后加入0.5mL 的10% PDAB 顯色液（溶于2.4mol/L HCl 溶液中），避光靜置15min。使用Nanodrop 檢測438nm 的吸光度。定義每分鐘催化生成1μmol-CP-L-Asp 為1 個酶活力單位（U），酶的比活力為酶活力除以蛋白質(zhì)的質(zhì)量。

粗酶酶活驗證：在反應(yīng)體系中，分別加入10μL、20μL、30μL、50μL ATCase 粗酶液替代純酶液，其他條件不變。由于BL21（DE3）自身也表達ATCase，因此構(gòu)建了含有pET28a 質(zhì)粒的菌株作為對照。

高通量檢測：配置0～5mmol/L 的-CP-DLAsp 溶液和純酶反應(yīng)體系各0.5mL，加入顯色液反應(yīng)后用酶標(biāo)儀檢測吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

將pET28a線性化片段和擴增得到的BI片段進行Gibson組裝，將組裝產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5中，挑單菌落，使用T7 引物進行菌落PCR 驗證，結(jié)果如圖1。

圖1 重組質(zhì)粒的菌落PCR驗證

T7 引物是pET28a 上的特異性引物，因此菌落PCR 驗證結(jié)果表明，目的基因已經(jīng)被構(gòu)建到載體上。將陽性菌落挑入液體培養(yǎng)基，通過質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒并送金唯智公司測序和比對，確認(rèn)目的基因被成功構(gòu)建到載體上，重組質(zhì)粒命名為pET28a-ATCase。

2.2 ATCase的誘導(dǎo)表達和純化

將轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的BL21（DE3）菌株接種于液體培養(yǎng)基中，在對數(shù)生長階段加入IPTG，16℃下過夜誘導(dǎo)，收集菌體并用高壓破碎儀破碎。在AKTA 蛋白純化儀中，將含有ATCase 的上清液用His Trap FF預(yù)裝柱吸附，分別用含有0.5mol/L和1mol/L咪唑的Tris-HCl緩沖液洗脫，結(jié)果如圖2。

圖2 ATCase的SDS-PAGE驗證

ATCase 是十二聚體，因此重組蛋白含有12 個His標(biāo)簽，與His Trap FF預(yù)裝柱的結(jié)合能力強，需要使用較高濃度的咪唑洗脫。SDS-PAGE的結(jié)果顯示，兩個梯度的洗脫液中均含有ATCase 的催化亞基（34kDa）和調(diào)節(jié)亞基（17kDa），表明蛋白的純化成功。使用100kDa 的超濾濃縮管濃縮洗脫液，除去咪唑并將緩沖液替換為含有20%甘油的緩沖液，通過Nanodrop測定A280計算酶的濃度，-80℃低溫保存酶液。

2.3 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

在Tris-HCl 緩沖液中，加入-CP-DL-Asp，配置濃度為1～5mmol/L 的梯度溶液，按照體積比1∶1 加入10%PDAB 顯色液，室溫靜置15min。通過Nanodrop 測定438nm 的吸光度。將Tris-HCl 緩沖液作為對照，顯色反應(yīng)及標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示。

圖3 N-氨甲?；?DL-天冬氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖3 可以看出，隨著-CP-DL-Asp 濃度的升高，顯色反應(yīng)后的溶液呈更深的黃色，表明在該濃度范圍內(nèi)，可以通過觀察顏色變化判斷-CPDL-Asp 的含量。通過紫外測定，得到的線性方程為=0.3467-0.0022，=0.9998，線性關(guān)系良好。為確定PDAB顯色法的檢測下限，通過梯度稀釋配置了濃度為0.5mmol/L、0.1mmol/L、0.05mmol/L、0.01mmol/L 的-CP-DL-Asp 溶液并進行檢測。在濃度為0.1mmol/L時，平均吸光度為0.036，與標(biāo)準(zhǔn)曲線的誤差較小，而當(dāng)濃度為0.05mmol/L時，平均吸光度為0.025，與標(biāo)準(zhǔn)曲線的誤差較大，推測在此濃度下儀器的測量誤差對吸光度影響比較明顯。因此，PDAB顯色法的檢測范圍為0.1～5mmol/L。根據(jù)文獻，ATCase 對CP 的飽和濃度為4.8mmol/L，因此PDAB顯色法可以滿足ATCase酶活測定的要求。

2.4 精密度實驗

為保證顯色反應(yīng)的可重復(fù)性，配置濃度為2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L 的-CP-DL-Asp 溶液各6組，加入顯色劑反應(yīng)后測定吸光度。每個樣品測定3次吸光度，取平均值。將6組樣品測定結(jié)果取平均值，實驗結(jié)果如表1。

表1 精密度測定結(jié)果

由表1 可得，PDAB 顯色反應(yīng)的精密度RSD 為0.87%～1.52%，表明檢測結(jié)果精確度高。

2.5 加標(biāo)回收率的測定

選擇-CP-DL-Asp 濃度為1mmol/L 的溶液，加入-CP-DL-Asp 標(biāo)準(zhǔn)品使溶液濃度分別提高至2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L。加入顯色劑反應(yīng)，測定吸光度，并根據(jù)圖3 中的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算回收率，實驗結(jié)果如表2。

表2 加標(biāo)回收率的測定

由表2 可得，在檢測范圍內(nèi)進行加標(biāo)回收時，PDAB 顯色法具有良好的回收率，結(jié)果為96.6%～101.9%，準(zhǔn)確度較高。

2.6 使用PDAB顯色法測定ATCase的活性

根據(jù)1.2.4 節(jié)的方法進行ATCase 活性的測定，為證明該顯色法測定ATCase 活性的高效性，首先使用粗酶液進行顯色反應(yīng)，實驗結(jié)果如圖4 和表3所示。

圖4 粗酶液顯色反應(yīng)

表3 粗酶液顯色反應(yīng)的紫外吸收

圖4 表明，PDAB 顯色法可用于定性檢測ATCase 粗酶液的酶活。對照組顯色結(jié)果表明，PDAB酸性顯色液與大腸桿菌裂解液中的某些物質(zhì)也會發(fā)生顯色反應(yīng)，顏色呈淡粉紅色，同時還會與其他某些物質(zhì)反應(yīng)，產(chǎn)生沉淀。當(dāng)加入粗酶液的體積大于20μL 時，能觀察到顯色液有渾濁。當(dāng)加入含有ATCase 的粗酶液時，除了-CP-L-Asp 發(fā)生反應(yīng)呈黃色以外，上述兩個反應(yīng)也會同時發(fā)生，隨著加入粗酶液體積的增加，出現(xiàn)的沉淀明顯增多，但是-CP-L-Asp和粉紅色的顯色反應(yīng)沒有明顯增加，表明粗酶液與PDAB顯色液發(fā)生沉淀的反應(yīng)更優(yōu)先。再根據(jù)表3 發(fā)現(xiàn)，粗酶液體積的增加對438nm的吸光度幾乎沒有影響，這表明沉淀的出現(xiàn)影響了PDAB 與-CP-L-Asp 的顯色。當(dāng)加入粗酶液體積為小于10μL 時，能更好地觀察到顯色反應(yīng)的發(fā)生。粗酶液顯色反應(yīng)的結(jié)果表明，PDAB顯色法可以用于高通量定性檢測ATCase 的活性且不需要復(fù)雜耗時的蛋白純化操作。

進一步使用PDAB 顯色法測定ATCase 純酶的比活性。根據(jù)1.2.4節(jié)的方法進行ATCase 純酶活性的測定。定義每分鐘催化生成1μmol-CP-L-Asp為1個酶活力單位（U），酶的比活力為酶活力除以蛋白質(zhì)的質(zhì)量，測定結(jié)果如表4。

表4 PDAB顯色法測定ATCase純酶的比酶活

由表4，通過PDAB 顯色法測定三個平行反應(yīng)的比酶活并取平均值，得到ATCase 的比酶活為56.83U/mg，RSD為2.60%，表明該檢測方法準(zhǔn)確。

2.7 使用酶標(biāo)儀高通量測定ATCase的活性

為表明PDAB顯色法可用于高通量測定ATCase的活性，使用酶標(biāo)儀檢測2.6 節(jié)中同一批純酶液反應(yīng)的樣品，并與Nanodrop 的結(jié)果進行比對。配置0～5mmol/L 的-CP-DL-Asp 溶液，并根據(jù)1.2.4 節(jié)的方法，將每個樣品取三組平行測定。酶標(biāo)儀檢測結(jié)果如表5、表6。

根據(jù)表5的結(jié)果，擬合酶標(biāo)儀測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為=0.0989+0.0555，=0.9931，線性關(guān)系較好。由表6 得到ATCase 的比酶活為57.61U/mg，RSD為4.91%，結(jié)果與分光光度計誤差很小，表明該方法可重復(fù)性較高。

表5 酶標(biāo)儀測定的N-CP-DL-Asp的吸光度

表6 酶標(biāo)儀測定ATCase純酶的比酶活

表7列出本文構(gòu)建的PDAB檢測法與Kantrowitz等的傳統(tǒng)方法的對比。

表7 兩種檢測方法的對比

盡管與傳統(tǒng)檢測方法相比，本文建立的PDAB檢測法的靈敏度有所下降，但由于ATCase 可以在30min 內(nèi)生成濃度高達約3mmol/L 的產(chǎn)物，因此靈敏度對該方法的適用性沒有顯著影響。此外，PDAB檢測法在保持高精確度的同時，大幅縮短反應(yīng)時間并明顯簡化操作步驟，從而大幅提高測定效率，適用于高通量檢測ATCase的活性。

3 結(jié)論

本研究基于PDAB與-氨甲?；?天冬氨酸反應(yīng)生成黃色物質(zhì)的性質(zhì)，建立了高效檢測ATCase活性的比色法。實驗結(jié)果表明，在0.1～5mmol/L 的濃度范圍內(nèi)，PDAB 對-氨甲?；?DL-天冬氨酸顯色后，在438nm 的吸光度具有良好的線性關(guān)系，且精確度高，加標(biāo)回收準(zhǔn)確度高。將該顯色法用于測定ATCase 的活性時，可以通過顏色的變化可視化地判斷反應(yīng)進行的程度。對于粗酶液，該顯色法可以定性檢測酶促反應(yīng)是否發(fā)生，對于純酶液，該方法可用于定量檢測。通過分光光度計比色法測定ATCase 的比酶活，三組平行實驗證明該方法的可重復(fù)性高。與傳統(tǒng)方法相比，該檢測法還具有耗時短、操作簡單等優(yōu)點，可以滿足高通量篩選ATCase的需求。