單細(xì)胞質(zhì)譜分析方法研究進(jìn)展

王舉鐸　宋佳峰　李暢　戴新華　方向　龔曉云　葉子弘

摘 要 細(xì)胞的個(gè)體差異性對于生物體生理功能的運(yùn)行至關(guān)重要， 準(zhǔn)確闡釋相關(guān)生物學(xué)機(jī)理需要以單細(xì)胞化學(xué)組分的準(zhǔn)確測量為基礎(chǔ)。然而，由于單細(xì)胞中的物質(zhì)含量低、組成復(fù)雜，且不同物質(zhì)的含量差異大，導(dǎo)致單細(xì)胞分析的技術(shù)難度極大。質(zhì)譜技術(shù)憑借其高靈敏度、高特異性，以及強(qiáng)大的結(jié)構(gòu)解析能力，近年來在單細(xì)胞分析研究中得到了廣泛應(yīng)用。研究者已建立了多種質(zhì)譜分析方法，實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞中不同物質(zhì)的準(zhǔn)確測量。從離子化技術(shù)的角度，單細(xì)胞質(zhì)譜分析方法目前主要包括三類，即納升電噴霧離子化質(zhì)譜法、激光解吸附離子化質(zhì)譜法和二次離子質(zhì)譜法。本文對近年基于上述三種離子化技術(shù)的單細(xì)胞質(zhì)譜分析方法的研究進(jìn)展進(jìn)行了歸納和總結(jié)，對單細(xì)胞質(zhì)譜分析方法未來的發(fā)展趨勢進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞 質(zhì)譜; 單細(xì)胞分析; 離子化; 納升電噴霧離子化; 激光解吸附離子化; 二次離子質(zhì)譜; 評述

1 單細(xì)胞分析方法的研究意義

細(xì)胞是生物體結(jié)構(gòu)和功能的基本單位。細(xì)胞具有顯著的異質(zhì)性，這種個(gè)體差異性的存在，對于生物體生理功能的正常運(yùn)行至關(guān)重要。為了更深層次地了解生命活動(dòng)的本質(zhì)，獲得更全面和精準(zhǔn)的細(xì)胞生物學(xué)信息，必須從單細(xì)胞水平進(jìn)行相關(guān)研究[1]。目前，單細(xì)胞分析主要進(jìn)行細(xì)胞表型、基因型和化學(xué)組分的準(zhǔn)確測量[2]，形成了單細(xì)胞多組學(xué)研究，在細(xì)胞生物學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)等基礎(chǔ)和應(yīng)用科學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[3，4]。

單細(xì)胞分析的實(shí)現(xiàn)有許多需要解決的技術(shù)難題[5]。首先，單細(xì)胞的體積微小，導(dǎo)致一些傳統(tǒng)的分離富集操作手段難以實(shí)施;其次，單細(xì)胞中的物質(zhì)含量極低，許多物質(zhì)只有amol級別甚至更低，對測量方法的靈敏度提出了極高要求;再次， 單細(xì)胞中的物質(zhì)組成復(fù)雜，不同物質(zhì)之間存在相互干擾，尤其是結(jié)構(gòu)類似物之間，對檢測方法的特異性提出了較高要求。此外，細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間許多復(fù)雜的動(dòng)態(tài)生理過程也會(huì)對測量結(jié)果帶來影響[1]。

目前，研究者已建立了一些單細(xì)胞分析方法，包括熒光成像法、電化學(xué)法，以及質(zhì)譜法等。熒光成像法通過熒光探針對目標(biāo)分子進(jìn)行標(biāo)記，可實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)組分含量和空間分布的實(shí)時(shí)監(jiān)測[6，7]。然而，熒光成像法需要對目標(biāo)分子進(jìn)行標(biāo)記，過程較為復(fù)雜，并且會(huì)改變待測分子的理化性質(zhì)，這使得熒光成像的檢測對象范圍受到了較大的限制。電化學(xué)法可對目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析，在神經(jīng)元電生理活動(dòng)和神經(jīng)遞質(zhì)分泌等研究中得到了廣泛應(yīng)用[8]。然而，電化學(xué)方法要求目標(biāo)物質(zhì)能形成氧化還原電對，對于很多不易發(fā)生氧化還原反應(yīng)的物質(zhì)，電化學(xué)法難以進(jìn)行檢測;此外，電化學(xué)法難以進(jìn)行多組分同時(shí)分析。

近年來，質(zhì)譜（Mass spectrometry， MS）技術(shù)作為一種高靈敏度、高特異性和非標(biāo)記檢測技術(shù)在單細(xì)胞分析中得到了越來越廣泛的應(yīng)用。它不僅可實(shí)現(xiàn)多組分同時(shí)分析，還可對待測分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。目前，研究者已經(jīng)發(fā)展出基于不同離子化技術(shù)的單細(xì)胞質(zhì)譜分析方法。其中有三類最具代表性，包括納升電噴霧離子化（Nano-electrospray ionization， Nano-ESI）、激光解吸附離子化（Laser desorption ionization， LDI）和二次離子質(zhì)譜（Secondary ion mass spectrometry， SIMS）， 這三類方法互為補(bǔ)充，各具優(yōu)勢。本文主要對近年出現(xiàn)的一些代表性技術(shù)與方法進(jìn)行總結(jié)，對單細(xì)胞質(zhì)譜分析方法的前沿研究動(dòng)態(tài)進(jìn)行了綜述。

2 單細(xì)胞質(zhì)譜分析方法研究的最新進(jìn)展

2.1 基于Nano-ESI的單細(xì)胞質(zhì)譜分析法

Nano-ESI是一種具有高離子化效率的“軟”離子源技術(shù)，在生命科學(xué)中具有非常廣泛的應(yīng)用[9，10]。將溶液樣品置于納噴霧噴針（Nano-tip）中，通過電極向樣品溶液施加高壓電（1～2 kV）。在高壓電場的作用下，樣品溶液從Nano-tip尖端噴出，形成電噴霧?；贜ano-ESI的單細(xì)胞分析方法一般使用Nano-tip進(jìn)行取樣[11]。在顯微鏡的實(shí)時(shí)觀察下，通過三維移動(dòng)機(jī)械臂控制Nano-tip從活體細(xì)胞的目標(biāo)區(qū)域直接取樣。取樣后，可通過Nano-ESI進(jìn)行直接離子化檢測，或通過與毛細(xì)管電泳等分離技術(shù)聯(lián)用，對不同化合物進(jìn)行分離，然后再檢測。同其它離子化技術(shù)相比，Nano-ESI具有直接、快速和活體取樣的優(yōu)勢，檢測過程中無需基質(zhì)和真空等特殊條件。近年來，隨著檢測需求的不斷提高，研究者從取樣、分離和離子化等技術(shù)層面對基于Nano-ESI的單細(xì)胞分析方法進(jìn)行了改進(jìn)和提升。

在取樣技術(shù)的研發(fā)方面， Zhang等[12]提出了一種基于液滴微萃取的單細(xì)胞取樣方法。該方法首先在Nano-tip尖端吸入萃取溶劑，然后將溶劑滴加到細(xì)胞的表面，將細(xì)胞代謝物萃取到液滴中，再將液滴吸回至Nano-tip中用于后續(xù)的檢測。通過改變?nèi)軇?，利用不同化合物在溶劑中溶解性的不同，可在一定程度上?shí)現(xiàn)不同種類化合物的分離和檢測，同時(shí)降低鹽和培養(yǎng)基等干擾基質(zhì)的影響[13]。為提高萃取效率，實(shí)現(xiàn)定量檢測，F(xiàn)eng等[14]進(jìn)一步發(fā)展了一種陣列液滴微萃取技術(shù)（圖1）。陣列的使用避免了萃取溶劑的不規(guī)則擴(kuò)散，提高了萃取效率和萃取過程的可控性。通過添加同位素內(nèi)標(biāo)，可實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞代謝物的定量分析。

Liu等[15]發(fā)展了一種更為便捷的“T”字形微型多功能取樣探針，用于貼壁細(xì)胞的取樣和分析。該探針使用計(jì)算機(jī)微刻蝕的聚碳酸酯材料作為基底，通過夾持的方式將兩個(gè)Nano-tip和一根毛細(xì)管通過一個(gè)三通接口，以“T”字形方式集成在一起。一個(gè)Nano-tip用于取樣，將細(xì)胞質(zhì)吸入探針中，經(jīng)過三通接口，在毛細(xì)管溶劑的帶動(dòng)下進(jìn)入用于噴霧的另一個(gè)Nano-tip，實(shí)現(xiàn)離子化。該探針將取樣和離子化過程銜接在一起，減少了前處理時(shí)間，提高了檢測靈敏度和重現(xiàn)性。通過擴(kuò)大取樣Nano-tip的內(nèi)徑，將單細(xì)胞直接吸入探針中，還可實(shí)現(xiàn)對懸浮細(xì)胞的取樣和分析[16]。

Yin等[17]發(fā)展了一種基于局部電滲流萃取的定量分析方法。該方法在探針內(nèi)部填充了疏水性電解質(zhì)溶液， 探針內(nèi)和細(xì)胞培養(yǎng)基中分別放置了一根電極， 在兩根電極上施加特定電壓，利用電滲流將代謝物從細(xì)胞中萃取至探針內(nèi)部。取樣完成后，再將探針置于內(nèi)標(biāo)溶液中，萃取適量內(nèi)標(biāo)至探針中，進(jìn)行定量分析。該方法避免了對細(xì)胞質(zhì)的直接抽取，通過電滲流進(jìn)行目標(biāo)分子萃取的方式更容易操控。

Cahill等[18]發(fā)展了一種具有更高通量的取樣方法。該方法將單細(xì)胞打印機(jī)技術(shù)（Single cell printer， SCP）與液相渦旋俘獲技術(shù)（Liquid vortex capture， LVC）相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞樣品的制備與細(xì)胞代謝物的有效萃取（圖2）。單細(xì)胞打印機(jī)利用壓電噴射原理產(chǎn)生包裹單個(gè)細(xì)胞的小液滴，實(shí)現(xiàn)對不同細(xì)胞個(gè)體的分離。產(chǎn)生的單細(xì)胞液滴進(jìn)入俘獲裝置的萃取溶劑中，經(jīng)過細(xì)胞裂解和萃取，進(jìn)入質(zhì)譜離子源中實(shí)現(xiàn)離子化。該方法檢測通量明顯高于其它方法。但由于單細(xì)胞打印機(jī)在打印過程中無法對細(xì)胞進(jìn)行定位和篩選，因此該方法無法針對特定目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行檢測分析。

為降低不同化合物之間的相互干擾，提高化合物的鑒定數(shù)量，痕量物質(zhì)分離技術(shù)如毛細(xì)管電泳（Capillary electrophoresis， CE）和納升液相色譜（Nano-liquid chromatography， NanoLC）被用于單細(xì)胞樣品的分離。Kawai等[19]發(fā)展了一種改進(jìn)的CE系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了對單細(xì)胞代謝物的高靈敏度分析。該系統(tǒng)使用了一種基于等速電泳和堆積原理的大體積雙重預(yù)富集技術(shù)。該技術(shù)在實(shí)施過程中，在毛細(xì)管兩端施加了一個(gè)逆向液相壓力，通過場放大樣品堆積效應(yīng)讓代謝物富集于毛細(xì)管的前端，同時(shí)分離掉背景基質(zhì)。之后停止施加液相壓力，通過等速電泳實(shí)現(xiàn)代謝物的有效分離和檢測。該方法可兼容較大的樣品體積，為單細(xì)胞樣品前處理提供了便利。

Kelly課題組發(fā)展了一種基于NanoLC的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法[20]。該方法使用了一種內(nèi)徑為20 μm的自主填充毛細(xì)管NanoLC柱進(jìn)行單細(xì)胞蛋白質(zhì)酶解樣品的分離， 樣品由課題組之前所發(fā)展的原位納米液滴痕量樣品處理技術(shù)制備[21]， 細(xì)胞裂解、烷基化和酶解等過程均在原位液滴中完成。通過上述方法，實(shí)現(xiàn)了單個(gè)宮頸癌細(xì)胞（Hela）中300種以上蛋白質(zhì)的組學(xué)分析。

在離子化技術(shù)的改進(jìn)方面，主要是提高離子化效率和基質(zhì)耐受性以獲得更高的檢測靈敏度，以及延長離子化時(shí)間以獲得更多代謝物的檢測信息。Huang課題組將前期工作中發(fā)展的誘導(dǎo)納噴霧技術(shù)（Induced nano-ESI， InESI）[22]與膜片鉗技術(shù)相結(jié)合，用于單細(xì)胞樣品的分析[23]。InESI的電極與樣品溶液不直接接觸，交流高壓電場間接作用于樣品溶液產(chǎn)生噴霧，避免了電極反應(yīng)對樣品組分帶來的干擾，延長了離子化時(shí)間，提高了基質(zhì)耐受性。利用該方法實(shí)現(xiàn)了單個(gè)神經(jīng)細(xì)胞中超過50種重要代謝物的快速分析[23]。通過進(jìn)一步結(jié)合電生理學(xué)、分子生物學(xué)以及動(dòng)物行為學(xué)技術(shù)，揭示了小鼠腦內(nèi)由尿刊酸（Urocanic acid， UCA）合成谷氨酸的代謝新通路，及其參與日光照射改善小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的分子與神經(jīng)環(huán)路機(jī)制（圖3）[24]。

Zhang課題組將前期研究中發(fā)展的液滴微萃取取樣方法[12]與皮升電噴霧技術(shù)（Pico-ESI）相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞代謝物的組學(xué)分析[25]。Pico-ESI也是一種電極非接觸式納噴霧離子源， 與InESI所不同的是，Pico-ESI使用了脈沖直流電場實(shí)現(xiàn)納噴霧的發(fā)生。Pico-ESI的金屬電極需要插入Nano-tip中，但是與樣品溶液無接觸。Pico-ESI可極大地延長噴霧時(shí)間，從而獲得更多的譜圖信息。采用該方法可實(shí)現(xiàn)人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（A172）中三百余種磷脂的檢測。

雖然基于Nano-ESI的單細(xì)胞分析方法在活體單細(xì)胞分析中具有很多優(yōu)勢，也取得了許多研究成果，但總體而言，這類方法在操作上較為繁瑣，尤其是取樣過程需要人為控制三維移動(dòng)機(jī)械臂夾持Nano-tip對單細(xì)胞進(jìn)行逐一取樣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，通量不高。此外，這類方法無法進(jìn)行成像分析，不能獲得關(guān)于代謝物空間分布的精確信息。這也在一定程度上限制了這類方法的應(yīng)用范圍。

2.2 基于LDI的單細(xì)胞質(zhì)譜分析方法

LDI是一種利用特定能量的激光對樣品進(jìn)行解吸附和離子化的技術(shù)[26]。基質(zhì)輔助激光解吸附離子化（Matrix-assisted laser desorption/ionization， MALDI）在LDI的基礎(chǔ)上向樣品中添加了輔助基質(zhì)[27]。輔助基質(zhì)可吸收和傳遞激光能量給樣品分子，從而提高樣品分子的離子化效率。同基于Nano-ESI的單細(xì)胞分析方法相比，基于LDI的方法可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞代謝物的原位分析，無需借助三維機(jī)械臂進(jìn)行繁瑣的取樣操作，使用過程較為簡單。此外，LDI具有成像分析的優(yōu)勢，可獲得代謝物空間分布的圖像化信息?？臻g分辨率是成像分析的重要指標(biāo)， 提高成像分辨率是LDI單細(xì)胞分析方法的重要研究內(nèi)容。另外，LDI需要待測分子能夠直接或者在基質(zhì)的輔助下吸收激光的能量以實(shí)現(xiàn)離子化。因此，發(fā)展更高效率的基質(zhì)材料，提高待測分子的離子化效率和檢測靈敏度一直是LDI的重點(diǎn)研究內(nèi)容。

傳統(tǒng)LDI的成像分辨率通常為5～50 μm[28]，難以進(jìn)行亞細(xì)胞水平的成像分析。為獲得更高的空間分辨率，Kompauer等[29]發(fā)展了一套基于新型紫外激光聚焦系統(tǒng)的MALDI成像分析系統(tǒng)。通過使用新型聚焦透鏡，將紫外激光（337 nm）光斑直徑縮小至1.4 μm。該成像系統(tǒng)使用了一種離子反射采集模式，即離子解吸附后飛行的方向與激光照射的方向相反（圖4）。這樣的離子采集模式可顯著增加樣品切片的自由工作距離。樣品表面與聚焦物鏡之間的距離可達(dá)18 mm。普通的MALDI成像光學(xué)系統(tǒng)只有不超過1 mm的自由工作距離。利用該系統(tǒng)，在亞細(xì)胞水平上實(shí)現(xiàn)了對大草履蟲纖毛和口腔溝等不同部位代謝物的成像分析。

Wang等[30]發(fā)展了一種基于真空紫外LDI的提高單細(xì)胞成像分辨率的方法。該方法使用了一種專門設(shè)計(jì)的光路系統(tǒng)，通過非球面MgF2透鏡對紫外激光進(jìn)行聚焦，所得光斑在樣品表面單點(diǎn)剝蝕的直徑可控制在～700 nm。 該成像系統(tǒng)顯著提高了LDI的成像分辨率，通過改變激光強(qiáng)度，還可實(shí)現(xiàn)對不同分子和分子碎片的選擇性檢測，用于分子識(shí)別和定性分析。

Yin等[31]提出了另一種基于近場激光解吸附技術(shù)（Near-field desorption postionization， NDPI）的提高LDI成像分辨率的方法。該方法首先利用原子力顯微鏡的表面形貌探測技術(shù)對樣品的表面形貌進(jìn)行解析，然后在近場條件下使用激光對樣品表面進(jìn)行解吸附（圖5）。近場解吸附的方式顯著縮小了光斑大小，突破了光學(xué)衍射極限，將成像的橫向分辨率提高至350 nm。解吸附后，通過第二束激光對氣化的樣品分子進(jìn)行二次離子化，提高離子化效率。通過添加輔助基質(zhì)，將近場解吸附技術(shù)與MALDI離子化技術(shù)相結(jié)合，可進(jìn)一步提高離子化效率和檢測靈敏度。進(jìn)一步將NDPI技術(shù)應(yīng)用于藥物成像分析研究，可在亞細(xì)胞水平實(shí)現(xiàn)兩種吖啶類結(jié)構(gòu)類似物藥物（普羅黃素（Proflavine）和依沙吖啶（Ethacridine））的成像分析[32]。

LDI的解吸附能力很強(qiáng)，但是離子化能力比較有限。Lee等[33]通過使用電噴霧（Electrospray ionization， ESI）輔助離子化，顯著提高了LDI的離子化效率。該方法利用LDI對樣品表面進(jìn)行解吸附。同時(shí)將一束ESI噴霧射向LDI解吸附的區(qū)域。ESI產(chǎn)生的帶電液滴攜帶著解吸附產(chǎn)生的待測分子向質(zhì)譜進(jìn)樣口運(yùn)動(dòng)，完成電荷傳遞，實(shí)現(xiàn)待測分子的離子化。ESI強(qiáng)大的輔助離子化能力使得該技術(shù)對賴氨酸的檢出限達(dá)到了2 amol。采用該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了動(dòng)物單細(xì)胞中多種代謝物組分的實(shí)時(shí)分析。

MALDI通過添加基質(zhì)的方式顯著提高了LDI的離子化效率。發(fā)展新的輔助基質(zhì)是基于MALDI的單細(xì)胞分析方法的重要研究內(nèi)容。新基質(zhì)的研發(fā)一方面可提高一些物質(zhì)的離子化效率，從而提高檢測靈敏度;另一方面可使一些原本難以離子化的物質(zhì)實(shí)現(xiàn)離子化，拓展可檢測物質(zhì)的范圍。α-氰基-4-羥基肉桂酸、2，5-二羥基苯甲酸和9-氨基吖啶是目前最常用的基質(zhì)[29，34]。其它一些具有良好離子化效果的新基質(zhì)也陸續(xù)被篩選出來，如3，4-二甲氧基肉桂酸[34]和1，1′-聯(lián)萘-2，2′-二胺（1，1′-Binaphthyl-2，2′-diamine， BNDM）[35]等。此外，一些非有機(jī)小分子基質(zhì)也能顯著提高細(xì)胞代謝物的離子化效率，如氟化石墨烯納米片層材料[36]和金納米復(fù)合材料[37]等。

Shanta等[38]發(fā)展了一種多功能金薄膜基底材料，實(shí)現(xiàn)了對單細(xì)胞的捕獲和脂質(zhì)化合物離子化效率的提升。該方法利用光刻蝕和電子束沉積技術(shù)在玻璃基底上鋪設(shè)了一層金膜多孔陣列， 該陣列保證了較高的單細(xì)胞捕獲率和離子化效率。捕獲完成后，通過電沉積技術(shù)精確地向小孔中噴灑100 nL MALDI基質(zhì)溶液。金膜陣列的使用，兼具表面增強(qiáng)熒光效應(yīng)和MALDI離子化效率提升效果。利用該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對萊茵衣藻單細(xì)胞脂質(zhì)成分的除草劑毒理學(xué)研究。

Nie課題組采用了另一種提高待測分子檢測靈敏度的思路，發(fā)展了一系列分子探針，利用共價(jià)鍵合的方式對單細(xì)胞中的待測分子進(jìn)行標(biāo)記[39，40]。標(biāo)記后，通過LDI進(jìn)行離子化， 分子探針在LDI的作用下與待測分子之間的共價(jià)鍵發(fā)生斷裂，形成離子，進(jìn)入質(zhì)譜完成檢測。該方法具有原位、高通量檢測的優(yōu)勢。通過這種方式對不同細(xì)胞系單細(xì)胞表面的唾液酸復(fù)合物進(jìn)行了定量分析，檢出限可達(dá)5 fmol（圖6）[39]。采用類似方式，進(jìn)一步對細(xì)胞表面不同種類的多糖進(jìn)行了表征和成像分析，利用細(xì)胞表面多糖種類和數(shù)量的變化研究細(xì)胞抗藥性[40]。

Wang等[41]發(fā)展了一種基于金納米粒子的分子探針，實(shí)現(xiàn)了對細(xì)胞表面標(biāo)志物的信號(hào)放大和高靈敏度檢測。該方法首先在金納米粒子表面標(biāo)記上分子探針和抗體。通過表面帶有特異性抗體的金膜芯片捕獲待測細(xì)胞。借助抗原抗體反應(yīng)，用標(biāo)記好的金納米粒子對細(xì)胞表面的標(biāo)志物進(jìn)行識(shí)別，將金納米粒子標(biāo)記在細(xì)胞表面。最后，通過LDI對分子探針進(jìn)行直接解吸附離子化，完成檢測。由于單個(gè)金納米粒子上可標(biāo)記多個(gè)分子探針，所以，同一個(gè)細(xì)胞表面的標(biāo)志物可對應(yīng)多個(gè)探針，從而顯著放大檢測信號(hào)，提高檢測靈敏度。

相比于Nano-ESI而言，LDI具有成像分析的優(yōu)勢。然而，由于存在光學(xué)衍射極限，LDI的成像分辨率普遍在μm級別。這樣的空間分辨率對于體積較小的動(dòng)物細(xì)胞而言略顯不足。經(jīng)過改進(jìn)后，部分LDI成像系統(tǒng)的空間分辨率能夠到達(dá)102 nm級別[30，31]。但這些裝置系統(tǒng)在結(jié)構(gòu)上較為復(fù)雜，實(shí)施難度較大。此外，LDI需要待測分子能夠吸收所用波長激光的能量， 這在很大程度上限制了LDI檢測對象的范疇。MALDI通過添加基質(zhì)的方式對這一缺陷進(jìn)行了一定程度的彌補(bǔ)， 基質(zhì)的篩選和優(yōu)化一直是需要考慮的問題。分子探針的使用可間接提高待測分子的檢測靈敏度，但是分子探針的設(shè)計(jì)、合成和標(biāo)記過程具有較大難度。

2.3 基于SIMS的單細(xì)胞質(zhì)譜分析法

SIMS是一種具有高靈敏度和高空間分辨率的表面分析技術(shù)[42，43]。它使用高能一次離子束轟擊樣品表面，從樣品表面濺射出帶電的二次離子，實(shí)現(xiàn)樣品表面待測組分的離子化。同LDI相比，SIMS的一次離子束沒有光聚焦過程中的衍射問題，能夠聚焦于更小的點(diǎn)。因此，SIMS具有更高的空間分辨率，可較容易地達(dá)到nm級別。此外，SIMS是目前唯一能夠?qū)崿F(xiàn)三維成像的質(zhì)譜成像方法，在生命科學(xué)領(lǐng)域，尤其是單細(xì)胞成像分析方面有重要的應(yīng)用價(jià)值[44]。然而，SIMS是一種較“硬”的離子源，高能量的一次離子束會(huì)產(chǎn)生許多碎片離子，導(dǎo)致對目標(biāo)分子的分析變得困難。這使得SIMS在單細(xì)胞生物大分子的分析應(yīng)用上受到了較大限制。發(fā)展更“軟”的SIMS離子源，實(shí)現(xiàn)更大分子量細(xì)胞代謝物的高效離子化是基于SIMS的單細(xì)胞分析方法的重要研究方向。此外，高分辨和三維成像是SIMS的特色， 發(fā)展更高分辨率的二維和三維成像方法也是SIMS的前沿研究領(lǐng)域。

Tian等[45]使用C+60離子束對氨芐西林（Ampicillin， AMP）和四環(huán)素（Tetracycline， TET）兩種抗生素在大腸桿菌內(nèi)的分布進(jìn)行了亞細(xì)胞水平的成像分析。C+60的使用保證了AMP和TET在離子化過程中能夠高效地產(chǎn)生分子離子，從而實(shí)現(xiàn)對二者的高靈敏度定性和定量分析。通過逐層剝蝕，實(shí)現(xiàn)了對大腸桿菌內(nèi)兩種抗生素的三維成像分析，橫向分辨率達(dá)300 nm（圖7），深度分辨率達(dá)200 nm。

在前處理過程中，樣品表面可能會(huì)沉積一些污染物，對檢測信號(hào)帶來影響。Leo等[46]利用C+60離子束對樣品表面的污染物進(jìn)行清理，采用25 keV Bi+3離子束對神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的3種H2S合成酶進(jìn)行了成像分析（圖8）。結(jié)果表明，未經(jīng)C+60離子束進(jìn)行表面處理的樣品無法獲得可識(shí)別的成像圖，幾乎全為背景噪音;經(jīng)過C+60離子束進(jìn)行表面處理的樣品可順利獲得細(xì)胞中H2S合成酶的成像圖，成像分辨率達(dá)195 nm。成像結(jié)果與免疫印記分析和熒光共聚焦顯微鏡成像結(jié)果相吻合。

氣體團(tuán)簇離子束（Gas cluster ion beams， GCIB）技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展，如Ar+n和（CO2）+n [47，48]，使得SIMS在生物組織成像領(lǐng)域的應(yīng)用研究得到了進(jìn)一步拓展。這類離子束具有更為柔和的離子化過程，產(chǎn)生的離子碎片更少，能夠?qū)崿F(xiàn)更高分子量生物分子的離子化。

Mohammadi等[49]用40 keV （CO2）+6000離子束對大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞（PC12）進(jìn)行成像分析，研究了順鉑抗癌藥物對PC12細(xì)胞新陳代謝過程的影響。結(jié)果顯示，順鉑藥物通過改變PC12細(xì)胞表面脂質(zhì)組成對其胞吐行為及相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)過程產(chǎn)生影響。Angerer等[50]使用40 keV （CO2）+4000離子束對Phagocata gracilis蠕蟲體內(nèi)的脂質(zhì)分布進(jìn)行了亞細(xì)胞水平的成像分析。 （CO2）+4000離子束同時(shí)產(chǎn)生了脂質(zhì)分子的分子離子和碎片離子，可直接用于脂質(zhì)分子的定性識(shí)別，無需進(jìn)一步使用二級碎裂進(jìn)行定性分析。

Pareek等[51]使用70 keV （CO2）+n （n>10000）離子束對Hela細(xì)胞中的嘌呤合成代謝區(qū)室進(jìn)行了3D成像分析（圖9），空間分辨率達(dá)到了亞微米級別。結(jié)果表明，細(xì)胞內(nèi)負(fù)責(zé)嘌呤合成的嘌呤體是由9種酶組成的復(fù)合體結(jié)構(gòu)。嘌呤體通過控制嘌呤的合成調(diào)控嘌呤核苷酸的合成代謝，進(jìn)而對相關(guān)代謝通路產(chǎn)生影響，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)單磷酸腺苷和單磷酸鳥苷的比值。該研究充分展現(xiàn)了GCIB-SIMS成像分析技術(shù)在復(fù)雜生物現(xiàn)象分析研究中的重要應(yīng)用前景。

Sheng等[52]將SIMS與穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了對蛋白質(zhì)等生物大分子的高分辨二維和三維成像分析。使用含有15N-精氨酸和15N-賴氨酸的培養(yǎng)基對Hela細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)一段時(shí)間后，通過SIMS-TOF對細(xì)胞中15N標(biāo)記的氨基酸和磷脂進(jìn)行成像分析。該成像結(jié)果反映了細(xì)胞中新合成的蛋白質(zhì)和磷脂的分布情況。在細(xì)胞分裂過程中，卵磷脂在分裂區(qū)具有較高濃度的分布，而新合成的蛋白質(zhì)則較少分布在此區(qū)域。該方法對于一些細(xì)胞代謝行為及相關(guān)代謝產(chǎn)物分布的研究具有借鑒意義。

Huang等[53]在高通量單細(xì)胞樣品制備技術(shù)上進(jìn)行了探索，建立了一種快速、高效的單細(xì)胞分選（Single-cell patterning， SCP）樣品制備方法。該方法將聚二甲基硅氧烷材料微加工技術(shù)與細(xì)胞離心捕獲技術(shù)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞陣列的制備。細(xì)胞在陣列位點(diǎn)上的占有率>90%，其中，單細(xì)胞占有率>97%。將該細(xì)胞陣列制備方法與SIMS-TOF相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞樣品的高通量制備和分析，并成功地應(yīng)用于藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡早期表型變化研究。

Hua等[54]使用SIMS-TOF的延遲提取離子模式對銀納米離子（AgNPs）處理過的細(xì)胞表面脂質(zhì)變化過程進(jìn)行了分析。延遲提取檢測模式的使用使得SIMS-TOF可同時(shí)獲得高質(zhì)量分辨率和高空間分辨率[55]，并且消除了樣品表面形貌變化對檢測的影響[56]。研究表明，經(jīng)過不同濃度AgNPs處理的細(xì)胞在表面脂質(zhì)分布呈現(xiàn)明顯的差別，主要包括膽固醇、甘油單酯和甘油二酯。其中，經(jīng)過高濃度AgNPs處理的細(xì)胞，其表面膽固醇和甘油二酯傾向于分布在細(xì)胞周邊的區(qū)域。該研究為納米粒子和細(xì)胞的相互作用研究提供了參考。

Liu等[57]將SIMS-TOF與共聚焦激光掃描顯微成像技術(shù)聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)了單個(gè)癌細(xì)胞內(nèi)有機(jī)釕復(fù)合物抗癌藥物的成像分析。該方法將共聚焦顯微成像的結(jié)果與質(zhì)譜成像的結(jié)果相結(jié)合，對有機(jī)釕在細(xì)胞內(nèi)的分布情況進(jìn)行了雙重定位，成像結(jié)果更準(zhǔn)確可靠。成像結(jié)果表明，有機(jī)釕復(fù)合物主要聚集在細(xì)胞膜和細(xì)胞核內(nèi)。該方法在有機(jī)金屬藥物研發(fā)和藥理學(xué)研究上具有良好應(yīng)用前景，可實(shí)現(xiàn)多種有機(jī)金屬藥物分子的成像分析。

在單一成像技術(shù)的基礎(chǔ)上，將不同顯微成像技術(shù)所得到的圖像進(jìn)行融合解析，不僅可提高SIMS的成像分辨率，還可更加全面和深入了解許多物理、化學(xué)和生命活動(dòng)過程。Vollnhals等[58]將SIMS的成像數(shù)據(jù)與具有更高空間分辨率的電子顯微鏡（Electron microscope， EM）成像數(shù)據(jù)進(jìn)行了融合解析，考察了兩種數(shù)據(jù)融合策略分別產(chǎn)生的融合效果。結(jié)果表明，使用EM數(shù)據(jù)銳化處理中較為常用的強(qiáng)度-色調(diào)-飽和度處理策略進(jìn)行融合，容易產(chǎn)生嚴(yán)重的圖像偽影;而拉普拉斯金字塔圖像融合處理策略則可更好地解決圖像融合中存在的產(chǎn)生嚴(yán)重偽影的問題，圖像融合結(jié)果更為穩(wěn)定可靠。

Passarelli等[59]在3D SIMS成像技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合高分辨質(zhì)譜，研制出一種用于生物醫(yī)學(xué)成像的3D-OrbiSIMS質(zhì)譜裝置。該裝置將SIMS的高空間分辨率三維成像功能與Orbitrap的高質(zhì)量分辨率相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了亞細(xì)胞水平上內(nèi)源和外源性細(xì)胞代謝物的可視化三維成像分析。在無機(jī)樣品的成像分析中，可使用30 keV Bi+3離子束進(jìn)行離子化，以保證更高的離子化效率和空間分辨率。對于生物樣品的分析，可使用5～20 keV Ar+n（1000

在質(zhì)譜成像技術(shù)中，SIMS能夠?qū)崿F(xiàn)三維成像，并且具有出色 的空間分辨率， 這使得SIMS在單細(xì)胞成像分析上具有不可替代的地位。但是，SIMS的離子化過程仍然存在缺陷。SIM適于進(jìn)行無機(jī)物和元素分析，但是生物分子，尤其是結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的生物分子，以及生物大分子的離子化一直未能取得突破性研究進(jìn)展，Nano-ESI和LDI在該方面表現(xiàn)出較大優(yōu)勢。此外，SIMS的離子化過程需要在高真空條件下進(jìn)行，使活體檢測難以實(shí)施。

3 總結(jié)與展望

細(xì)胞生物學(xué)的不斷發(fā)展對單細(xì)胞分析方法的檢測性能提出了更多和更高的需求。在檢測對象方面，單細(xì)胞多組學(xué)研究的不斷深入，要求更多種類的化合物被檢測到。在檢測性能方面，更多低含量化合物的檢測對分析方法的靈敏度、特異性和基質(zhì)耐受性提出了更大挑戰(zhàn)。為滿足這些應(yīng)用研究日益增長的檢測需求，基于Nano-ESI、LDI和SIMS等的現(xiàn)有單細(xì)胞質(zhì)譜分析方法正在不斷改進(jìn)和完善。目前，這些分析方法的發(fā)展呈現(xiàn)出以下趨勢：

（1）時(shí)空分辨 很多細(xì)胞生物學(xué)機(jī)理的闡釋需要從空間上對代謝物的分布進(jìn)行解析，需要從時(shí)間上對代謝物的變化進(jìn)行監(jiān)測。如代謝物在細(xì)胞中的合成部位及發(fā)揮作用部位。在不同的細(xì)胞周期內(nèi)，該代謝物在相關(guān)部位的含量是否變化等，單純單細(xì)胞水平的分析方法無法實(shí)現(xiàn)這些檢測需求。目前，基于SIMS的成像分析方法在高空間分辨應(yīng)用研究方面取得了一些階段性進(jìn)展。未來， 在時(shí)間分辨方面，單細(xì)胞質(zhì)譜分析方法還有很大發(fā)展空間。

（2）定量分析 單純定性或半定量分析已經(jīng)無法滿足細(xì)胞生物學(xué)越發(fā)深入的研究需求。相關(guān)研究工作迫切需要獲得目標(biāo)代謝物的量化數(shù)據(jù)。目前，通過添加同位素內(nèi)標(biāo)等方式，研究者已實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞中一些代謝物的定量分析。未來，在定量分析的準(zhǔn)確度和精密度方面，還需進(jìn)一步發(fā)展。

（3）組學(xué)研究 隨著單細(xì)胞分析方法檢測性能的不斷提升，單細(xì)胞中所能檢測到的物質(zhì)種類不斷增加。根據(jù)物質(zhì)種類的不同，目前已形成了單細(xì)胞多組學(xué)研究的趨勢，如蛋白質(zhì)組學(xué)、多肽組學(xué)、糖組學(xué)、代謝組學(xué)和金屬組學(xué)等。未來，各個(gè)組學(xué)的研究工作將不斷深化，不僅局限于測量問題上，而是深入到細(xì)胞生物學(xué)的重大科學(xué)問題，解決基礎(chǔ)科研和應(yīng)用研究中的實(shí)際問題。

近年來，單細(xì)胞質(zhì)譜分析方法的研究取得較大進(jìn)展。在本文重點(diǎn)討論的研究工作之外，還有很多出色的方法技術(shù)。如微流控芯片技術(shù)，可在μm尺度的芯片上，完成樣品的制備、反應(yīng)、分離和離子化等操作，具有微型化、集成化以及所需試劑耗材量小的優(yōu)點(diǎn)。相比其它單細(xì)胞前處理技術(shù)， 微流控芯片技術(shù)具有更高的通量，被認(rèn)為是最具有發(fā)展前景的單細(xì)胞樣品前處理技術(shù)[60]。此外，電感耦合等離子體質(zhì)譜（Inductively coupled plasma mass spectrometry， ICP-MS）近年在單細(xì)胞分析上也有較多的應(yīng)用[61]。該技術(shù)速度快，靈敏度高，樣品制備和進(jìn)樣過程較為簡單，在單細(xì)胞金屬組學(xué)的研究工作中具有較大潛力。

歷經(jīng)十幾年的發(fā)展，單細(xì)胞質(zhì)譜分析方法已經(jīng)取得了較大進(jìn)展，但面對細(xì)胞生物學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)等研究的需求，單細(xì)胞質(zhì)譜分析方法仍然有很多亟待解決的問題，這也正是該方法未來發(fā)展的方向。

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Recent Advances in Single Cell Analysis Methods Based on Mass Spectrometry

WANG Ju-Duo1，2， SONG Jia-Feng1， LI Chang2， DAI Xin-Hua2， FANG Xiang2，GONG Xiao-Yun*2， YE Zi-Hong*1

1（College of Life Sciences， China Jiliang University， Hangzhou 310018， China）

2（Center for Advanced Measurement Science， National Institute of Metrology， Beijing 100029， China）

Abstract The heterogeneity among individual cells is of great importance for organisms to achieve different biological functions. Investigations deep into the mechanism of some biological phenomena rely on the analysis of the chemical compositions of single cells. Unfortunately， the successful analysis of single cells is technically difficult to achieve due to the complex composition of single cells， the very limited amount of materials in single cells and the huge difference among different metabolites in their concentrations. Mass spectrometry （MS） has been widely used in single cell analysis in recent years due to its high sensitivity， high specificity and capability for structure identification. Methods based on MS have been developed for the analysis of different metabolites in single cells. From the perspective of ionization techniques， there are mainly three single cell analysis methods， including nano-electrospray ionization （Nano-ESI） based method， laser desorption ionization （LDI） based method and secondary ion MS （SIMS） based method. This review summarizes the up-to-date developments of these methods and their future trends.

Keywords Mass spectrometry; Single cell analysis; Ionization; Nano-electrospray ionization; Laser desorption ionization; Secondary ion mass spectrometry; Review

（Received 12 March 2020; accepted 9 June 2020）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos.21605135， 21927812）.

2020-03-12收稿; 2020-06-09接受

本文系國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（Nos. 21605135， 21927812）資助

* E-mail： gxy@nim.ac.cn; zhye@cjlu.edu.cn