海藻渣復(fù)配微生物菌劑防治黃瓜苗期枯萎病的協(xié)同增效作用

郝大志，王詠坤，陳 捷*，辛舟生，高永東

（1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240；2.山東潔晶集團(tuán)股份有限公司，日照 276826；3.上海市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，上海 201100）

國(guó)內(nèi)外對(duì)于海藻渣的綜合利用已有大量的研究[1-3]。海藻渣含粗蛋白約 20%，粗纖維約 50%，灰分約3%，此外還富含水楊酸、茉莉酸、脫落酸、赤霉素等10余種生物刺激素及超氧化物歧化酶等[4-6]，因此海藻渣所制備有機(jī)肥可以提高植物的光合作用、抗逆能力及耐鹽堿性，從而提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)[7-11]。木霉及芽胞桿菌是常見(jiàn)的植物促生菌及植物土傳病害生物防治微生物，主要通過(guò)拮抗、競(jìng)爭(zhēng)、重寄生和誘導(dǎo)抗性等機(jī)制來(lái)保護(hù)植物免受病原菌侵襲[12,13]。在黃瓜枯萎病防治方面，季倩茹等[14]研究表明，巨大芽胞桿菌B213、多粘類芽胞桿菌B207和枯草芽胞桿菌B204三菌聯(lián)合對(duì)黃瓜枯萎病的防治及防御反應(yīng)酶系的誘導(dǎo)有明顯協(xié)同增效作用。朱森林等[15]創(chuàng)制的深綠木霉水分散粒劑的防效超過(guò)化學(xué)藥劑，葉片抗性氧化酶活性、葉綠素和脯氨酸含量明顯增加。廉華等[16]研究表明，木霉菌分生孢子和厚垣孢子均能增加黃瓜幼苗葉片過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、抗壞血酸過(guò)氧化物酶（ascorbic acid peroxidase，APX）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，提高對(duì)黃瓜枯萎病的防治效果。盡管木霉菌與芽胞桿菌的組合使用在防治植物土傳病害方面具有明顯的協(xié)同增效作用[17-19]，但關(guān)于海藻渣與木霉+芽胞桿菌復(fù)合菌劑在防治病害中的協(xié)同增效作用研究并不多見(jiàn)。蘇東海等[20]用枯草芽胞桿菌、乳酸菌、酵母菌等混合菌株對(duì)海藻渣進(jìn)行發(fā)酵，其粗纖維含量大幅提高。趙忠祥等[21]利用綠色木霉固體發(fā)酵海帶渣，發(fā)酵過(guò)程中纖維素被顯著分解，還原糖含量提高。說(shuō)明了海藻渣可以被木霉菌、芽胞桿菌分解利用。目前大部分的微生物菌劑主要選用硅藻土、高嶺土等惰性物質(zhì)為營(yíng)養(yǎng)和孢子載體，而海藻渣則可作為很好的菌劑營(yíng)養(yǎng)載體及促生物質(zhì)來(lái)源。周瑩等[22]制備了以海藻渣為載體的枯草芽胞桿菌菌劑，有效防治了丹參根腐病。但海藻渣與木霉菌的復(fù)配使用未有報(bào)道。實(shí)驗(yàn)室前期研究已經(jīng)證實(shí)了海藻渣復(fù)配木霉菌劑、芽胞桿菌菌劑對(duì)黃瓜幼苗促生作用的協(xié)同增效，因此研究海藻渣與木霉和芽胞桿菌復(fù)合菌劑間在防治黃瓜苗期枯萎病中的協(xié)同作用機(jī)制，對(duì)高效利用海藻渣，開(kāi)發(fā)添加海藻渣的新型復(fù)合生物農(nóng)藥或生防菌劑具有重要意義。

本研究將棘孢木霉Trichodermaasperellum、解淀粉芽胞桿菌Bacillusamyloliquefaciens與海藻渣制備成復(fù)合制劑，通過(guò)與單一海藻渣制劑、單一混合菌制劑比較，明確三者防治黃瓜枯萎病、促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)的協(xié)同增效作用，為海藻渣資源化利用探索一條新途徑。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試作物 黃瓜（申青一號(hào)），購(gòu)買于上海富農(nóng)種業(yè)有限公司。

1.1.2 供試海藻渣（平均粒徑0.25 mm）由山東結(jié)晶集團(tuán)股份有限公司提供。

1.1.3 供試菌劑 棘孢木霉TrichodermaasperellumGDFS1009菌劑（2億 cfu/g，載體硅藻土）由本實(shí)驗(yàn)室提供；解淀粉芽胞桿菌BacillusamyloliquefaciensFS1841菌劑（2000億 cfu/g，載體麥芽糊精）由四川龍蟒福生科技有限公司提供。

1.1.4 供試病原菌 黃瓜枯萎病菌Fusariumoxysporum由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.5 供試培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基（potato pextrose agar，PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL，pH自然。馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（potato pextrose，PD）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1000 mL，pH自然。

1.1.6 供試栽培基質(zhì)與土壤 蔬菜栽培有機(jī)基質(zhì)（有機(jī)質(zhì)含量55.2%）購(gòu)買于丹陽(yáng)市茂禾有機(jī)肥料有限公司。自然田土（有機(jī)質(zhì)含量2.76%）；自然田土壤過(guò)1 mm篩后與有機(jī)基質(zhì)1:1混合，121 ℃高溫蒸汽滅菌1 h。

1.1.7 供試化學(xué)試劑 水楊酸（Sigma-Aldrich，CAS No.69-72-7），茉莉酸（Sigma-Aldrich，CAS No.77026-92-7）。多酚氧化酶（PPO）檢測(cè)試劑盒（雷根生物技術(shù)有限公司，Cat：TE0427）、超氧化物歧化酶（SOD）檢測(cè)試劑盒（雷根生物技術(shù)有限公司，Cat：TE0720）、過(guò)氧化物酶（POD）檢測(cè)試劑盒（雷根生物技術(shù)有限公司，Cat：TE0423）、過(guò)氧化氫酶（CAT）檢測(cè)試劑盒（雷根生物技術(shù)有限公司，Cat：TE0740）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）檢測(cè)試劑盒（雷根生物技術(shù)有限公司，Cat：TE0401）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌孢子懸浮液的制備 將黃瓜枯萎病病原菌在 PDA 培養(yǎng)基上 28 ℃活化培養(yǎng)3 d，轉(zhuǎn)接到 PD培養(yǎng)基上，28 ℃、200 r/min培養(yǎng)5 d，發(fā)酵液經(jīng)8層紗布過(guò)濾后獲得孢子懸浮液。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器檢測(cè)孢子懸液的孢子數(shù)，并將孢子懸浮液稀釋至1×106cfu/ mL。

1.2.2 盆栽處理與方法 將海藻渣、木霉菌劑、芽胞桿菌菌劑、載體分別按照不同處理與土壤混勻，使得土壤中的海藻渣含量為1%、木霉含量為3.0×105cfu/g、芽胞桿菌含量為2.0×108cfu/g。共4個(gè)處理：海藻渣+木霉菌劑+芽胞桿菌菌劑（T1）、海藻渣（T2）、木霉菌劑+芽胞桿菌菌劑（T3）和空白載體處理（CK）。上述制劑與土壤均勻混合，每個(gè)處理播種3個(gè)育苗盤，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。

處理方法：將不同處理的土壤裝入21孔塑料育苗盤（34.5 cm×24 cm×11 cm）中，每孔栽入催芽黃瓜種子2粒。播種后充分澆水，直至穴盤底部排水孔有水溢出。在人工氣候室內(nèi)培育，育苗光照時(shí)間為16 h光照/8 h黑暗，室內(nèi)溫度控制24 ℃～25 ℃，每3 d澆施1000 mL無(wú)菌水。3 d后每穴只保留一棵苗生長(zhǎng)。

病菌接種與取樣: 栽種15 d后灌根接種黃瓜枯萎病菌1×106cfu/mL，每穴5 mL。分別于接種病菌0、3、6和9 d后取黃瓜第二片真葉與主根系，用錫箔紙包好。在接種病原菌當(dāng)天取主根表面土壤，放入黑色離心管，置于-80 ℃冰箱中保存，用于后續(xù)試驗(yàn)測(cè)定。

1.3 黃瓜根系防御反應(yīng)物質(zhì)測(cè)定

1.3.1 水楊酸和茉莉酸的提取 稱取0.1 g黃瓜（二葉期幼苗）根系與第二片真葉，液氮中研磨至粉碎。向粉末中加入1 mL提取緩沖液（甲醇:水:甲酸＝70:29:1），4 ℃振震蕩30 min后于4 ℃、13000 r/min離心20 min，取上清液。再經(jīng)離心濃縮儀濃縮6 h，殘?jiān)?00 μL甲醇溶解，獲得茉莉酸（JA）和水楊酸（SA）粗提樣，保存于棕色瓶。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 將水楊酸、茉莉酸標(biāo)品配置成0.5、1、5、10、50、100、500和1000 ng/mL的混合標(biāo)品，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)峰面積與濃度的線性關(guān)系y＝1.1e＋003x＋4.65e＋004（r＝0.9995）計(jì)算水楊酸濃度，y＝2.54e＋003x＋1.17e＋003（r＝0.9995）計(jì)算茉莉酸濃度。

1.3.3 茉莉酸（jasmonic acid，JA）和水楊酸（salicylic acid，SA）LC-MS/MS分析 超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（Nexera LC30AD&SCIEX SelexION Triple Quad 5500 System），日本島津公司& Sciex公司。

色譜條件：色譜柱為ACQUITY BEH C18液相柱 2.1 mm×100 mm×1.7 μm；進(jìn)樣量為5 μL；流動(dòng)相為0.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）甲酸水溶液（A相）和甲酸乙腈（B相）；柱溫為40 ℃。

質(zhì)譜條件：ESI負(fù)離子模式；氣簾氣：35 psi；離子化電壓：-4500 V；去溶劑溫度：500 ℃；霧化氣：55 psi；輔助加熱氣：55 psi；多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction ,monitoring，MRM）分析。

1.3.4 茉莉酸（JA）和水楊酸（SA）含量計(jì)算 C樣＝（A樣×C標(biāo)×V標(biāo)）/（A標(biāo)×V樣）。其中，A：峰面積；C：濃度；V：體積；標(biāo)：JA/SA標(biāo)樣；樣：待測(cè)樣品。單位鮮重樣品JA/SA含量（ng/g）＝（C樣×定容體積）/樣品鮮重。

1.4 黃瓜葉片抗氧化酶系活性測(cè)定

葉片酶活測(cè)定方法：多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanin ammo-nialyase，PAL）活性測(cè)定方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，PPO活性單位為每1 min吸光度變化0.01所需酶量為一個(gè)活性單位（U），SOD活性單位以抑制氮藍(lán)四唑（nitroblue tetrazolium，NBT）光化還原的50%為一個(gè)酶活性單位（U），POD活性單位為每1 min吸光度變化0.01所需酶量為一個(gè)活性單位（U），CAT活性單位為在37 ℃、1 min催化水解1 μmoL過(guò)氧化氫量為一個(gè)CAT酶活力單位（U），PAL活性單位為每1 h吸光度變化0.01所需酶量為一個(gè)酶活性單位（U）。

1.5 黃瓜葉片防御反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)分析

RNA提取與cDNA反轉(zhuǎn)錄合成：按照總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，使用NanoDrop超微量分光光度計(jì)檢測(cè)其純度和濃度后，保存于-80 ℃。以總RNA為反轉(zhuǎn)錄模板，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行基因組DNA去除與反轉(zhuǎn)錄。16 μL基因組DNA去除體系：50 ng/μL終濃度模板、4×g DNA wiper Mix 4 μL、RNase-free ddH2O補(bǔ)足至16 μL，42 ℃反應(yīng)2 min。20 μL反轉(zhuǎn)錄體系：16 μL去除基因組DNA模板、5×HiScript Ⅲ qRT SuperMix 4 μL。PCR反應(yīng)程序：37 ℃孵育15 min；85 ℃加熱失活5 s。將反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析：20 μL反應(yīng)體系：50 ng/μL cDNA 2.0 μL、10 μmol/L正反向引物（表1）各0.4 μL、2×ChamQ Universal SYBR qPCR Super Mix 10.0 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性300 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃熔解10 s，65 ℃熔解60 s，97 ℃熔解1 s；37 ℃冷卻30 s，以EF1-α為內(nèi)參，設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。反應(yīng)結(jié)束后，觀察熔解曲線趨勢(shì)是否正確，根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)到的CT值，按照2-ΔΔCT法，計(jì)算不同處理時(shí)間下黃瓜葉片中目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 黃瓜苗期枯萎病防效

病原菌接種9 d后統(tǒng)計(jì)黃瓜苗期枯萎病病情指數(shù)。黃瓜苗期枯萎病的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照方中達(dá)[23]的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，0級(jí)：無(wú)癥狀；1級(jí)：真葉、子葉黃化或萎蔫面積不超過(guò)總面積的50%；2級(jí)：真葉、子葉黃化或萎蔫面積超過(guò)總面積的50%；3級(jí)：葉片萎蔫或枯死，僅生長(zhǎng)點(diǎn)存活；4級(jí)：全株嚴(yán)重萎蔫，以致枯死。病情指數(shù)參照宗兆鋒和康振生[24]的計(jì)算方法，病情指數(shù)＝Σ（病級(jí)數(shù)×該病級(jí)植株數(shù)）/（最大病級(jí)數(shù)×植株總株數(shù)）×100，防治效果（%）＝（對(duì)照組病情指數(shù)－處理組病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)×100。

1.7 相關(guān)性分析

將海藻渣+木霉菌劑+芽胞桿菌菌劑（T1）與木霉菌劑+芽胞桿菌菌劑（T3）所測(cè)的各項(xiàng)酶活、SA含量、JA含量、基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)越接近1說(shuō)明T1與T3在該項(xiàng)為協(xié)同增效。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用GraphPad Prism 9.0軟件進(jìn)行圖表制作，數(shù)據(jù)采用SAS 9.4軟件通過(guò)最小顯著差異法（LSD）比較不同處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 海藻渣對(duì)木霉+芽胞桿菌混合菌劑防治黃瓜苗期枯萎病

海藻渣+木霉+芽胞桿菌混合菌劑（T1）、海藻渣單獨(dú)使用（T2）、木霉＋芽胞桿菌混合菌劑（T3）與CK間病情指數(shù)出現(xiàn)顯著差異，T1、T2、T3處理病情指數(shù)極顯著低于CK處理，海藻渣＋木霉＋芽胞桿菌混合菌劑（T1）的防治效果顯著高于海藻渣單獨(dú)使用（T2）及木霉+芽胞桿菌混合菌劑單獨(dú)使用（T3）。木霉+芽胞桿菌混合菌劑（T3）的防治效果顯著高于海藻渣單獨(dú)使用（T2）；海藻渣單獨(dú)使用（T2）的防治效果較差，平均防效只有25.79%，證明海藻渣本身誘導(dǎo)黃瓜幼苗對(duì)枯萎病是有限的；木霉＋芽胞桿菌混合菌劑（T3）平均防效為81.78%，添加海藻渣后防效提高到93.49%，提高了11.71%，結(jié)果表明海藻渣可以增強(qiáng)木霉菌劑、芽胞桿菌菌劑對(duì)黃瓜幼苗枯萎病防效，海藻渣與木霉菌劑、芽胞桿菌菌劑對(duì)黃瓜幼苗枯萎病防效協(xié)同增效（表2，圖1）。

圖1 海藻渣對(duì)木霉+芽胞桿菌混合菌劑防治黃瓜苗期枯萎病的影響Fig.1 Influence of seaweed residue on the control effect of Trichoderma and Bacillus mixture microbial agents gainst cucumber Fusarium wilt

表2 海藻渣復(fù)配微生物菌劑處理對(duì)黃瓜枯萎病防效的影響Table 2 Effect of seaweed residue combined with microbial agents on cucumber Fusarium wilt

2.2 海藻渣對(duì)木霉+芽胞桿菌混合菌劑誘導(dǎo)黃瓜葉片抗氧化酶活性的影響

通過(guò)灌根接種尖孢鐮刀菌后0、3、6和9 d測(cè)定葉片抗氧化酶系的活性結(jié)果表明，葉片超氧化物歧化酶（SOD）與苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性變化趨勢(shì)相近。與 CK相比，未接種病原菌情況下的 T1、T2和T3處理的葉片SOD活性及PAL活性均顯著高于CK；隨著接種病菌后時(shí)間的增加，各處理的植物防御反應(yīng)逐漸加強(qiáng)，其中T1處理的大部分時(shí)間節(jié)點(diǎn)中的葉片SOD活性、PAL活性均高于T3和T2處理，可見(jiàn)海藻渣能增強(qiáng)木霉＋芽胞桿菌混合菌劑對(duì)葉片SOD和PAL活性的誘導(dǎo)（圖2）。

隨著接種病菌后時(shí)間增加，T1、T3的POD、CAT活性均顯著提高，PPO變化較為復(fù)雜。但在9 d時(shí)，T1的POD、PPO、CAT活性為所有處理中最高，且T1＞T3＞T2（圖2）。

綜上試驗(yàn)結(jié)果，由于抗氧化酶系統(tǒng)變化較為復(fù)雜，在病原菌剛接種時(shí)不同處理中POD、SOD、CAT、PPO、PAL活性變化并不一致，但T1處理的黃瓜葉片POD、SOD、CAT、PPO、PAL活性均隨著接種病原菌后的天數(shù)增加而提高，T1處理葉片的酶活在9 d時(shí)均高于T2、T3及CK。海藻渣對(duì)黃瓜抗氧化系統(tǒng)酶活有一定的誘導(dǎo)作用，添加海藻渣可以進(jìn)一步增強(qiáng)微生物菌劑的誘導(dǎo)效果，海藻渣與木霉+芽胞桿菌混合菌劑在誘導(dǎo)黃瓜抗氧化酶系統(tǒng)中表現(xiàn)為協(xié)同增效（圖2）。

圖2 海藻渣對(duì)木霉+芽胞桿菌混合菌劑誘導(dǎo)黃瓜幼苗葉片抗氧化酶活性的影響Fig.2 Effect of seaweed residue on antioxidant enzyme activity of cucumber seedling leaves induced by Trichoderma and Bacillus mixture microbial agents

2.3 海藻渣對(duì)木霉+芽胞桿菌混合菌劑誘導(dǎo)黃瓜根部和葉片水楊酸和茉莉酸含量變化的影響

在未接種病菌情況下，海藻渣及微生物菌劑對(duì)黃瓜根系茉莉酸積累有顯著影響，T1處理中茉莉酸含量是CK的0.46倍，T2、T3處理的茉莉酸含量則低于CK。接種后6 d，T1、T2、T3處理的茉莉酸含量仍呈降低趨勢(shì)，但水楊酸含量則逐漸增加，推測(cè)可能與茉莉酸信號(hào)通路途徑和水楊酸信號(hào)通路途徑間存在拮抗關(guān)系有關(guān)（圖3A）。

圖3 海藻渣對(duì)木霉和芽胞桿菌混合菌劑誘導(dǎo)黃瓜幼苗根系茉莉酸（A）、水楊酸（B）含量變化的影響Fig.3 Effect of seaweed residue on changes of jasmonic acid (JA ) and salicylic acid (SA) content in cucumber seedling roots induced by Trichoderma and Bacillus mixture microbial agents

在未接種病菌的情況下，海藻渣及海藻渣＋木霉＋芽胞桿菌混合菌劑對(duì)黃瓜根系水楊酸含量無(wú)顯著影響，但在接種病原菌后則顯著提高黃瓜根系積累水楊酸的速度。在接種病原菌3 d后，T1中水楊酸含量為CK的0.5倍，而T2、T3水楊酸含量無(wú)顯著變化；在接種病原菌6 d后，T2水楊酸迅速上升至CK的0.75倍，且比T1及T3還要高；在接種病原菌9 d后，T1水楊酸為CK的0.77倍，為所有處理中最高，T3高于T2。T2在9 d時(shí)水楊酸含量降低，這可能是因?yàn)閱为?dú)的海藻渣處理對(duì)黃瓜防御反應(yīng)的誘導(dǎo)不具有持效性。與T2相比，T1具有對(duì)寄主防御反應(yīng)更為持效的誘導(dǎo)能力，說(shuō)明海藻渣能強(qiáng)化微生物菌劑的誘導(dǎo)效應(yīng)（圖3B）。

未接種病菌的情況下，海藻渣及混合菌劑對(duì)黃瓜葉片水楊酸積累有一定影響，但不顯著。接種病菌后，CK、T1、T2、T3葉片中水楊酸含量均逐漸增加，且呈T1＞T3＞T2＞CK，說(shuō)明了海藻渣與微生物菌劑誘導(dǎo)葉片中水楊酸積累具有協(xié)同作用。接種后葉片中的茉莉酸積累也有類似規(guī)律（圖4A、B）。

圖4 海藻渣對(duì)木霉和芽胞桿菌混合菌劑誘導(dǎo)黃瓜幼苗葉片茉莉酸、水楊酸含量變化的影響Fig.4 Effect of seaweed residue on changes of jasmonic acid (JA ) and salicylic acid (SA) content in cucumber seedling leaves induced by Trichoderma and Bacillus mixture microbial agents

綜上檢測(cè)結(jié)果，無(wú)論在根系還是葉片中水楊酸含量都顯著高于茉莉酸含量，說(shuō)明海藻渣及混合菌劑主要誘導(dǎo)黃瓜的水楊酸含量增加，以激發(fā)相關(guān)防御反應(yīng)途徑。葉片及根系中水楊酸含量均為 T1＞T3＞T2＞CK，說(shuō)明了海藻渣對(duì)木霉+芽胞桿菌混合菌劑誘導(dǎo)黃瓜幼苗葉片及根系中水楊酸積累具有顯著增效作用。在未接種病原時(shí)，各處理間的根系及葉片中水楊酸含量差異較小，而茉莉酸差異較大，說(shuō)明在未接種病原菌時(shí)，海藻渣及微生物菌劑就已經(jīng)提高茉莉酸含量，以提高黃瓜幼苗的抗病性；而在接種病原后，水楊酸含量快速增加，主要通過(guò)提高水楊酸的應(yīng)答速度及含量來(lái)提高黃瓜幼苗的抗病性。海藻渣對(duì)水楊酸含量增加的誘導(dǎo)能力雖然低于微生物菌劑，但海藻渣對(duì)茉莉酸含量增加的誘導(dǎo)能力強(qiáng)于微生物菌劑，海藻渣的添加豐富了微生物菌劑的系統(tǒng)誘導(dǎo)抗性（圖3，4）。

2.4 海藻渣對(duì)木霉+芽胞桿菌混合菌劑誘導(dǎo)黃瓜葉片防御反應(yīng)信號(hào)相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.4.1 對(duì)水楊酸SA途徑的影響 測(cè)定接種病菌0、3、6和9 d的黃瓜幼苗葉片水楊酸相關(guān)基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)海藻渣及混合菌劑處理均可以激活黃瓜幼苗防御反應(yīng)。未接種病原菌時(shí)，海藻渣及混合菌劑處理黃瓜根部可引起黃瓜葉片內(nèi)與水楊酸相關(guān)的基因PAD4、PR1、NPR1的表達(dá)變化，T1處理顯著上調(diào)。接種病原菌后CK的PAD4、PR1表達(dá)上調(diào)，NPR1表達(dá)下調(diào)，但變化程度較?。籘1的PAD4、PR1、NPR1表達(dá)顯著上調(diào)；T2的PAD4、PR1表達(dá)上調(diào)，NPR1表達(dá)下調(diào)；T3的PAD4、PR1、NPR1表達(dá)顯著上調(diào)，但上調(diào)程度低于T1。與CK相比，海藻渣及混合菌劑處理的葉片無(wú)論是否接種原菌，PAD4、PR1、NPR1均被誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)，且T1上調(diào)程度顯著高于T3，T3顯著高于T2。與黃瓜葉片水楊酸含量變化相比，SA途徑基因表達(dá)先于含量變化，且誘導(dǎo)效應(yīng)逐漸衰減，但水楊酸含量逐步增加。海藻渣本身對(duì)黃瓜幼苗防御反應(yīng)具有一定的誘導(dǎo)能力，但不如微生物菌劑，添加海藻渣增強(qiáng)了木霉+芽胞桿菌混合菌劑對(duì)防御反應(yīng)誘導(dǎo)能力，SA途徑基因表達(dá)水平提高，水楊酸含量積累，表明了海藻渣與木霉+芽胞桿菌混合菌劑對(duì)黃瓜幼苗枯萎病防效的協(xié)同作用（圖5）。

圖5 海藻渣對(duì)木霉和芽胞桿菌混合菌劑誘導(dǎo)黃瓜幼苗葉片水楊酸途徑基因表達(dá)的影響Fig.5 Effect of seaweed residue on the relative expression level of salicylic acid pathway genes expression in cucumber seedling leaves induced by Trichoderma and Bacillus mixture microbial agents

2.4.2 對(duì)茉莉酸JA途徑的影響 關(guān)于茉莉酸途徑的誘導(dǎo)，未接種病原菌時(shí)，T1處理LOX1顯著上調(diào)、LOX2顯著下調(diào)，T2、T3處理LOX1、LOX2均顯著上調(diào)。接種病菌后CK的LOX1表達(dá)下調(diào)，LOX2表達(dá)先上調(diào)后下調(diào)；T1的LOX1表達(dá)上調(diào)，LOX2先下調(diào)，在6 d后上調(diào)；T2的LOX1、LOX2均表達(dá)下調(diào)；T3的LOX1表達(dá)下調(diào)，LOX2先上調(diào)，6 d后下調(diào)。與CK相比，海藻渣與混合菌劑處理在LOX2基因表達(dá)水平表現(xiàn)協(xié)同增效，但在LOX1基因上未表現(xiàn)；LOX1基因表達(dá)水平更多受海藻渣的影響，LOX2基因表達(dá)水平更多受微生物菌劑影響。0～6 d內(nèi)基因表達(dá)水平變化趨勢(shì)與葉片JA含量相吻合。在未接種病原菌，海藻渣本身對(duì)黃瓜幼苗JA途徑強(qiáng)于微生物菌劑，接種病原菌后，LOX1與LOX2在3和6 d時(shí)表達(dá)水平表現(xiàn)出相反的變化，但在9 d時(shí)，T1的LOX1顯著高于T2、T3，T1的LOX2顯著高于T3，表明添加海藻渣增強(qiáng)了木霉+芽胞桿菌混合菌劑對(duì)JA途徑的誘導(dǎo)能力（圖6）。

圖6 海藻渣對(duì)木霉+芽胞桿菌混合菌劑誘導(dǎo)黃瓜幼苗葉片茉莉酸途徑基因表達(dá)的影響Fig.6 Effect of seaweed residue on the relative expression level of jasmonic acid pathway genes expression in cucumber seedling leaves induced by Trichoderma and Bacillus mixture microbial agents

2.4.3 對(duì)乙烯途徑的影響 未接種病原菌時(shí)海藻渣與混合菌劑處理黃瓜根部可引起黃瓜葉片內(nèi)與乙烯相關(guān)的基因ACC、EIN2的表達(dá)改變，T1、T2處理均顯著上調(diào)且T2表達(dá)水平高于T1，T3變化不顯著。接種病菌后CK的EIN2表達(dá)上調(diào)，ACC表達(dá)下調(diào)；T1在3 d時(shí)ACC的表達(dá)水平最高，T2在3 d時(shí)EIN2的表達(dá)水平最高。EIN2基因表達(dá)水平變化與LOX2基因表達(dá)水平變化出現(xiàn)相同趨勢(shì)，ACC基因表達(dá)水平變化與LOX1基因表達(dá)水平變化出現(xiàn)相同趨勢(shì)。JA途徑與ET途徑往往是同時(shí)啟動(dòng)的，本研究的數(shù)據(jù)也驗(yàn)證了這一點(diǎn)（圖7）。

圖7 海藻渣對(duì)木霉和芽胞桿菌混合菌劑誘導(dǎo)黃瓜幼苗葉片乙烯途徑相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.7 Effect of seaweed residue on the relative expression level of ethylene pathway pathway genes expression in cucumber seedling leaves induced by Trichoderma and Bacillus mixture microbial agents

2.5 相關(guān)性分析

添加海藻渣對(duì)木霉和芽胞桿菌混合菌劑在黃瓜葉片水楊酸含量、黃瓜葉片茉莉酸含量、黃瓜根系水楊酸含量、黃瓜根系茉莉酸含量、黃瓜葉片SOD活性、黃瓜葉片CAT活性、黃瓜葉片PPO活性、黃瓜葉片PAL活性、黃瓜葉片POD活性、黃瓜葉片SA途徑基因相對(duì)表達(dá)量、黃瓜葉片ET途徑基因相對(duì)表達(dá)量的水平均為正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)均大于0.62且顯著。除CAT酶活正相關(guān)系數(shù)較低，LOX1成負(fù)相關(guān)，其他各項(xiàng)均顯著正相關(guān)。證明在木霉和芽胞桿菌混合菌劑中添加海藻渣增強(qiáng)了黃瓜苗期寄主防御反應(yīng)，海藻渣和復(fù)合菌劑表現(xiàn)出協(xié)同增效作用。

圖8 海藻渣對(duì)木霉和芽胞桿菌混合菌劑的黃瓜幼苗水楊酸、茉莉酸含量及基因表達(dá)與抗氧化活性酶變化的相關(guān)分析Fig.8 Correlation analysis between SA, JA content, gene expression and antioxidant enzymes in cucumber seedlings treated with seaweed residue

3 討論

已有研究表明，生物防治菌劑與生化類的生物刺激素復(fù)配具有協(xié)同增效應(yīng)作用[25]。但利用海藻渣與生防菌劑復(fù)配以提高生防菌劑的防病和促生效果研究并不深入。本研究明確了1%的海藻渣與棘孢木霉和解淀粉芽胞桿菌混合菌劑復(fù)配能夠提高生防菌劑對(duì)黃瓜苗期枯萎病的防治效果。海藻渣的添加，提高了棘孢木霉和解淀粉芽胞桿菌混合菌劑對(duì)黃瓜葉片及根部的水楊酸、茉莉酸積累，誘導(dǎo)葉片JA、SA、ET途徑基因高水平表達(dá)，葉片抗氧化酶系活性提高，協(xié)同增效作用明顯。葉片和根系抗氧化酶系和水楊酸途徑相關(guān)基因的激活是協(xié)同增效的主要機(jī)理。

生防微生物誘導(dǎo)植物抗性氧化酶的報(bào)導(dǎo)較多[26,27]。Li等[28]用解淀粉芽胞桿菌處理的番茄植株，其PPO和POD活性顯著提高，對(duì)青枯病病原菌Ralstoniasolanacearum的防效也明顯增強(qiáng)；Zhang等[29]用哈茨木霉處理苦瓜也觀察到了類似的效果?？剐匝趸柑岣呖蓽p少病原菌侵染誘導(dǎo)寄主積累過(guò)多的活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生對(duì)寄主細(xì)胞的損傷，但恰當(dāng)含量的ROS則能激活植物的防御反應(yīng)，然而目前還不清楚抗性氧化酶表達(dá)水平與誘導(dǎo)抗性的ROS信號(hào)間的關(guān)系，兩者間可能存在一種平衡關(guān)系。

生防菌誘導(dǎo)寄主植物水楊酸和茉莉酸信號(hào)途徑也有大量的報(bào)導(dǎo)[30]。Shukla等[31]綜述了海藻提取物作為生物刺激素在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用，海藻提取物中存在的某些生物活性激發(fā)子可以激活病原體相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMPs），從而啟動(dòng)和/或誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性反應(yīng)。柴慶凱等[32]研究表明解淀粉芽胞桿菌LJ02可以誘導(dǎo)黃瓜對(duì)灰霉病菌抗性，其葉部與根部PR-1基因過(guò)表達(dá)，證明了解淀粉芽胞桿菌對(duì)SA通路的激活。Sudisha等[33]研究表明，綠木霉在番茄發(fā)生枯萎病時(shí)其菌絲主要誘導(dǎo)SA途徑基因PDF1基因上調(diào)表達(dá)，而其代謝產(chǎn)物主要誘導(dǎo)JA途徑基因PR1a上調(diào)表達(dá)。然而已有報(bào)導(dǎo)均僅是說(shuō)明單一菌劑對(duì)防御反應(yīng)的誘導(dǎo)效應(yīng)，不能反映海藻渣等物質(zhì)在混合制劑中的作用，更無(wú)法反映海藻渣、木霉+芽胞桿菌、植物三方互作的復(fù)雜關(guān)系。在這種復(fù)雜互作關(guān)系中，可能存在對(duì)黃瓜防御反應(yīng)直接或間接的誘導(dǎo)效應(yīng)，即海藻渣或生防菌本身誘導(dǎo)作用或通過(guò)雙方互作或通過(guò)改變植物響應(yīng)的敏感性等途徑實(shí)現(xiàn)協(xié)同誘導(dǎo)。本研究發(fā)現(xiàn)黃瓜葉片和根系水楊酸信號(hào)的變化與海藻渣+木霉+芽胞桿菌誘導(dǎo)的防御反應(yīng)呈正相關(guān)，而茉莉酸信號(hào)途徑則呈現(xiàn)復(fù)雜的變化，暗示海藻渣成分、木霉和芽胞桿菌可能有共同正調(diào)控黃瓜SA通路防御反應(yīng)基因的機(jī)制，而三者對(duì)黃瓜茉莉酸途徑的調(diào)控機(jī)制可能并不是完全協(xié)調(diào)的。值得提出的是木霉很多情況下是誘導(dǎo)植物茉莉酸途徑上調(diào)表達(dá)，從而發(fā)生系統(tǒng)誘導(dǎo)抗性（induced systemic resistance, ISR），但海藻渣+木霉+芽胞桿菌的復(fù)雜互作可能改變了生防木霉的誘導(dǎo)防御反應(yīng)的信號(hào)通路，調(diào)動(dòng)其誘導(dǎo)寄主植物水楊酸的潛力。另外，海藻渣也可能通過(guò)改變木霉和芽胞桿菌之間或兩者與黃瓜根系之間的關(guān)系，從而形成了復(fù)雜的誘導(dǎo)抗性機(jī)制。雖然目前的試驗(yàn)無(wú)法完全解釋這一復(fù)雜的機(jī)制，但添加海藻渣的兩種生防菌復(fù)合制劑提高了對(duì)黃瓜根系和葉片的防御反應(yīng)相關(guān)酶活和信號(hào)物質(zhì)產(chǎn)生的誘導(dǎo)效應(yīng)，證明了復(fù)合生防菌劑添加海藻渣的協(xié)同增效價(jià)值。由于本研究是在盆栽和苗期條件下明確了海藻渣+木霉+芽胞桿菌防治黃瓜枯萎病的機(jī)理，還需要在田間和成株期條件下進(jìn)一步觀察三方互作的協(xié)同防病和系統(tǒng)誘導(dǎo)抗性效應(yīng)。