毒害艾美耳球蟲配子體抗原EnGAM22單克隆抗體的制備與鑒定

蔡為民，李文靜，王樂樂，蘇丁澤陽，朱 玉，劉丹丹，許金俊，陶建平

(揚州大學獸醫(yī)學院，江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創(chuàng)新中心，揚州 225009)

雞球蟲病是由艾美耳球蟲(Eimeria)寄生于雞腸道引起的一種寄生性原蟲病，給全球養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經濟損失[1-2]。雞球蟲生活史包括裂殖生殖、配子生殖和孢子生殖三個階段，孢子生殖形成的孢子化卵囊被雞食入后，在腸道內釋放子孢子，子孢子侵入腸黏膜上皮細胞進行裂殖生殖，接著進行配子生殖，最后形成卵囊。卵囊隨糞便排出體外，在外界環(huán)境中進行孢子生殖，形成具有感染性的孢子化卵囊[3]。因此，卵囊是球蟲在宿主間傳播的重要形式。球蟲卵囊有一堅韌的卵囊壁，主要由來自大配子成壁體上的配子體蛋白[3-4]。毒害艾美耳球蟲配子體抗原EnGAM22是卵囊壁的前體蛋白，在本實驗室前期研究中對該抗原基因進行了克隆與原核表達，重組蛋白免疫雞后對毒害艾美耳球蟲(Eimerianecatrix)感染有一定的免疫保護力[5]。但該蛋白如何參與卵囊壁的形成尚不清楚。單克隆抗體具有高特異性和靈敏性，與免疫熒光、免疫電鏡等技術結合可將目的抗原在蟲體中定位，是研究寄生蟲蟲體細微結構和發(fā)育分子機制的重要檢測工具，對寄生蟲病的免疫治療與機理研究具有重大意義[6]。迄今，關于雞球蟲配子體蛋白單克隆抗體的研究較少，Krücken等[7]和Wiedmer等[8]研究發(fā)現針對EtGAM56單克隆抗體E2E5可以干擾柔嫩艾美耳球蟲的發(fā)育，但有關E.necatrix單克隆抗體尚未見報道，因此本研究以原核表達的重組配子體抗原rEnGAM22免疫BALB/c小鼠制備單克隆抗體，并應用單抗進行天然蛋白的蟲體定位。研究結果可為球蟲卵囊壁形成機制研究提供工具，也為雞球蟲多肽和新型疫苗分子的設計及診斷試劑的開發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株、細胞、蟲株

重組菌株pET-28a(+)-Engam22/BL21由本實驗室構建保存；小鼠骨髓瘤細胞SP2/0由揚州大學獸醫(yī)學院張小榮老師惠贈；毒害艾美耳球蟲(Eimerianecatrix)、柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella)、堆型艾美耳球蟲(E.acervulina)、巨型艾美耳球蟲(E.maxima)均由揚州大學獸醫(yī)學院寄生蟲病學教研室建株并定期傳代保種。

1.2 實驗動物

BALB/c與ICR小鼠，購自揚州大學比較醫(yī)學中心。黃羽雞，購自江蘇省海門市京海肉雞集團公司，雛雞孵出后即運回實驗室，飼養(yǎng)在無球蟲卵囊污染的籠具和環(huán)境中，飼喂不添加抗球蟲藥物的全價飼料，雞自由采食。

1.3 主要試劑

High Affinity Ni-Charged Resin親和純化層析柱、Protein G純化介質購自金斯瑞生物科技公司；HRP標記羊抗鼠IgG購自BBI公司；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(6×)、TMB顯色液均購自碧云天生物技術公司；QuickAntibody-Mouse 3 W、腹水專用佐劑和小鼠單抗Ig類亞型鑒定用酶標二抗均購自北京博奧龍免疫技術有限公司；PEG1500購自Sigma公司；硝酸纖維素膜購自默克公司；ECL化學發(fā)光試劑購自Tanon公司；FITC標記羊抗鼠IgG購自KPL公司；小牛血清白蛋白(BSA)購自上海生工生物有限公司；Brofdrod蛋白定量試劑盒購自TaKaRa公司。鼠抗rEnGAM22多克隆抗體由本實驗室制備保存。

1.4 重組蛋白的誘導表達與純化及鑒定

參照劉丹丹[5]的方法大量制備rEnGAM22蛋白，并經Western blot鑒定其與抗毒害艾美耳球蟲康復血清反應特異性。重組蛋白經不同濃度尿素透析復性純化后，存于-80 ℃冰箱備用。

1.5 間接ELISA檢測方法的建立

采用方陣滴定法確定重組抗原rEnGAM22的最佳包被濃度，并測定小鼠血清抗體效價。將重組抗原rEnGAM22用碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)從4 μg·mL-1倍比稀釋到0.125 μg·mL-1包被酶標板，4 ℃過夜后用1% BSA封閉液封閉；用PBS將待檢血清以及陰性血清從1∶200倍比稀釋到1∶25 600，二抗為HRP標記的羊抗鼠IgG，用PBS按照1∶20 000倍稀釋(說明書推薦倍數)；TMB顯色液37 ℃避光作用15 min，2 mol·L-1H2SO4終止反應，用酶標儀檢測OD450 nm值。當待檢血清OD450 nm值/陰性血清OD450 nm值≥2.1(即P/N ≥ 2.1)，判定為陽性。選擇小鼠待檢血清孔OD450 nm值接近于1.0且P/N值最大時，待檢孔的抗原包被濃度為最佳包被濃度[9]。

1.6 動物免疫與單抗制備

取重組抗原rEnGAM22與Quick Antibody-Mouse 3W免疫佐劑1∶1混合后，免疫3只BALB/c小鼠，20 μg·只-1，100 μL·只-1，腿部肌內注射；首免后第二周進行第二次免疫，第三周進行眼眶后靜脈叢采血，建立ELISA方法并檢測小鼠血清抗體效價。效價合格后加強免疫，隨后第3天取小鼠脾制備脾細胞，參照馬琰等[10]的方法將骨髓瘤細胞與脾細胞按照1∶10混合后加入PEG1500誘導細胞融合；用建立的ELISA方法進行3次陽性雜交瘤細胞的篩選，用有限稀釋法對陽性雜交瘤細胞進行4次亞克隆，最終獲得能穩(wěn)定分泌特異性抗體的雜交瘤細胞。將稀釋好的1×106個雜交瘤細胞腹腔注射10周齡提前致敏的BALB/c小鼠，接種后第7天小鼠腹圍變大，行動遲緩，用無菌注射器針頭抽取小鼠腹水，用Protein G親和層析柱純化小鼠腹水單抗。

1.7 單克隆抗體效價測定以及亞型鑒定

用建立的ELISA方法進行雜交瘤細胞上清以及小鼠腹水單抗效價檢測。設置陰、陽性小鼠血清對照孔，雜交瘤細胞上清用PBS從1∶100開始倍比稀釋，腹水單抗首孔用PBS從1∶1 000開始倍比稀釋。單克隆抗體的亞型鑒定選用北京博奧龍免疫技術有限公司酶標二抗即用套裝，操作按說明書進行。

1.8 單克隆抗體的特異性鑒定

1.8.1 雞球蟲天然配子體蛋白提取物的制備 將毒害艾美耳球蟲(2×104)、柔嫩艾美耳球蟲(2×104)、堆型艾美耳球蟲(1×105)、巨型艾美耳球蟲(5×104)孢子化卵囊分別經嗉囊接種30日齡無球蟲感染的黃羽雞，分別在感染后卵囊出現的前5 h，每隔1 h剖殺感染球蟲的雞，打開腸腔，刮取腸黏膜涂片，用生物顯微鏡(10×40倍)觀察小腸或盲腸中配子體的數量，直至出現大量配子體時，剖殺全部試驗雞，取出腸道，剖開腸腔后棄內容物，用預冷PBS沖洗腸道黏膜，用手術刀片刮取腸黏膜。將腸黏膜在冰浴中超聲裂解(功率30%，超聲2 s，間隙3 s，30 min)，用Broadford蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，分裝保存-80 ℃冰箱備用。

1.8.2 特異性鑒定 將重組抗原rEnGAM22，毒害艾美耳球蟲、柔嫩艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲、堆型艾美耳球蟲天然配子體蛋白提取物加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液煮沸10 min后離心，取上清進行SDS-PAGE電泳；轉印到硝酸纖維素膜上，轉印結束后置于含30 g·L-1BSA封閉液中4 ℃過夜；雜交瘤細胞上清原液為一抗，室溫孵育50 min；二抗為HRP標記的羊抗鼠IgG，用30 g·L-1BSA封閉液按1∶25 000倍稀釋(說明書推薦倍數)，室溫孵育40 min；ECL顯色，Tanon5200全自動化學發(fā)光成像分析系統觀察結果并掃描拍照。

1.9 EnGAM22蛋白在蟲體中的定位

雛雞感染毒害艾美耳球蟲144和156 h后分別撲殺，取盲腸黏膜組織涂布于載玻片上，自然干燥后用預冷的甲醇作用10 min；隨后用0.1% Triton X室溫作用10 min，100 g·L-1山羊血清封閉1 h；一抗為雜交瘤細胞上清，37 ℃孵育1 h；二抗為FITC標記的羊抗鼠IgG，用100 g·L-1山羊血清按1∶100倍稀釋(說明書推薦倍數)，37 ℃孵育1 h；滴加抗熒光淬滅液，封片，熒光顯微鏡觀察結果。

2 結 果

2.1 獲得并鑒定重組抗原rEnGAM22

純化復性后的重組抗原rEnGAM22在約29 ku處有一單一條帶(圖1A)。經Western blot分析重組抗原rEnGAM22在29 ku處能與抗毒害艾美耳球蟲康復血清發(fā)生特異性反應(圖1B)，而組氨酸標簽蛋白未發(fā)生反應。經過透析復性濃縮后，重組抗原濃度為1.8 g·L-1。

M.蛋白質相對分子質量標準；1.rEnGAM22蛋白；2.組氨酸標簽蛋白；3.rEnGAM22蛋白

2.2 間接ELISA方法測定免疫小鼠血清抗體效價

間接ELISA方陣滴定結果表明，當重組抗原質量濃度為0.125 μg·mL-1，血清稀釋度為1∶25 600時，陽性血清OD450 nm值最接近1.0，且P/N 值最大，確定重組抗原rEnGAM22的最佳包被濃度為0.125 μg·mL-1，小鼠血清抗體效價均達到1∶10 000以上，加強免疫第3 天取小鼠脾制備脾細胞，進行細胞融合。

2.3 獲得穩(wěn)定的陽性雜交瘤細胞株

待融合細胞長至底面積的1/3時，用建立好的ELISA方法進行陽性雜交瘤細胞的篩選并及時對陽性雜交瘤細胞進行亞克隆，4次亞克隆之后獲得兩株能穩(wěn)定分泌特異性抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為2F3和3D3。將雜交瘤細胞連續(xù)傳代并收集細胞上清，用間接ELISA方法檢測細胞上清抗體效價，結果表明復蘇后的雜交瘤細胞仍能穩(wěn)定分泌抗體，說明雜交瘤細胞穩(wěn)定性較好。

2.4 腹水的純化

采用Protein G親和層析純化法純化小鼠腹水，純化后的腹水單抗均可見1條大小為50 ku的重鏈以及1條大小為25 ku的輕鏈，未見其他雜帶，表明腹水單抗純化效果較好(圖2)。

M.蛋白質相對分子質量標準；1.純化后2F3腹水單抗；2.純化后3D3腹水單抗

2.5 單克隆抗體效價測定以及亞類鑒定

將純化的重組抗原rEnGAM22包被酶標板，測定雜交瘤細胞培養(yǎng)上清、腹水效價以及鑒定抗體亞類。腹水單抗效價明顯高于細胞上清效價，單抗2F3和3D3亞型分別為IgG2a和IgG2b(表1)。

表1 單抗的效價和亞類鑒定

2.6 球蟲天然配子體蛋白提取物的濃度測定及定量

用Broadford蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，毒害艾美耳球蟲天然配子體蛋白提取物濃度為1.69 g·L-1，柔嫩艾美耳球蟲為1.68 g·L-1，堆型艾美耳球蟲為2.02 g·L-1，巨型艾美耳球蟲為1.47 g·L-1。

2.7 單克隆抗體的特異性鑒定

2.7.1 對重組抗原進行特異性識別 Western blot結果顯示，單抗2F3和3D3均能特異性識別重組抗原rEnGAM22，大小在29 ku左右，而不與組氨酸標簽蛋白發(fā)生特異性反應(圖3)。

M.蛋白質相對分子質量標準；1.重組抗原rEnGAM22；2.組氨酸標簽蛋白

2.7.2 對毒害艾美耳球蟲天然配子體蛋白特異性識別 Western blot結果顯示，單抗2F3和3D3均能特異性識別毒害艾美耳球蟲配子體約37 ku大小的天然目的蛋白(圖4A、B)，而鼠抗rEnGAM22多抗識別的天然目的蛋白條帶大小在35～37 ku之間(圖4C)，表明單抗2F3和3D3能特異性識別蟲體中天然的rEnGAM22抗原。

M.蛋白質相對分子質量標準；1.配子體蛋白提取物

2.7.3 對異種雞球蟲天然配子體蛋白特異性識別 Western blot結果顯示，單抗2F3和3D3均不能識別柔嫩、堆型、巨型艾美耳球蟲天然配子體蛋白(圖5A、B)，而用鼠抗rEnGAM22多抗檢測時，在柔嫩、堆型、巨型艾美耳球蟲配子體蛋白提取物中均出現小于17 ku的非特異性條帶(圖5C)，表明單抗2F3和3D3的特異性較鼠抗rEnGAM22多抗要好。

M.蛋白質相對分子質量標準；1.柔嫩艾美耳球蟲；2.堆型艾美耳球蟲；3.巨型艾美耳球蟲

2.8 EnGAM22蛋白在毒害艾美耳球蟲蟲體中定位

以兩株單抗為一抗，對配子體蛋白EnGAM22進行蟲體內定位(圖6)。結果顯示，配子體蛋白EnGAM22定位在大配子體的成壁體與卵囊的卵囊壁(圖6h～k)，未出現在第三代裂殖子(圖6g)，表明EnGAM22蛋白參與卵囊壁的形成。

a～f.光鏡下的第三代裂殖子(MZ)、卵囊(O)、配子體(GAM)；g～l.免疫熒光定位結果；m～r.蟲體自發(fā)熒光。g、h、i.McAb 2F3；j.McAb 3D3；k.鼠抗rEnGAM22多抗；l.小鼠陰性血清

3 討 論

高純度的免疫原是制備單克隆抗體的關鍵[11]，天然蛋白結構復雜[12]，難以達到較高純度，而原核表達的重組抗原易獲得且表達量和純度較高，因此本研究選擇用重組抗原rEnGAM22作為免疫原制備單克隆抗體。pET-28a(+)原核表達載體中組氨酸標簽蛋白雖然為小分子量多肽，但可刺激機體產生抗組氨酸標簽蛋白的抗體[13]。為此，在本研究中篩選第一次陽性雜交瘤細胞時采用平行對照，即將重組抗原rEnGAM22以及組氨酸標簽蛋白同時作為檢測原，用建立的間接ELISA方法篩選雜交瘤細胞，而且在單克隆抗體的特異性鑒定中將組氨酸標簽蛋白作為對照進行單克隆抗體的特異性驗證，以確保準確篩選出分泌特異性抗體的陽性雜交瘤細胞。結果成功制備了兩株抗配子體抗原EnGAM22單克隆抗體2F3和3D3，亞型分別為IgG2a、IgG2b，特異性強，純化后腹水效價分別為1∶256 000、1∶64 000。

用單抗2F3和3D3以及鼠抗rEnGAM22多抗對雞球蟲配子體蛋白提取物進行Western blot檢測時，兩株單抗在毒害艾美耳球蟲配子體蛋白提取物中僅檢測到一大小為37 ku的特異性條帶，在柔嫩、堆型與巨型艾美耳球蟲配子體蛋白提取物中未檢出任何條帶，而鼠抗rEnGAM22多抗在毒害艾美耳球蟲配子體蛋白提取物中檢測到大小為35～37 ku的3條帶，在柔嫩、堆型與巨型艾美耳球蟲配子體蛋白提取物中檢到小于17 ku的非特異條帶，這一結果表明單抗2F3和3D3的特異性較鼠抗rEnGAM22多抗要強。此外，EnGAM22蛋白按其基因序列推導的理論分子量為21.38 ku[14]，但用單抗2F3和3D3檢測毒害艾美耳球蟲配子體蛋白提取物，檢測到的EnGAM22天然蛋白分子量為37 ku，這一現象同樣見于巨型艾美耳球蟲配子體蛋白EmGAM82和EmGAM56、以及柔嫩艾美耳球蟲配子體蛋白EtGAM22，究其原因可能是球蟲配子體蛋白中存在不尋常氨基酸組成所致[15]。

球蟲卵囊壁為一雙層結構，主要有蛋白質和脂類組成，在蛋白質分子間有二酪氨酸鍵交聯，故卵囊壁可自發(fā)藍色熒光[16]。球蟲配子體蛋白是卵囊壁的前體蛋白，在配子生殖階段特異性表達[3]。Wiedmer等[17]用抗大鼠E.nieschulzi大配子體的單克隆抗體鑒定出一種富含酪氨酸的糖蛋白EnGAM82，并定位于Ⅱ型成壁體上。本研究用單抗2F3和3D3對配子體蛋白EnGAM22進行蟲體內定位時，在第三代裂殖子中未檢測出蛋白，而在發(fā)育中的配子體和卵囊中均檢測出蛋白，且蛋白均定位在配子體的成壁體和卵囊壁上，與用鼠抗rEnGAM22多抗定位結果一致，也與劉丹丹等[14]的研究結果相一致，顯示EnGAM22蛋白參與卵囊壁的形成，這也表明單抗2F3和3D3可用作研究卵囊壁形成機制的分子工具。

單克隆抗體與多克隆抗體相比，具有無限量生產、高度的特異性和均一性等優(yōu)點，已被廣泛應用于球蟲新基因和新抗原篩選、發(fā)育過程與致病機理探索、疾病診斷和預防治療等方面的研究[18]。Wallach等[19]用抗配子體蛋白EmGAM56的單抗被動免疫雛雞，可對巨型艾美耳球蟲感染產生一定免疫保護力，與非免疫對照組相比，免疫雞的卵囊產量減少40%～50%。Karim等[20]用柔嫩艾美耳球蟲卵囊壁蛋白制備的單抗(C11B9F3)免疫的雛雞，與非免疫對照組相比，免疫雞感染同種球蟲—柔嫩艾美耳球蟲的卵囊產量降低42%～54%，感染異種球蟲—巨型艾美耳球蟲的卵囊產量降低35%。本研究研制的單抗2F3和3D3是否具有被動免疫保護作用有待進一步研究。

4 結 論

成功制備了兩株抗毒害艾美耳球蟲配子體抗原EnGAM22單克隆抗體2F3和3D3，其亞型分別為IgG2a和IgG2b，特異性強；用單抗免疫熒光定位結果顯示，EnGAM22蛋白參與卵囊壁的形成，表明單抗2F3和3D3可用作研究卵囊壁形成機制的分子工具。