毒害與巨型及毒害與柔嫩艾美耳球蟲間在免疫方面的相互影響

李建梅，劉 梅，戴亞斌，陶建平

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 家禽研究所，江蘇 揚(yáng)州 225125；2.揚(yáng)州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

雞球蟲病是一種危害嚴(yán)重的雞腸道寄生蟲病，對世界范圍的養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[1]。目前，雞球蟲病病原主要有堆型艾美耳球蟲(Eimeria acervulina)、布氏艾美耳球蟲(E.brunetti)、巨型艾美耳球蟲(E.maxima)、緩艾美耳球蟲(E.mitis)、毒害艾美耳球蟲(E.necatrix)、早熟艾美耳球蟲(E.praecox)和柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella)7 種，其中柔嫩艾美耳球蟲和毒害艾美耳球蟲的致病性最強(qiáng)，堆型艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲和布氏艾美耳球蟲具有中等強(qiáng)度的致病性[2-3]。在自然情況下，雞球蟲病往往呈多種球蟲混合感染[4]。傳統(tǒng)治療雞球蟲病的方法主要依靠磺胺類化學(xué)藥物，但隨著人們對肉蛋中藥物殘留問題的日益關(guān)注以及雞球蟲耐藥蟲株的不斷出現(xiàn)，不少抗球蟲藥在國際上已開始列為禁用藥，使得藥物防治面臨困境，這就迫使人們將目光轉(zhuǎn)向免疫預(yù)防等替代途徑來防控雞球蟲病[5]。目前，臨床上使用的雞球蟲病疫苗多數(shù)是由數(shù)種雞球蟲組成的活蟲苗，有些種類在雞腸道內(nèi)的寄生部位相同，如毒害艾美耳球蟲在裂殖生殖階段與巨型艾美耳球蟲寄生部位相同，而在配子生殖階段與柔嫩艾美耳球蟲的寄生部位又相同，這種相同的寄生部位在免疫上是否會(huì)相互影響。為此，本研究探索了毒害與巨型及毒害與柔嫩艾美耳球蟲間在免疫上的相互影響，為今后雞球蟲病的免疫預(yù)防奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 蟲 株 毒害艾美耳球蟲、柔嫩艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲南通株均為田間分離株，由揚(yáng)州大學(xué)寄生蟲教研室分離保存，實(shí)驗(yàn)前均經(jīng)雞體傳代復(fù)壯。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑 蘇禽黃羽肉雞購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所育種中心，出殼后運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，飼養(yǎng)在無球蟲的環(huán)境中，飼喂不含任何抗球蟲藥的全價(jià)飼料。實(shí)驗(yàn)開始前，采用常規(guī)方法鏡檢有無球蟲卵囊，確認(rèn)無球蟲卵囊污染后，方可用于實(shí)驗(yàn)。辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗雞IgG(IgG-HRP)購自HPL 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 挑選體況相近的5 日齡黃羽肉雞132 只，分成11 組，每組12 只。免疫和攻蟲途徑均采用嗉囊接種途徑，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和免疫程序見表1，其中未免疫攻蟲組免疫時(shí)以及陰性對照組免疫和攻蟲時(shí)每次接種1 mL PBS。二免前和攻蟲前每組隨機(jī)取5 只雞，無菌心臟采血1 mL，分離血清，用于檢測其抗球蟲的抗體水平。

表1 實(shí)驗(yàn)分組與免疫程序Table 1 Groups and immunization schedules

1.4 臨床觀察 攻蟲后觀察雞的精神狀態(tài)、飲欲食欲、糞便與發(fā)病情況。攻蟲后第8 d 結(jié)束實(shí)驗(yàn)，以平均增重、死亡率、平均腸道病變記分等作為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)。

1.5 卵囊計(jì)數(shù) 參照文獻(xiàn)[6]的方法，即攻蟲后第6 d 起每12 h 收集各組雞的全部糞便樣品，攪拌后稀釋至1 000 mL，吸取10 個(gè)1 mL 置于小燒杯內(nèi)，加1 mL 次氯酸鈉溶液作用2 h 后，加飽和食鹽水定容至60 mL，先用60 目銅篩過濾，濾液用麥克馬斯特法進(jìn)行卵囊計(jì)數(shù)，計(jì)算出每只雞的總排卵囊量。

1.6 免疫保護(hù)效果評價(jià)指標(biāo)(1)死亡率(%)：死亡雞數(shù)/開始雞數(shù)×100 %；(2)相對增重率(%)：免疫攻蟲組或未免疫攻蟲組雞的平均增重/未免疫未攻蟲組雞的平均增重×100 %。其中：①平均增重1=攻蟲時(shí)重-首次免疫時(shí)體重；②相對增重率1=(實(shí)驗(yàn)組增重/未免疫未攻蟲組增重)×100 %；③平均增重2=宰殺時(shí)重-攻蟲時(shí)重；④相對增重率2=(實(shí)驗(yàn)組增重/未免疫未攻蟲組增重)×100 %；(3)相對卵囊產(chǎn)量：相對卵囊產(chǎn)量=(實(shí)驗(yàn)組排出卵囊數(shù)/未免疫攻蟲組排出卵囊數(shù))×100 %；(4)卵囊減少率：卵囊減少率=(未免疫攻蟲組排卵囊數(shù)-免疫攻蟲組排卵囊數(shù))/未免疫攻蟲組排卵囊數(shù)；(5)病變記分：平均腸道病變記分參照J(rèn)ohnson 和Reid[7]的標(biāo)準(zhǔn)。

1.7 血清抗體水平檢測 采用間接ELISA 法進(jìn)行血清抗體水平檢測，即采用JY92-Ⅱ型超聲波細(xì)胞粉碎儀裂解各球蟲孢子化卵囊，4 ℃12 000 r/min 離心15 min 取上清，獲取純化蛋白，以其為抗原包被96 孔板，加入稀釋后的待檢血清100 μL/孔，37 ℃溫育2 h，以羊抗雞IgG-HRP(1∶1 000)為二抗，OPD底物顯色，利用酶標(biāo)儀測定OD490nm值。

1.8 數(shù)據(jù)處理與分析 利用SPSS 軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行一維方差描述性統(tǒng)計(jì)分析，并用Duncan 氏新復(fù)極差法對組間平均值進(jìn)行多重比較(p<0.05)。

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察結(jié)果

2.1.1 非免疫攻蟲組 各非免疫攻蟲組實(shí)驗(yàn)雞在攻蟲后第4 d 起分別出現(xiàn)臨床癥狀。非免疫攻柔嫩艾美耳球蟲組最先表現(xiàn)出臨床癥狀，排鮮紅色血便，第5 d 血便達(dá)到高峰，第6 d 開始出現(xiàn)死亡，剖檢死亡雞其盲腸外觀腫大呈暗紅色、腸腔內(nèi)充滿紅色血液和脫落的黏膜碎片。

非免疫攻毒害艾美耳球蟲組第5 d 開始排醬油色血便，有的血便周圍有乳白色油狀物，第6 d 開始出現(xiàn)死亡，剖檢死亡雞，發(fā)現(xiàn)整個(gè)小腸段腫大，尤其是卵黃蒂前后，漿膜面可見針尖狀出血點(diǎn)和小白斑，腸壁菲薄呈紅色或粉紅色，腸腔內(nèi)混有較多血凝塊和脫落的腸黏膜。

非免疫攻巨型艾美耳球蟲組也于第5 d 開始出現(xiàn)癥狀，排出典型的棉線樣稀糞，第6 d 開始出現(xiàn)死亡，剖檢死亡雞小腸段出現(xiàn)腫脹、腸內(nèi)容物稀薄呈粘稠狀米黃色、黏膜水腫增厚并伴有少量出血點(diǎn)。

2.1.2 免疫攻蟲組 毒害艾美耳球蟲與巨型艾美耳球蟲混合免疫組，攻毒害艾美耳球蟲后第6 d 開始出現(xiàn)血便，并有2 只雞死亡，而攻巨型艾美耳球蟲組僅出現(xiàn)糞便變?。欢竞Π蓝蛳x與柔嫩艾美耳球蟲混合免疫組，分別攻毒害艾美耳球蟲或柔嫩艾美耳球蟲后均有血便出現(xiàn)，但前者的血便數(shù)明顯多于后者，并且有1 只雞攻毒害艾美耳球蟲后死亡；毒害艾美耳球蟲單獨(dú)免疫組攻蟲后出現(xiàn)的血便數(shù)較柔嫩艾美耳球蟲單獨(dú)免疫組攻蟲后的要多，并且前者有1 只雞在攻毒害艾美耳球蟲后第7 d 死亡；巨型艾美耳球蟲單獨(dú)免疫組攻蟲后糞便只是略顯稀薄，不排血便。

2.2 死亡率和平均腸道病變記分 攻毒害艾美耳球蟲后，毒害艾美耳球蟲與巨型艾美耳球蟲混合免疫組、毒害艾美耳球蟲與柔嫩艾美耳球蟲混合免疫組及毒害艾美耳球蟲單獨(dú)免疫組均出現(xiàn)死亡，但死亡率明顯低于非免疫攻毒害艾美耳球蟲組。同時(shí)，毒害艾美耳球蟲單獨(dú)免疫組死亡率雖低于混合免疫組，但差異不顯著(p>0.05)。非免疫攻毒害艾美耳球蟲組病變記分顯著高于免疫攻蟲組(p<0.05)，其中毒害艾美耳球蟲單獨(dú)免疫組的病變記分高于混合免疫組，但無顯著差異(p>0.05)(表2)，表明混合免疫組對毒害艾美耳球蟲的免疫保護(hù)效果優(yōu)于毒害艾美耳球蟲單獨(dú)免疫組。

攻巨型艾美耳球蟲后，毒害艾美耳球蟲與巨型艾美耳球蟲混合免疫組及巨型艾美耳球蟲單獨(dú)免疫組均未出現(xiàn)死亡。免疫攻蟲組病變記分顯著小于非免疫攻巨型艾美耳球蟲組(p<0.05)，其中巨型艾美耳球蟲單獨(dú)免疫組病變記分為零(表2)，表明巨型艾美耳球蟲單獨(dú)免疫組對巨型艾美耳球蟲的免疫保護(hù)效果優(yōu)于混合免疫組。

攻柔嫩艾美耳球蟲后，毒害艾美耳球蟲與柔嫩艾美耳球蟲混合免疫組及柔嫩艾美耳球蟲單獨(dú)免疫組死亡率均為零。免疫攻蟲組病變記分顯著小于非免疫攻柔嫩艾美耳球蟲組(p<0.05)，其中柔嫩艾美耳球蟲單獨(dú)免疫組病變記分略高于混合免疫組，但無顯著差異(p>0.05)(表2)，表明柔嫩艾美耳球蟲單獨(dú)免疫組對柔嫩艾美耳球蟲的免疫保護(hù)效果與混合免疫組相比差異不大。

2.3 增重情況 免疫后各實(shí)驗(yàn)組平均增重與未免疫未攻蟲組相比無明顯差異(p<0.05)，各免疫組相對增重率均在90 %以上(表3)。

攻毒害艾美耳球蟲后，毒害艾美耳球蟲與巨型艾美耳球蟲混合免疫組、毒害艾美耳球蟲與柔嫩艾美耳球蟲混合免疫組平均增重與毒害艾美耳球蟲單獨(dú)免疫組、未免疫攻毒害艾美耳球蟲組相比差異顯著(p<0.05)，其中毒害艾美耳球蟲與巨型艾美耳球蟲混合免疫組與未免疫未攻蟲組相比差異不顯著(p>0.05)，而毒害艾美耳球蟲與柔嫩艾美耳球蟲混合免疫組及毒害艾美耳球蟲單獨(dú)免疫組與未免疫未攻蟲組相比差異顯著(p<0.05)。毒害艾美耳球蟲單獨(dú)免疫組相對增重率明顯低于混合免疫組，但仍高于未免疫攻毒害艾美耳球蟲組(表3)。表明毒害艾美耳球蟲與巨型艾美耳球蟲混合免疫組對毒害艾美耳球蟲的免疫保護(hù)效果最好，毒害艾美耳球蟲與柔嫩艾美耳球蟲混合免疫組次之，毒害艾美耳球蟲單獨(dú)免疫組最差。

攻巨型艾美耳球蟲后，毒害艾美耳球蟲與巨型艾美耳球蟲混合免疫組、巨型艾美耳球蟲單獨(dú)免疫組平均增重顯著高于未免疫攻巨型艾美耳球蟲組(p<0.05)，而與未免疫未攻蟲組相比差異不顯著(p>0.05)，其相對增重率均在95.00 %以上(表3)。表明混合免疫組對巨型艾美耳球蟲的免疫保護(hù)效果略低于巨型艾美耳球蟲單獨(dú)免疫組。

攻柔嫩艾美耳球蟲后，毒害艾美耳球蟲與柔嫩艾美耳球蟲混合免疫組、柔嫩艾美耳球蟲單獨(dú)免疫組平均增重顯著高于未免疫攻柔嫩艾美耳球蟲組(p<0.05)，而與未免疫未攻蟲組相比差異不顯著(p>0.05)，其相對增重率均在79.00 %左右(表3)。表明混合免疫組和柔嫩艾美耳球蟲單獨(dú)免疫組對柔嫩艾美耳球蟲的免疫保護(hù)效果相當(dāng)。

表2 各實(shí)驗(yàn)組雞病死率、平均腸道病變記分及卵囊產(chǎn)量Table 2 The mortality,mean intestinal lesion score and oocyst production of each group

表3 各實(shí)驗(yàn)組雞增重情況Table 3 Weight gain of each group post-challenge

2.4 卵囊產(chǎn)量、相對卵囊產(chǎn)量與卵囊減少率 除未免疫未攻蟲組外，各實(shí)驗(yàn)組雞均有不同數(shù)量的卵囊排出，其中以未免疫攻巨型艾美耳球蟲組、未免疫攻柔嫩艾美耳球蟲組排出的卵囊數(shù)量最多，而未免疫攻毒害艾美耳球蟲組雞因發(fā)病而在未形成卵囊時(shí)就已經(jīng)大量死亡，存活的雞也由于該球蟲對其腸道造成的嚴(yán)重?fù)p傷而形成卵囊的數(shù)量較少，因而卵囊產(chǎn)量與其它組相比明顯要少，其卵囊產(chǎn)量甚至比毒害艾美耳球蟲單獨(dú)免疫組的要低(表2)。

攻蟲后，除毒害艾美耳球蟲單獨(dú)免疫組外，各免疫組卵囊產(chǎn)量、相對卵囊產(chǎn)量均低于各未免疫攻蟲組。另外，毒害艾美耳球蟲與巨型艾美耳球蟲混合免疫組、毒害艾美耳球蟲與柔嫩艾美耳球蟲混合免疫組及毒害艾美耳球蟲單獨(dú)免疫組攻毒害艾美耳球蟲后卵囊減少率均較低，毒害艾美耳球蟲單獨(dú)免疫組為負(fù)值；毒害艾美耳球蟲與巨型艾美耳球蟲混合免疫組和巨型艾美耳球蟲單獨(dú)免疫組攻巨型艾美耳球蟲后卵囊減少率分別為93 %和100 %；毒害艾美耳球蟲與柔嫩艾美耳球蟲混合免疫組和柔嫩艾美耳球蟲單獨(dú)免疫組攻柔嫩艾美耳球蟲后卵囊減少率分別為89.61 %和82.79 %(表2)。表明混合免疫組對毒害艾美耳球蟲或柔嫩艾美耳球蟲的免疫保護(hù)效果優(yōu)于毒害艾美耳球蟲單獨(dú)免疫組和柔嫩艾美耳球蟲單獨(dú)免疫組，而對巨型艾美耳球蟲的免疫保護(hù)效果低于巨型艾美耳球蟲單獨(dú)免疫組。

2.5 血清抗體水平 采用間接ELISA 法分別測定各實(shí)驗(yàn)組雞一免后和二免后的抗體水平，分析毒害與巨型及毒害與柔嫩艾美耳球蟲間在免疫上的相互影響。

2.5.1 毒害艾美耳球蟲與巨型艾美耳球蟲間的相互影響 一免后混合免疫組與巨型艾美耳球蟲單獨(dú)免疫組間的抗巨型艾美耳球蟲抗體水平無顯著差異(p>0.05)；二免后巨型艾美耳球蟲單獨(dú)免疫組抗體水平顯著高于混合免疫組(p<0.05)(表4)。二免后混合免疫組抗體水平與一免時(shí)相比均有所下降，而巨型艾美耳球蟲單獨(dú)免疫組抗體水平則比一免時(shí)要高。表明毒害艾美耳球蟲干擾了巨型艾美耳球蟲抗體的生成。

表4 毒害艾美耳球蟲對巨型艾美耳球蟲抗體水平的影響Table 4 The immune interaction between E.necatrix and E.maxima

一免后混合免疫組與毒害艾美耳球蟲單獨(dú)免疫組間抗毒害艾美耳球蟲抗體水平差異不顯著(p>0.05)；二免后混合免疫組抗體水平顯著高于毒害艾美耳球蟲單獨(dú)免疫組(p<0.05)(表5)。二免后各免疫組抗體水平較一免時(shí)均有所下降，但混合免疫組抗體水平在一免和二免后均高于毒害艾美耳球蟲單獨(dú)免疫組。表明巨型艾美耳球蟲對毒害艾美耳球蟲抗體的生成存在免疫協(xié)同效應(yīng)。

2.5.2 毒害艾美耳球蟲與柔嫩艾美耳球蟲間的相互影響 一免和二免后混合免疫組與柔嫩艾美耳球蟲單獨(dú)免疫組間抗柔嫩艾美耳球蟲抗體水平差異不顯著(p>0.05)(表6)。二免后各免疫組的抗體水平均增加。表明毒害艾美耳球蟲對柔嫩艾美耳球蟲抗體的生成無干擾。

一免后混合免疫組與毒害艾美耳球蟲單獨(dú)免疫組間抗毒害艾美耳球蟲抗體水平差異不顯著(p>0.05)。二免后混合免疫組抗體水平顯著高于毒害艾美耳球蟲單獨(dú)免疫組(p<0.05)(表7)。二免后毒害艾美耳球蟲單獨(dú)免疫組抗體水平與一免時(shí)相比迅速下降，而混合免疫組一免和二免后的抗體水平變化不大。表明柔嫩艾美耳球蟲對毒害艾美耳球蟲抗體的生成存在免疫協(xié)同效應(yīng)。

表5 巨型艾美耳球蟲對毒害艾美耳球蟲抗體水平的影響Table 5 The immune interaction between E.necatrix and E.maxima

表6 毒害艾美耳球蟲對柔嫩艾美耳球蟲抗體水平的影響Table 6 The immune interaction between E.necatrix and E.tenella

表7 柔嫩艾美耳球蟲對毒害艾美耳球蟲抗體水平的影響Table 7 The immune interaction between E.necatrix and E.tenella

3 討論

本研究結(jié)果顯示毒害艾美耳球蟲與巨型艾美耳球蟲混合免疫對毒害艾美耳球蟲的免疫保護(hù)效果比毒害艾美耳球蟲單獨(dú)免疫好，而對巨型艾美耳球蟲的免疫保護(hù)力則略低于巨型艾美耳球蟲單獨(dú)免疫，但仍具有免疫保護(hù)性；毒害艾美耳球蟲與柔嫩艾美耳球蟲混合免疫對毒害艾美耳球蟲的免疫保護(hù)效果優(yōu)于毒害艾美耳球蟲單獨(dú)免疫，而對柔嫩艾美耳球蟲的免疫保護(hù)力與柔嫩艾美耳球蟲單獨(dú)免疫相比差異不大。原因可能是毒害艾美耳球蟲致病性很強(qiáng)，免疫原性相對較弱，并且裂殖生殖階段與巨型艾美耳球蟲寄生部位相同，二者之間存在一定的競爭關(guān)系，從而對同源攻擊缺乏抵抗力，而柔嫩艾美耳球蟲則是在有性生殖階段與毒害艾美耳球蟲寄生部位相同。

臨床癥狀、平均腸道病變記分、死亡率、增重、卵囊減少率等結(jié)果表明巨型艾美耳球蟲和柔嫩艾美耳球蟲均具有良好的免疫原性，而毒害艾美耳球蟲的免疫原性較差。這與Talebi 等認(rèn)為的巨型艾美耳球蟲是雞體內(nèi)致病性球蟲中免疫原性最強(qiáng)的球蟲之一的結(jié)論相符[8]，同時(shí)也支持陶建平等認(rèn)為的巨型艾美耳球蟲南通株的免疫原性最廣譜，可用作疫苗候選株的結(jié)論[6]。Chapman 等認(rèn)為毒害艾美耳球蟲的免疫原性在雞的7 種球蟲中最弱[9]，本研究也證實(shí)了這一結(jié)論。這一研究結(jié)果表明在雞球蟲的免疫研究中，不同種球蟲的抗原存在差異，同種不同株間的抗原也存在差異，同一個(gè)體的不同發(fā)育階段抗原也不盡相同[10]。

根據(jù)ELISA 檢測結(jié)果顯示毒害艾美耳球蟲單獨(dú)免疫后抗體水平上升較快，但持續(xù)時(shí)間短，很快下降。這與卞國志等認(rèn)為的雛雞口服免疫接種一定劑量毒害艾美耳球蟲孢子化卵囊后可迅速誘導(dǎo)雞體產(chǎn)生特異性免疫力，但免疫保護(hù)力在籠養(yǎng)條件下持續(xù)時(shí)間較短的結(jié)論一致[11]。

迄今為止，很多國內(nèi)外學(xué)者認(rèn)為由T 淋巴細(xì)胞、NK 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫在雞球蟲病的保護(hù)性免疫應(yīng)答中起重要做用[12]，但在球蟲感染期間特異性循環(huán)抗體和sIgA 的出現(xiàn)，以及從雞高免血清中分離出的丙球蛋白可與相應(yīng)球蟲子孢子、成熟裂殖體及配子體發(fā)生特異免疫熒光反應(yīng)，提示體液免疫在抗球蟲免疫研究中也發(fā)揮著十分重要的作用[13]。同時(shí)雞球蟲免疫血清還可作為一種有用的診斷工具來確定艾美耳球蟲在雞群中或單個(gè)雞中的存在情況，或是用于對雞球蟲疫苗免疫程序的監(jiān)測[14]。因此，本研究利用ELISA 法監(jiān)測各個(gè)艾美耳球蟲抗體與相應(yīng)抗原之間的免疫應(yīng)答效應(yīng)，但發(fā)現(xiàn)免疫雞卵囊排出量與抗體水平之間缺乏聯(lián)系，這一研究結(jié)果與Talebi 等的研究結(jié)果相一致[8]。

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