氣相色譜-氫火焰離子化法測(cè)定茶葉中5種可溶性糖的含量

◎ 蘇美丞，李 俊，蔡 滔，王 震，祝 愿，賴 飛，王藝蓉，王 志

（貴州省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550004）

茶葉中的糖類物質(zhì)含量占干物質(zhì)的20%～25%，除構(gòu)成細(xì)胞壁的纖維素、木質(zhì)素、果膠質(zhì)外，還有部分游離糖、結(jié)合態(tài)糖脂、蛋白糖等多糖，是茶葉中三大自然物質(zhì)之一。茶葉中可溶性糖類中主要單糖是阿拉伯糖、葡萄糖、果糖、半乳糖及甘露糖等，含量為0.1%～1.0%，雙糖有蔗糖、麥芽糖，三糖有棉子糖[1-2]。茶葉中可溶性糖是茶葉甜味成分之一，成品茶中可溶性總糖的含量因地區(qū)、品種、茶類不同的制茶技術(shù)而異，采摘鮮葉的老嫩度不同，含糖量也不同[3-5]。例如，六大茶類中，烏龍茶的可溶性糖含量最高。茶葉中糖類的存在與轉(zhuǎn)化對(duì)成品茶的香氣、滋味、湯色等都有直接的影響，加工過(guò)程中糖類的分解縮合反應(yīng)不斷進(jìn)行，糖含量為動(dòng)態(tài)變化，而且不同的加工工藝內(nèi)在的化學(xué)反應(yīng)不同，糖的變化也不同[6-8]。因此，檢測(cè)茶葉中可溶性糖成分至關(guān)重要。

目前，可溶性糖的檢測(cè)方法主要包括比色法、紅外檢測(cè)法、高效液相色譜法、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法和毛細(xì)管電泳法[9-15]。薄層色譜法和酶法適用范圍不廣，而高效液相色譜結(jié)合蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（Evaporative Light Scattering Detector，ELSD）或示差折光檢測(cè)器（Refractive Ⅰndex Detector，RⅠD）在可溶性糖檢測(cè)中應(yīng)用較廣[16-19]；但在分離多種糖組分方面仍存有一定的局限性，容易受到多組分分離度的影響[20-23]。當(dāng)前方法僅側(cè)重于少數(shù)單糖的定量分析，茶葉中多種可溶性糖的同時(shí)檢測(cè)缺少統(tǒng)一的提取和分析方法。鑒于茶葉可溶性糖在茶葉品質(zhì)和茶樹生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的重要性，建立茶葉中多種可溶性糖同時(shí)檢測(cè)方法，有利于進(jìn)一步推進(jìn)茶葉品質(zhì)研究工作。

氣相色譜法由于色譜分離效果較好，且氫火焰離子化檢測(cè)器較為穩(wěn)定和普遍，是同時(shí)檢測(cè)茶葉多種可溶性糖的有效手段之一，可克服當(dāng)前方法分離度不夠、物質(zhì)成分單一、方法穩(wěn)定性差等系列問(wèn)題[24-28]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶葉樣品采購(gòu)于市場(chǎng)，選擇不少于200 g茶葉經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60目篩，制成茶葉粉末樣品。

5種可溶性糖標(biāo)準(zhǔn)品：果糖（CAS號(hào)：7660-25-5）、葡萄糖（CAS號(hào)：50-99-7）、山梨糖醇（CAS號(hào)：50-70-4）、肌糖（CAS號(hào)：87-89-8）、蔗糖（CAS號(hào)：57-50-1），含量均≥99.0%。乙腈（CAS號(hào)：75-05-8，色譜純，美國(guó)天地）；吡啶（CAS號(hào)：110-86-1，分析純，國(guó)藥集團(tuán)，需經(jīng)過(guò)重蒸后使用）；N,O-雙(三甲基硅基)三氟乙酰胺（CAS號(hào)：25561-30-2，含量≥99.0%，國(guó)藥集團(tuán)）；甲氧胺鹽酸鹽（CAS號(hào)：593-56-6，含量≥98.5%，國(guó)藥集團(tuán)）；苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（CAS號(hào)：1464-44-4，含量≥99.0%，國(guó)藥集團(tuán)）。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B氣相色譜儀，安捷倫，配有氫火焰離子化檢測(cè)器；AL-104分析天平，梅特勒-托利多。

1.3 樣品前處理方法

提?。悍Q量0.200 0 g茶葉粉末樣品于10 mL玻璃離心管中，加入苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷內(nèi)標(biāo)溶液和10 mL的1∶1（V∶V）的乙腈水溶液，振蕩提取30 min，4 000 r·min-1下離心10 min，取0.5 mL上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管中，用氮?dú)獯蹈?，待衍生?/p>

衍生化：氮?dú)獯蹈珊蟮臉右褐屑尤?50 μL甲氧胺鹽酸鹽溶液，80 ℃水浴30 min，放置室溫冷卻，然后再加入150 μL的N,O-雙(三甲基硅基)三氟乙酰胺，80 ℃水浴60 min，室溫靜置1 h，再次離心后取上清液經(jīng)氣相色譜分析。

1.4 儀器條件

色譜柱：（5%苯基）-甲基聚硅氧烷（HP-5）石英毛細(xì)管柱（60 m×250 μm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度：280 ℃；檢測(cè)器溫度：280 ℃；色譜柱程序升溫：80 ℃保持2 min，然后以5 ℃·min-1程序升溫至240 ℃，保持5 min，再以10 ℃·min-1的速度上升至300 ℃，保持15 min；載氣：氮?dú)猓兌取?9.999%，流速：20 mL·min-1；燃?xì)猓簹錃?，純度?9.999%，流速：40 mL·min-1；助燃?xì)猓嚎諝?，純度?9.999%，流速：400 mL·min-1；進(jìn)樣量：1.0 μL；分流比：20∶ 1，3.0 min后打開分流閥和隔墊吹掃閥。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液配制：分別準(zhǔn)確稱取5種水溶性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（精確至0.000 2 g），用乙腈水溶液（1∶1，V∶V）配置成可溶性糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（果糖10 mg·mL-1；葡 萄 糖 20 mg·mL-1； 山 梨 糖 醇 4 mg·mL-1； 肌 糖4 mg·mL-1；蔗糖 40 mg·mL-1），0 ～ 4 ℃避光保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：準(zhǔn)確吸取一定量的5種可溶性糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于同一25 mL容量瓶中，用丙酮定容至刻度，配制成5個(gè)不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（果糖 5 ～ 1 000 mg·L-1； 葡 萄 糖 10 ～ 2 000 mg·L-1； 山梨糖醇 2 ～ 400 mg·L-1；肌糖 2 ～ 400 mg·L-1；蔗糖20 ～ 4 000 mg·L-1），0 ～ 4 ℃避光保存。

內(nèi)標(biāo)溶液：選擇苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷作為內(nèi)標(biāo)，準(zhǔn)確量取苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（精確至0.000 2 g），乙腈水溶液（1∶1，V∶V）配置成10 mg·mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液，0～4 ℃避保存光。

標(biāo)準(zhǔn)曲線配制：分別吸取0.5 mL 5個(gè)濃度的可溶性糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于1.5 mL離心管中，各加入苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷內(nèi)標(biāo)溶液混勻。按1.3進(jìn)行衍生化處理后經(jīng)氣相色譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品提取方法比較

通過(guò)可溶性糖添加回收率考察2種樣品中目標(biāo)物的提取方式（超聲與振蕩）在不同提取時(shí)間下的提取效率。具體步驟為稱取0.200 0 g茶葉粉末樣品加入一定量的可溶性糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷內(nèi)標(biāo)溶液和10 mL的的乙腈水溶液（1∶1，V∶V），分別用超聲和振蕩提取10 min、20 min、30 min，4 000 r·min-1下離心10 min，取0.5 mL上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管中，用氮?dú)獯蹈?，衍生后?jīng)氣相色譜分析，每組進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。

結(jié)果表明，隨時(shí)間增加，目標(biāo)物提取效果越好，其中30 min的提取時(shí)間對(duì)目標(biāo)物的提取效果最好，回收率在75%～120%。超聲和振蕩的提取效果幾乎無(wú)差別，但由于超聲提取重現(xiàn)性較差，且綜合超聲提取具有噪聲大的弱點(diǎn)，選擇振蕩提取作為本方法的提取方式。

2.2 凈化條件的確定

在提取條件確定后，本實(shí)驗(yàn)嘗試?yán)肅18固相萃取柱凈化提取液，以減少樣品中雜質(zhì)對(duì)目標(biāo)峰的干擾，進(jìn)一步提高色譜柱的柱效。通過(guò)比較未凈化與C18固相萃取小柱凈化后的色譜圖信噪比及雜質(zhì)干擾情況，結(jié)果表明2種方法試驗(yàn)后的目標(biāo)物峰都沒(méi)有被干擾，相應(yīng)的信噪比差異不大，表明C18固相萃取小柱的凈化效果并不明顯。故不考慮凈化，這樣能夠節(jié)省分析時(shí)間、簡(jiǎn)化分析步驟、提高分析效率和節(jié)省實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)。

2.3 儀器條件選擇

氫火焰離子化檢測(cè)器具有高靈敏度且能夠檢測(cè)出大部分含碳有機(jī)物，相較于質(zhì)譜檢測(cè)器，氫火焰離子化檢測(cè)器更為穩(wěn)定和普及，且線性范圍大，可克服當(dāng)前方法分離度不夠、物質(zhì)成分單一、方法穩(wěn)定性差等問(wèn)題。因此，采用氫火焰離子化（Lame Ⅰonization Detector，F(xiàn)ⅠD）檢測(cè)器作為本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)器。

為分離目標(biāo)物和干擾雜質(zhì)，保證分析的靈敏度，通過(guò)調(diào)整程序升溫條件，將出鋒時(shí)間控制在60 min內(nèi)，盡量使干擾分離；采用（5%苯基）-甲基聚硅氧烷（HP-5）石英毛細(xì)管柱（60 m×250 μm，0.25 μm）對(duì)5種可溶性糖進(jìn)行分離，獲得的樣品色譜圖見圖1。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍

采用內(nèi)標(biāo)法定量，以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值為縱坐標(biāo)（Y），以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量與內(nèi)標(biāo)量的比值為橫坐標(biāo)（X）構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程及相關(guān)系數(shù)（R2），標(biāo)準(zhǔn)曲線、回歸方程和相關(guān)系數(shù)（R2）見表1。從表1可知，5種可溶性糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性較好，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.999。

表1 茶葉中5種可溶性糖工作曲線表

2.5 回收率、精密度及檢測(cè)限

在樣品中添加一定量的可溶性糖，按照上述前處理進(jìn)行提取和衍生化后上機(jī)檢測(cè)。檢測(cè)限按照儀器噪音的3倍與標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程中的斜率的比值確定。

5種可溶性糖在茶葉中的回收率在81.74%～100.55%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.04%～9.49%，檢測(cè)限在9.5～12.2 ng·mL-1，說(shuō)明本方法回收率高、精密度好，方法可靠；能夠準(zhǔn)確檢測(cè)出茶葉中5種可溶性糖的含量。具體回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和檢測(cè)限見表2。

表2 方法檢出限、精密度和回收率表（n=5）

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

采用本方法對(duì)4種不同類型的茶葉（抹茶、紅茶、白茶、綠茶）進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果見表3。實(shí)際樣品檢測(cè)中，5種可溶性糖均有檢出。果糖、葡萄糖在抹茶中含量最高，紅茶和白茶次之，綠茶中最低；山梨糖醇和肌糖在抹茶、紅茶和白茶中的含量明顯高于綠茶；蔗糖在抹茶和綠茶中的含量明顯高于紅茶和綠茶。

表3 不同類型茶葉可溶性糖含量表

3 結(jié)論

本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)建立了一種基于氣相色譜-氫火焰離子化法測(cè)定茶葉中5種可溶性糖的檢測(cè)方法，方法回收率較高，精密度較好，能夠?qū)崿F(xiàn)茶葉中5種可溶性糖的同步檢測(cè)。